Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Research Council Canada, voor het Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanje) en voor de Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

De schematische weergave van de procedure is weergegeven in figuur 1.
1. Bioinformatische identificatie van flagella glycosylatie eiland (GFI's) in Aeromonas
<ol><li>Om de pseac biosynthetische clusters in de Aeromonas genomen te identificeren, gebruikt u de tblastn tool uit de NCBI database26. Haal eerst orthologe eiwitten naar PSEC en PSEI van A. piscicola AH-3 (identificatiecodes zij...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacteria:+sweeter+than+ever.">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Never+say+never+again:+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria.">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li><li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+sugars+sticking+out.">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li><li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferases:+structures,+functions,+and+mechanisms.">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li><li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate-active+enzymes+database+(CAZy)+in+2013.">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).</li><li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine-linked+protein+glycosylation:+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems.">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).</li><li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation.">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems.">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li><li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li><li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin.">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li><li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural,+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori.">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li><li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum.">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li><li>Kov&#225;cs, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction.">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703 (1956).</li><li>Fulton, K. M., Mendoza-Barber&#225;, E., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+(Serotype+O11).">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li><li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology,+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida.">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).</li><li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

De cruciale vroege stap van deze methode is de identificatie van regio's die betrokken zijn bij de glycosylatie van flagella en vermeende GT's, omdat deze enzymen een hoge homologie vertonen en betrokken zijn bij veel processen. Bioinformatische analyse van Aeromonas-genomen in openbare databases toont aan dat dit gebied grenst aan het polaire flagellagebied 2, dat de flagellinegenen in veel stammen bevat en genen bevat die betrokken zijn bij de biosynthese van pseudamininezuur27. Dit hee...

Eiwitglycosylatie is beschreven in zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën en bestaat uit de covalente hechting van een glycaan aan een aminozuurzijketen 1,2. Bij prokaryoten vindt dit proces meestal plaats via twee belangrijke enzymatische mechanismen: O- en N-glycosylatie 3. Bij O-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de hydroxylgroep van een serine (Ser) of threonine (Thr) residu. Bij N-glycosylatie is de glycaan bevestigd aan de zijketenamidestikstof van een asparagine (Asn) residu binnen de tripeptidesequenties Asn-X-Ser/Thr, waarbij X elk aminozuur kan zijn behalve proline.
Glycanen kunnen lineaire of vertakte structuren aannemen en zijn samengesteld uit monosachariden of polysacchariden die covalent verbonden zijn door glycosidische bindingen. In prokaryoten vertonen glycanen meestal diversiteit in suikersamenstelling en -structuur in vergelijking met eukaryote glycanen4. Verder zijn twee verschillende bacteriële glycosylatieroutes beschreven die verschillen in de manier waarop de glycaan wordt samengesteld en overgebracht naar het acceptoreiwit: sequentiële en en bloc glycosylatie 5,6. Voor sequentiële glycosylatie wordt het complexe glycaan direct op het eiwit opgebouwd door opeenvolgende toevoeging van monosacchariden. Bij en bloc glycosylatie wordt een voorgeassembleerd glycaan door een gespecialiseerd oligosaccharyltransferase (OTase) overgebracht naar het eiwit van een lipide-gebonden oligosacharide. Van beide routes is aangetoond dat ze betrokken zijn bij N- en O-glycosylatieprocessen7.
Eiwitglycosylatie speelt een rol bij het moduleren van de fysisch-chemische en biologische eigenschappen van eiwitten. De aanwezigheid van een glycaan kan beïnvloeden hoe het eiwit interageert met zijn ligand, wat de biologische activiteit van het eiwit beïnvloedt, maar kan ook de eiwitstabiliteit, oplosbaarheid, gevoeligheid voor proteolyse, immunogeniciteit en microbe-gastheerinteracties beïnvloeden 8,9. Verschillende glycosylatieparameters, zoals het aantal glycanen, de samenstelling, positie en het hechtingsmechanisme van glycanen, kunnen echter ook de eiwitfunctie en -structuur beïnvloeden.
