Tarmbakterierne kan påvirke flere fysiologiske processer hos insektværter. Forberedelse og vedligeholdelse af axeniske larver er et kraftfuldt værktøj til at studere tarmbakteriens funktioner. De vigtigste fordele ved denne protokol er, at plantevævskultur bruges til at opnå kimfrie blade til bageste axeniske blad, der spiser insekter afledt af overfladesteriliserede æg, og at denne metode ikke er begrænset af kunstige kostvaner.
Denne metode er praktisk og øger synligheden af at opretholde axeniske insekter til fremtidige tarmbakterieundersøgelser, især for ikke-modelinsekter uden veludviklede kunstige kostvaner. Oprethold P.versicolora-befolkningen i et vækstkammer ved 27 grader Celsius og 70% relativ luftfugtighed med et 16 timers lys og otte timers mørk fotoperiode. Placer insekterne i perforerede plastkasser med vippet vådt absorberende papir, og fodre dem friske poppelgrene.
Sprøjt rent vand på absorberende papir for at opretholde fugt, og skift grene hver anden dag. Isoler voksne til oviposition efter hvalp, og fodre dem ømme blade for at få flere æg. Inden for 24 timer skal du samle nylagte æg og placere dem på fugtigt absorberende papir i 60 timer for at forberede axeniske larver.
Forbered MS-medium i et milligram pr. Milliliter alfa-naphthaleneddikesyre eller NAA-stamopløsninger. I en biosikkerhedshætte tilsættes 50 mikroliter NAA-stamopløsningen til 500 ml MS-medium og rystes for at blande godt. Hæld derefter ca. 50 ml pr. Vævskulturbeholder og vent på størkning.
Steriliser skalpeller og tang i en alkohollampeflamme i biosikkerhedshætten. Skær tre til fire centimeter stammesegmenter med apikale knopper eller laterale knopper fra poppelplanter ved ca. en måneds vækst, og indsæt dem i kulturmediet, et eller to stammesegmenter pr. Beholder. Inkuber disse stammesegmenter i et vækstkammer i ca. 30 dage.
Og brug disse bakteriefrie blade til at fodre de axeniske larver. Autoklave petriskåle, pensler, filterpapir, destilleret vand i en petriskål indeholdende LB agar medium. Læg blade med klæbende æg i en petriskål.
Fjern derefter forsigtigt æggene fra bladene ved hjælp af tang og overfør dem til en anden petriskål. Vask disse æg med 75% ethanol i otte minutter. Gentag derefter vasken fire gange med sterilt vand.
Overfør æggene til LB agar medium for at bevare fugt til ruge. Læg petriskålen i et vækstkammer og vent på, at æggene klækkes inden for 24 timer. I en biosikkerhedshætte skal du flise tre stykker vådt filterpapir i en petriskål og placere kimfrie poppelblade på papiret.
Saml larverne og læg dem på bladene. Forsegl petriskålen med parafilm, og inkuber den i et vækstkammer. Skift bladene hver anden dag.
For de konventionelt opdrættede grupper overføres æggene fra bladene til en petriskål, der indeholder fugtigt filterpapir, og fodrer disse larver med kimfrie poppelblade. Vælg tilfældigt tre første, anden og tredje instar larve fra de bakteriefrie og konventionelt opdrættede grupper. Dissekere de tredje instarlarver med steril saks og tang under et stereomikroskop, og saml deres tarme i mikrocentrifugerør.
Saml intakte første og anden instar larver i rør. Tilsæt 100 mikroliter PBS og tre stålkugler til 1,5 milliliter rørene, og slib vævene i homogenater ved hjælp af en perleslagende homogenisator. Der tilsættes 100 mikroliter homogenatet til LB agar medium og plade ved hjælp af en steril glasspredestang.
Inkuber pladerne ved 37 grader Celsius i 24 timer. Observer derefter bakteriekolonierne. Uddrag det samlede DNA af det tidligere opnåede væv ved hjælp af et DNA-ekstraktionssæt, og mål DNA-koncentrationen med et spektrofotometer.
Amplificer det bakterielle 16S rRNA-gen ved hjælp af universelle 16S rRNA-primere med PCR, og opløs reaktionen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Opbevar PCR-produkterne ved fire grader Celsius indtil yderligere analyse. Bland PCR-produkterne med nukleinsyrefarvestof og analyser dem ved hjælp af elektroforese på en 1% agarosegel i 1X TAE-buffer.
Brug 10 mikroliter af en DNA-markør som reference. Overhold gelen med en UV-transilluminator, og kig efter målfragmentet omkring 1.500 basepar. Selvom der ikke blev observeret bakteriekolonier i nogen kimfri gruppe, blev de observeret i alle konventionelt opdrættede grupper, hvilket indikerer, at larver fra steriliserede æg, der blev fodret med vævskulturerede poppelblade, ikke indeholdt bakterier.
De 1.500 basepar PCR-bånd optrådte i alle konventionelt opdrættede grupper. I modsætning hertil blev der ikke observeret noget bånd i de kimfrie grupper eller den negative kontrol, hvilket antydede, at der ikke eksisterede tarmbakterier i axeniske larver. For insektarter med små æg skulle de slags desinfektionsmidler og steriliseringsvarighed optimeres.
Derudover bør endofytter i vævsdyrkultivrede planter være bemærkelsesværdige. Denne protokol giver en ny metode til at opretholde bakteriefrie insekter, som er et praktisk værktøj til at lette insekt-tarmbakterieinteraktionsundersøgelser, især for ikke-modelinsekter uden veludviklede kunstige kostvaner.