Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Research Council Canada, for Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) og for Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Den skematiske gengivelse af proceduren er vist i figur 1.
1. Bioinformatisk identifikation af flagellaglykosyleringsøen (FGIs) i Aeromonas
<ol><li>For at identificere pseAc biosyntetiske klynger i Aeromonas-genomerne skal du bruge tblastnværktøjet fra NCBI-databasen26. Først skal du hente ortologe proteiner til PseC og PseI af A. piscicola AH-3 (identifikationskoder er OCA61126.1 o...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacteria:+sweeter+than+ever.">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Never+say+never+again:+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria.">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li><li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+sugars+sticking+out.">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li><li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferases:+structures,+functions,+and+mechanisms.">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li><li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate-active+enzymes+database+(CAZy)+in+2013.">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).</li><li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine-linked+protein+glycosylation:+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems.">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).</li><li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation.">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems.">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li><li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li><li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin.">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li><li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural,+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori.">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li><li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum.">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li><li>Kov&#225;cs, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction.">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703 (1956).</li><li>Fulton, K. M., Mendoza-Barber&#225;, E., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+(Serotype+O11).">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li><li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology,+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida.">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).</li><li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

Det kritiske tidlige trin i denne metode er identifikationen af regioner, der er involveret i glykosylering af flageller og formodede GT'er, fordi disse enzymer viser høj homologi og er involveret i mange processer. Bioinformatisk analyse af Aeromonas-genomer i offentlige databaser viser, at denne region støder op til den polære flagellaregion 2, som indeholder flagellingenerne i mange stammer og indeholder gener, der er involveret i biosyntesen af pseudaminsyre27. Dette har gjort det ...

Proteinglykosylering er beskrevet i både gram-positive og gram-negative bakterier og består af den kovalente fastgørelse af en glycan til en aminosyresidekæde 1,2. I prokaryoter forekommer denne proces normalt via to store enzymatiske mekanismer: O- og N-glycosylering3. Ved O-glycosylering er glycanen bundet til hydroxylgruppen af en serin (Ser) eller threonin (Thr) rest. Ved N-glycosylering er glycanen bundet til sidekædeamidnitrogenet af en asparagin (Asn) rest inden for tripeptidsekvenserne Asn-X-Ser / Thr, hvor X kunne være enhver aminosyre undtagen prolin.
Glycaner kan vedtage lineære eller forgrenede strukturer og er sammensat af monosaccharider eller polysaccharider kovalent bundet af glycosidbindinger. I prokaryoter viser glycaner normalt mangfoldighed i sukkersammensætning og struktur i forhold til eukaryote glycaner4. Desuden er to forskellige bakterielle glykosyleringsveje, der adskiller sig i, hvordan glycanen samles og overføres til acceptorproteinet, blevet beskrevet: sekventiel og en bloc glycosylering 5,6. Til sekventiel glykosylering opbygges den komplekse glycan direkte på proteinet ved successiv tilsætning af monosaccharider. I en blokglykosylering overføres en færdigmonteret glycan til proteinet fra et lipidbundet oligosaccharcharid ved hjælp af en specialiseret oligosaccharyltransferase (OTase). Begge veje har vist sig at være involveret i N- og O-glycosyleringsprocesser7.
Proteinglykosylering har en rolle i moduleringen af proteiners fysisk-kemiske og biologiske egenskaber. Tilstedeværelsen af en glycan kan påvirke, hvordan proteinet interagerer med dets ligand, hvilket påvirker proteinets biologiske aktivitet, men kan også påvirke proteinstabilitet, opløselighed, modtagelighed for proteolyse, immunogenicitet og mikrobe-værtsinteraktioner 8,9. Imidlertid kan flere glykosyleringsparametre, såsom antallet af glycaner, glycansammensætning, position og fastgørelsesmekanisme, også påvirke proteinfunktion og struktur.