Glycosyltransferasen (GT's) zijn de belangrijkste enzymen in de biosynthese van complexe glycanen en glycoconjugaten. Deze enzymen katalyseren de glycosidische bindingsvorming tussen een suikergroep van een geactiveerd donormolecuul en een specifieke substraatacceptor. GT's kunnen zowel nucleotiden als niet-nucleotiden gebruiken als donormoleculen en zich richten op verschillende substraatacceptoren, zoals eiwitten, sacchariden, nucleïnezuren en lipiden10. Daarom is het begrijpen van GT's op moleculair niveau belangrijk om hun werkingsmechanismen en specificiteit te identificeren, en maakt het ook mogelijk om te begrijpen hoe de suikersamenstelling van glycanen die relevante moleculen wijzigen, gerelateerd is aan pathogeniciteit. De Carbohydrate Active enzyme database (CAZy)11 classificeert GT's op basis van hun sequentie homologie, wat een voorspellend hulpmiddel biedt omdat in de meeste GT-families de structurele vouw en werkingsmechanismen invariant zijn. Vier redenen maken het echter moeilijk om substraatspecificiteit van veel GT's te voorspellen: 1) er is geen duidelijk sequentiemotief dat de substraatspecificiteit bepaalt bepaald in prokaryoten12, 2) veel GT's en OTases vertonen substraatpromiscuïteit 13,14, 3) functionele GT's zijn moeilijk te produceren in hoge opbrengst in recombinante vorm en 4) de identificatie van zowel donor- als acceptorsubstraten is complex. Desondanks hebben recente mutagenesestudies het mogelijk gemaakt om aanzienlijke vooruitgang te boeken in het begrip van katalytische mechanismen en het aftrekken van binding van GT's.
Bij bacteriën lijkt O-glycosylatie vaker voor te komen dan N-glycosylatie. De O-glycosylatieplaatsen vertonen geen consensussequentie en veel van de O-geglycosyleerde eiwitten zijn uitgescheiden of celoppervlakeiwitten, zoals flagellinen, pili of autotransporters1. Flagelline glycosylatie toont variabiliteit in het aantal acceptorplaatsen, glycaansamenstelling en structuur. Burkholderia spp flagellins hebben bijvoorbeeld slechts één acceptantensite, terwijl flagellins in Campylobacter jejuni maar liefst 19 acceptorsites hebben15,16. Bovendien is de glycaan voor sommige bacteriën een enkele monosacharide, terwijl andere bacteriën heterogene glycanen bezitten die zijn aangetast door verschillende monosachariden om oligosachariden te vormen. Deze heterogeniciteit komt zelfs voor bij stammen van dezelfde soort. Helicobacter flagellinen worden alleen gewijzigd door pseudamininezuur (PseAc)17, en Campylobacter flagellinen kunnen worden gewijzigd door PseAc, de acetamidinovorm van het pseudamininezuur (PSEAm) of legionaminezuur (LegAm), en glycanen afgeleid van deze suikers met acetyl, N-acetylglucosamine of propionische substituties18,19. In Aeromonas worden flagelliërs gemodificeerd door glycanen waarvan de samenstelling varieert van een enkel PseAc-zuurderivaat tot een heteropolysaccharide20, en de aanhechting van glycanen aan de flagellinemonomeren verloopt altijd via een PseAc-derivaat.