Glycosyltransferaser (GT'er) er de vigtigste enzymer i biosyntesen af komplekse glycaner og glycokonjugater. Disse enzymer katalyserer den glykosidiske bindingsdannelse mellem en sukkermoiety fra et aktiveret donormolekyle og en specifik substratacceptor. GT'er kan anvende både nukleotider og ikke-nukleotider som donormolekyler og målrette mod forskellige substratacceptorer, såsom proteiner, saccharider, nukleinsyrer og lipider10. Derfor er det vigtigt at forstå GT'er på molekylært niveau for at identificere deres virkningsmekanismer og specificitet og muliggør også forståelse af, hvordan sukkersammensætningen af glycaner, der ændrer relevante molekyler, er relateret til patogenicitet. Carbohydrate Active Enzyme Database (CAZy)11 klassificerer GT'er i henhold til deres sekvenshomologi, hvilket giver et prædiktivt værktøj, da den strukturelle fold og virkningsmekanismer i de fleste GT-familier er invariante. Fire grunde gør det imidlertid vanskeligt at forudsige substratspecikaliteten for mange GT'er: 1) der er ikke bestemt noget klart sekvensmotiv, der bestemmer substratspecikaliteten i prokaryoter12, 2) mange GT'er og OTaser viser substratpromiskuitet 13,14, 3) funktionelle GT'er er vanskelige at producere i højt udbytte i rekombinant form, og 4) identifikationen af både donor- og acceptorsubstrater er kompleks. På trods af dette har nylige mutageneseundersøgelser gjort det muligt at opnå betydelige fremskridt i forståelsen af katalytiske mekanismer og trække binding af GT'er.
I bakterier synes O-glycosylering at være mere udbredt end N-glycosylering. O-glycosyleringsstederne viser ikke en konsensussekvens, og mange af de O-glycosylerede proteiner udskilles eller celleoverfladeproteiner, såsom flagelliner, pili eller autotransportører1. Flagellinglykosylering viser variation i antallet af acceptorsteder, glykansammensætning og struktur. For eksempel har Burkholderia spp flagelliner kun et acceptorsted, mens flagelliner i Campylobacter jejuni har så mange som 19 acceptorsteder15,16. Desuden er glycan for nogle bakterier et enkelt monosaccharid, mens andre bakterier besidder heterogene glycaner kompromitteret af forskellige monosaccharider for at danne oligosaccharider. Denne heterogenicitet forekommer selv blandt stammer af samme art. Helicobacter flagelliner er kun modificeret af pseudaminsyre (PseAc)17, og Campylobacter flagelliner kan modificeres af PseAc, acetamidinoformen af pseudaminsyre (PseAm) eller legionaminsyre (LegAm) og glycaner afledt af disse sukkerarter med acetyl, N-acetylglucosamin eller propioniske substitutioner18,19. I Aeromonas modificeres flagelliner af glycaner, hvis sammensætning spænder fra et enkelt PseAc-syrederivat til et heteropolysaccharid20, og fastgørelsen af glycaner til flagellinmonomererne sker altid via et PseAc-derivat.
Generelt er glykosylering af flagelliner afgørende for flagellar filamentsamling, bevægelighed, virulens og værtssotientitet. Men mens flagelliner af C. jejuni16, H. pylori17 og Aeromonas sp. 21 kan ikke samles i filament, medmindre proteinmonomererne er glykosylerede, Pseudomonas spp. og Burkholderia spp. 15 kræver ikke glykosylering til samling af flageller. Desuden påvirker ændringer i flagellaglycanens sukkersammensætning i nogle C. jejuni-stammer bakterie-værtsinteraktion og kan spille en rolle i at undgå visse immunresponser16. Autoagglutination er en anden fænotypisk egenskab påvirket af ændringer i sammensætningen af glycaner forbundet med flagelliner. En lavere autoagglutination fører til en reduktion i evnen til at danne mikrokolonier og biofilm22. I nogle bakterier var flagellas evne til at udløse et proinflammatorisk respons forbundet med flagellinglykosylering. I P. aeruginosa inducerer glycosyleret flagellin således et højere proinflammatorisk respons end unglycosyleret23.
Aeromonas er gramnegative bakterier, der er allestedsnærværende i miljøet, hvilket gør det muligt for dem at være ved grænsefladen mellem alle One Health-komponenter 24. Mesophilic Aeromonas har et enkelt polært flagellum, som er konstitutivt produceret. Mere end halvdelen af kliniske isolater udtrykker også lateral flagellin, der kan induceres i medier eller plader med høj viskositet. Forskellige undersøgelser har relateret begge flagellatyper med de tidlige stadier af bakteriel patogenese25. Mens polære flagelliner, der er rapporteret til dato, er O-glycosyleret ved 5-8 Ser- eller Thr-rester af dets centrale immunogene domæner, er laterale flagelliner ikke O-glycosyleret i alle stammerne. Selvom polære flagellaglycaner fra forskellige stammer viser mangfoldighed i deres kulhydratsammensætning og kædelængde20, har det bindende sukker vist sig at være et pseudaminsyrederivat.