Over het algemeen is glycosylatie van flagellinen essentieel voor de assemblage van flagellaire filamenten, motiliteit, virulentie en gastheerspecificiteit. Echter, terwijl flagellins van C. jejuni16, H. pylori17 en Aeromonas sp. 21 kan niet tot filament worden samengevoegd tenzij de eiwitmonomeren zijn geglycosyleerd, Pseudomonas spp. en Burkholderia spp. 15 vereisen geen glycosylatie voor flagella-assemblage. Bovendien beïnvloeden bij sommige C. jejuni-stammen veranderingen in de suikersamenstelling van de flagella glycan de interactie tussen bacteriën en gastheer en kunnen ze een rol spelen bij het ontwijken van bepaalde immuunresponsen16. Autoagglutinatie is een ander fenotypisch kenmerk dat wordt beïnvloed door wijzigingen in de samenstelling van glycanen geassocieerd met flagellinen. Een lagere autoagglutinatie leidt tot een vermindering van het vermogen om microkolonies en biofilm te vormen22. Bij sommige bacteriën was het vermogen van flagella om een pro-inflammatoire reactie te veroorzaken gekoppeld aan flagelline glycosylatie. Dus, in P. aeruginosa, geglycosyleerde flagelline induceert een hogere pro-inflammatoire respons dan unglycosylated23.
Aeromonas zijn Gram-negatieve bacteriën die alomtegenwoordig zijn in de omgeving, waardoor ze zich op het grensvlak van alle One Health-componenten kunnen bevinden 24. Mesofiele Aeromonas hebben een enkel polair flagellum, dat constitutief wordt geproduceerd. Meer dan de helft van de klinische isolaten drukt ook laterale flagelline uit, inducerend in media of platen met een hoge viscositeit. Verschillende studies hebben beide flagellatypen in verband gebracht met de vroege stadia van bacteriële pathogenese25. Terwijl polaire flagelylen die tot nu toe zijn gemeld O-geglycosyleerd zijn op 5-8 Ser- of Thr-residuen van de centrale immunogene domeinen, zijn laterale flagellines niet O-geglycosyleerd in alle stammen. Hoewel polaire flagella glycanen van verschillende stammen diversiteit vertonen in hun koolhydraatsamenstelling en ketenlengte20, is aangetoond dat de koppelende suiker een pseudamininezuurderivaat is.
Het doel van dit manuscript is om een methode te beschrijven om nulmutanten te verkrijgen in specifieke GT's of chromosomale regio's die GT's bevatten om hun betrokkenheid bij de biosynthese van relevante polysacchariden en bacteriële pathogeniciteit te analyseren, evenals de rol van de glycaan zelf. Als voorbeeld identificeren en verwijderen we een chromosomaal gebied dat GT's van Aeromonas bevat om zijn betrokkenheid bij polaire flagellineglycosylatie vast te stellen en de rol van de flagelline glycaan te analyseren. We laten zien hoe je een specifieke GT kunt verwijderen om zijn functie in de biosynthese van deze glycaan en de rol van gemodificeerde glycaan vast te stellen. Hoewel Aeromonas als voorbeeld wordt gebruikt, kan het principe worden gebruikt om flagellaglycosylatie-eilanden van andere Gram-negatieve bacteriën te identificeren en te bestuderen en de functie van GT's te analyseren die betrokken zijn bij de biosynthese van andere glycanen zoals de O-antigeen lipopolysaccharide.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

De studie van glycosylatie in prokaryoten is een snel groeiend gebied. Bacteriën herbergen verschillende geglycosyleerde structuren op hun oppervlak waarvan de glycanen een stamspecifieke barcode vormen. De geassocieerde glycanen vertonen een hogere diversiteit in suikersamenstelling en -structuur dan die van eukaryoten en zijn belangrijk in bacteriële-gastheerherkenningsprocessen en interactie met de omgeving. Bij pathogene bacteriën zijn glycoproteïnen betrokken geweest bij verschillende stadia van het infectieuze proces en glycaanmodificaties kunnen interfereren met specifieke functies van glycoproteïnen. Ondanks de vooruitgang die is geboekt in het begrip van glycaansamenstelling, structuur en biosyntheseroutes, blijft het begrip van de rol van glycoproteïnen in pathogeniciteit of interactie met de omgeving echter zeer beperkt. Bovendien worden in sommige bacteriën de enzymen die nodig