Målet med dette manuskript er at beskrive en metode til opnåelse af nulmutanter i specifikke GT'er eller kromosomale regioner indeholdende GT'er for at analysere deres involvering i biosyntesen af relevante polysaccharider og i bakteriel patogenicitet samt selve glycanens rolle. Som et eksempel identificerer og sletter vi en kromosomal region, der indeholder GT'er af Aeromonas for at fastslå dets involvering i polær flagellinglykosylering og analysere flagellinglycanens rolle. Vi viser, hvordan man sletter en bestemt GT for at etablere dens funktion i biosyntesen af denne glycan og rollen som modificeret glycan. Selvom man bruger Aeromonas som et eksempel, kan princippet bruges til at identificere og studere flagellaglykosyleringsøer af andre gramnegative bakterier og analysere funktionen af GT'er involveret i biosyntesen af andre glycaner såsom O-antigen lipopolysaccharid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

Undersøgelsen af glykosylering i prokaryoter er et hurtigt voksende område. Bakterier har forskellige glykosylerede strukturer på deres overflade, hvis glycaner udgør en stammespecifik stregkode. De tilknyttede glycaner viser større mangfoldighed i sukkersammensætning og struktur end eukaryoter og er vigtige i bakterie-værtsgenkendelsesprocesser og interaktion med miljøet. I patogene bakterier har glycoproteiner været involveret i forskellige stadier af den infektiøse proces, og glycanmodifikationer kan forstyrre specifikke funktioner af glycoproteiner. På trods af de fremskridt, der er gjort i forståelsen af glycansammensætning, struktur og biosynteseveje, forbliver forståelsen af glycoproteinernes rolle i patogenicitet eller interaktion med miljøet imidlertid meget begrænset. Desuden deles de enzymer, der kræves til proteinglykosylering, i nogle bakterier med andre biosyntetiske veje for polysaccharid, såsom lipopolysaccharid og kapselbiosyntetiske veje. Den funktionelle betydning af glycosylering er blevet belyst i flere bakterier gennem mutation af specifikke gener, der menes at være involveret i glykosyleringsprocessen og undersøgelsen af dens indvirkning på ekspressionen af målglycoproteinet og den modificerende glycan. Mesophilic Aeromonas har et enkelt og O-glycosyleret polært flagellum. Flagellarglycaner viser mangfoldighed i kulhydratsammensætning og kædelængde mellem Aeromonas-stammer . Imidlertid viser alle stammer, der er analyseret til dato, et pseudaminsyrederivat som det bindende sukker, der ændrer serin- eller threoninrester. Pseudaminsyrederivatet er nødvendigt for polær flagellasamling, og dets tab har indflydelse på vedhæftning, biofilmdannelse og kolonisering. Protokollen beskrevet i denne artikel, hvordan konstruktionen af nullmutanter kan bruges til at forstå inddragelsen af gener eller genomregioner, der indeholder formodede glycosyltransferaser i biosyntesen af en flagellar glycan. Dette omfatter potentialet til at forstå funktionen af de involverede glycosyltransferaser og glycanens rolle. Dette opnås ved at sammenligne den glykanmangelfulde mutant med vildtypestammen.

Denne metode giver et effektivt system til at generere nulmutanter i gener eller kromosomale regioner i Aeromonas , der kan påvirke flagellaglykosylering og flagellafilamentets rolle (figur 1).
Protokollen starter med bioinformatisk identifikation af formodede FFI'er og de gener, der koder for GT'er, der er til stede i denne region. I Aeromonas er den kromosomale placering af FGIs baseret på påvisning af tre typer gener: gener involveret i bio...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Her beskriver vi konstruktionen af nulmutanter af Aeromonas i specifikke glycosyltransferaser eller regioner indeholdende glycosyltransferaser, motilitetsassays og flagellarensning udført for at fastslå involvering og funktion af deres kodede enzymer i biosyntesen af en glycan samt denne glycans rolle i bakteriel patogenese.

Generering af nullmutanter for at belyse rollen som bakterielle glycosyltransferaser i bakteriel motilitet

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Så neurminsyrederivat er kun til stede i patogene bakterier, aminiglycosyleret flagella indeholder dette sukker. I ramme sletning af region indeholdt i generne kan hjælpe med at finde flagella glycosylering klynger. Denne teknik, den seneste specifikke region eller gener, såsom glycosyltransferaser, der har høj homologi mellem dem og er involveret i forskellige processer, og analyserer dens involvering i flagellaglykosyleringsprocessen.Denne teknik kan også hjælpe med at finde rollen som glycosyltransferaser involveret i biosyntesen af relevante polysaccharider i patogene bakterier og også rollen som genkodende proteiner involveret i flagelladannelse. Demonstration af proceduren vil Maite Polo, en tekniker i mit laboratorium. Design to par primere, der forstærker DNA-regioner opstrøms og nedstrøms for det valgte gen eller region, der skal slettes.Primere A og D skal inkludere i den fem primære ende, et begrænsningssted for en endonuklease, der tillader kloning i pDM4. Sørg for, at primere B og C er inden for det gen, der skal slettes, eller inde i det første og sidste gen i den region, der skal slettes. Sørg for, at begge primere er i ramme og placeret mellem fem til seks kodoner inde i genet.Sørg for, at begge primere inkluderer en 21 basepar komplementær sekvens i den fem primære ende for at slutte sig til DNA-ampliconer AB og CD.Brug 100 nanogram renset kromosomalt DNA som skabelon i to sæt asymmetriske PCR'er med AB- og CD-primere efterfulgt af analysen af resulterende produkter i 1% agarosegel. Rens og kvantificer de udskårne amplikoner fra elektroforetisk gel. Bland 100 nanogram af hver amplicon med PCR-reagenser uden primer.Når du har udvidet det, skal du tilføje A- og D-primere og forstærke dem som et enkelt fragment. Derefter analyseres, renses og kvantificeres de resulterende produkter som tidligere beskrevet. Fordøje et mikrogram pDM4 og 400 nanogram AD amplicon med en endonuklease.Kombiner den fordøjede pDM4 med AD amplicon ved en molær vektor for at indsætte forholdet på en til fire og forberede ligationsreaktionen. Inkuber natten over ved 20 grader Celsius. Senere skal du inaktivere T4 ligase ved 70 grader Celsius i 20 minutter.Inokuler Escherichia coli-stamme i Luria Bertani Miller bouillon og inkuber ved 30 grader Celsius med omrystning ved 200 o / min, indtil der observeres en optisk densitet mellem 0,4 og 0,6. Pellet bakteriekulturen ved centrifugering ved 5.000 gange G og fire grader Celsius i 15 minutter. Suspender pillen i kølet destilleret vand, og gentag rengøringsprocessen to gange mere.Overfør bakteriesuspensionen til mikrofugerørene og gentag centrifugeringen ved 14.000 gange G og fire grader Celsius i fem minutter. Efter genoplivning af pelleten i kølet vand tilsættes ca. 3,5 mikroliter ligationsblandingen og inkuberes på is i fem minutter. Overfør indholdet til en kølet elektroporationskuvette med to millimeter mellemrum.Efter elektroporation tilsættes SOC-mediet og overføres indholdet til et kulturrør. Inkuber i en time ved 30 grader Celsius med omrystning ved 200 o / min. Plade de transformerede celler på LB agar plader suppleret med chloramphenicol.Kontroller indsættelsen af sletningskonstruktionen i pDM4 ved PCR ved hjælp af primere, der flankerer pDM4-kloningssiden. Forbered kulturer natten over, så modtageren Aeromonas stammer rifampicin resistent og to forskellige stammer af Escherichia coli. Donorstammen med det pDM4-rekombinante plasmid og hjælperstammen med PRK 2073-plasmidet ved 30 grader Celsius.Suspender det samme antal kolonier af donor-, modtager- og hjælperstammer i tre LB-rør med 150 mikroliter LB. Derefter blandes de tre bakterielle suspensioner på en LB agarplade uden antibiotika i to dråber ved en modtager til hjælper til donorforhold på fem til en til en og inkuberer pladen med forsiden op natten over ved 30 grader Celsius. Høst bakterier ved at tilsætte en milliliter LB bouillon til LB agar pladen. Overfør bakteriesuspensionen til et konisk 1,5 ml mikrofugerør og kraftigt hvirvel.Spred 100 mikroliter af bakteriesuspensionen på LB-agarplader med rifampicin og chloramphenicol. Spin ned 200 mikroliter og 600 mikroliter af prøverne, suspendere pelleten i 100 mikroliter LB bouillon og plade på LB agar med rifampicin og chloramphenicol efterfulgt af inkubation. Udfør en oxidasetest for at bekræfte, at kolonierne er Aeromonas.Yderligere bekræfte indsættelsen af pDM4 rekombinant plasmid i det specifikke kromosomale område ved PCR ved anvendelse af E- og F-primerne. Dyrk de rekombinante kolonier i to milliliter LB med 10% saccharose og uden antibiotika natten over ved 30 grader Celsius. Efter fremstilling af forskellige kulturfortyndinger plade 100 mikroliter af bakteriekulturerne og fortyndinger på LB agar plade med 10% saccharose og inkubere natten over ved 30 grader Celsius.Den næste dag skal du afhente kolonierne og overføre dem til LB-plader med og uden chloramphenicol. Efter at have inkuberet dem natten over ved 30 grader Celsius, skal du vælge de chloramphenicolfølsomme kolonier. Analyser de følsomme kolonier ved hjælp af PCR ved hjælp af EF-primerparret, og vælg de kolonier, hvis PCR-produkt korrelerede med størrelsen på den slettede konstruktion.Sæt en lille dråbe silikone i de fire hjørner af dækslets dias, og monter natten over dyrket kultur af Aeromonas på et dæksel dias. Placer et udgravet dias på dækslets dias, og vend glideren på hovedet. Analyser svømmemotilitet ved lysmikroskopi ved hjælp af et optisk mikroskop, og overfør derefter tre mikroliter af kulturen til midten af en blød agarplade.Inkuber pladen med forsiden op natten over mellem 25 og 30 grader Celsius. Brug en lineal i slutningen af inkubationen til at måle bakteriemigrationen fra pladecentret mod periferien gennem agaren. Kultur Aeromonas stammer natten over i 900 ml TSB mellem 25 og 30 grader Celsius.Efter centrifugering suspenderes pelleten i 20 ml 100 millimolær Tris-hydrogenchloridbuffer med pH 7,8. For at fjerne den forankrede flagella skal du blotte suspensionen i en hvirvel med en glasstang i tre til fire minutter og derefter passere gentagne gange gennem en 21 gauge sprøjte. Pellet bakterierne ved to på hinanden følgende centrifugeringer ved fire grader Celsius og saml supernatanten i et separat rør.Efter ultracentrifugering af supernatanten suspenderes pelleten i 150 mikroliter 100 millimolært Tris-hydrogenchlorid indeholdende to millimolære EDTA-buffere. Overfør 150 mikroliter af den berigede fraktion af flagella til et tyndvægget ultraklart rør, og fyld det med 12 ml cæsiumchloridopløsning. Ultracentrifugering af røret ved 60.000 gange G i 48 timer ved fire grader Celsius i en svingende skovlrotor.Opsaml flagellabåndet i cæsiumchloridgradienten med en sprøjte og dialyser mod 100 millimolært Tris-hydrogenchlorid plus to millimolære EDTA efterfulgt af analyse ved elektroforese og Coomassie blå farvning eller massespektrometri. I den følgende figur er bane WT Aeromonas piscicola AH3. Baner en til otte viser chloramphenicolfølsomme kolonier af den anden rekombination.ST er hyperblære 1KB markør. Bane et til tre og fem til otte viser kolonierne med vildtype FGI4-gen som bane WT. Bane fire viser en koloni med det slettede FGI4-gen. Lysmikroskopianalyser viste, at polære eller laterale flagellamodifikationer kun fører til reduktioner i migrationsdiametrene, således viser AH-3 FGI-mutant og AH-3 FGI-4-mutanter kun nedsat bevægelighed i forhold til vildtypestammen.Figuren viser polært flagellum fra AH-3 i bane et og ingen mutanter i FGI-området i bane to og FGI-4-genet i bane tre, hvor begge mutanter har polære flagelliner med lavere molekylvægt end vildtypestammen, hvilket tyder på ændringer i flagellaglycanen. Det er vigtigt at sikre, at mutationer ikke påvirker nedstrøms gener og fører manglende evne til flagellasamlingen eller manglende evne til filamenter af flagella. Når ændring i flagellinproteiner ikke kan påvises, kræves massespektrometrianalyse ved anvendelse af det samlede protein af flagellinpeptider for at kende glycanmassen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spyt, spytkirtel, og hæmolymfe Collection fra Ixodes scapularis Flåter

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescerende Bakteriel Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Brug Overlay Assay til Kvalitativt foranstaltning Bakteriel Produktion af og følsomhed til Pneumokok Bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation og Multi-fænotypisk High-indhold Screening af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder til at hæmme bakteriel Pyomelanin Produktion og Bestem den tilsvarende stigning i Følsomhed over for oxidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisering af Krampetrækning motilitet og karakterisering af rolle<em&gt; PilG</em&gt; i<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays til at studere rollen, som Vitronectin i bakteriel adhæsion og Serum modstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...