zijn voor eiwitglycosylatie gedeeld met andere polysaccharide biosynthetische routes, zoals lipopolysaccharide en capsule biosynthetische routes. Het functionele belang van glycosylatie is in verschillende bacteriën opgehelderd door mutatie van specifieke genen waarvan wordt gedacht dat ze betrokken zijn bij het glycosyleringsproces en de studie van de impact ervan op de expressie van het doelglycoproteïne en de modificerende glycaan. Mesofiele Aeromonas hebben een enkelvoudig en O-geglycosyleerd polair flagellum. Flagellaire glycanen vertonen diversiteit in koolhydraatsamenstelling en ketenlengte tussen Aeromonas-stammen. Alle tot nu toe geanalyseerde stammen tonen echter een pseudamininezuurderivaat als de koppelende suiker die serine- of threonineresiduen wijzigt. Het pseudamininezuurderivaat is vereist voor polaire flagella-assemblage en het verlies ervan heeft een impact op adhesie, biofilmvorming en kolonisatie. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, beschrijft hoe de constructie van nulmutanten kan worden gebruikt om de betrokkenheid van genen of genoomgebieden die vermeende glycosyltransferasen bevatten in de biosynthese van een flagellaire glycaan te begrijpen. Dit omvat het potentieel om de functie van de betrokken glycosyltransferasen en de rol van de glycaan te begrijpen. Dit zal worden bereikt door de glycaan-deficiënte mutant te vergelijken met de wild-type stam.

Deze methodologie biedt een effectief systeem om nulmutanten te genereren in genen of chromosomale regio's van Aeromonas die flagellaglycosylering en de rol van flagellafilament kunnen beïnvloeden (figuur 1).
Het protocol begint met de bioinformatische identificatie van vermeende FFI's en de genen die coderen voor GT's die in deze regio aanwezig zijn. In Aeromonas is de chromosomale locatie van GFI's gebaseerd op de detectie van drie soorten gen...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Neurmienzuurderivaat is dus alleen aanwezig in pathogene bacteriën, aminiglycosylated flagella bevat deze suiker. In frame deletie van regio in de genen kan helpen om flagella glycosylatie clusters te vinden. Deze techniek, de nieuwste specifieke regio of genen, zoals glycosyltransferasen die een hoge homologie tussen hen hebben en betrokken zijn bij verschillende processen, en analyseren de betrokkenheid ervan bij het flagellaglycosylatieproces.Deze techniek kan ook helpen om de rol van glycosyltransferasen te vinden die betrokken zijn bij de biosynthese van relevante polysacchariden in pathogene bacteriën en ook de rol van gen-coderende eiwitten die betrokken zijn bij flagellavorming. Maite Polo, een technicus van mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Ontwerp twee paar primers die DNA-gebieden stroomopwaarts en stroomafwaarts van het geselecteerde gen of gebied versterken dat moet worden verwijderd.Primers A en D moeten aan het vijfprime-uiteinde een restrictieplaats bevatten voor een endonuclease die klonen in pDM4 mogelijk maakt. Zorg ervoor dat primers B en C zich in het te verwijderen gen bevinden of in het eerste en laatste gen van het te verwijderen gebied. Zorg ervoor dat beide primers in beeld zijn en zich tussen de vijf en zes codons in het gen bevinden.Zorg ervoor dat beide primers een 21 basenparen gratis sequentie bevatten aan het vijf priemgetal om DNA-amplicons AB en CD samen te voegen.Gebruik 100 nanogram gezuiverd chromosomaal DNA als sjabloon in twee sets asymmetrische PCR's met AB- en CD-primers gevolgd door de analyse van resulterende producten in 1% agarosegel. Zuiver en kwantificeer de weggesneden ampliconen uit elektroforetische gel. Meng 100 nanogram van elk amplicon met PCR-reagentia zonder primer.Voeg na het verlengen A- en D-primers toe en versterk ze als een enkel fragment. Analyseer, zuiver en kwantificeer vervolgens de resulterende producten zoals eerder beschreven. Verteer één microgram pDM4 en 400 nanogram AD amplicon met een endonuclease.Combineer de verteerde pDM4 met AD amplicon op een molaire vector tot insert ratio van één tot vier en bereid de ligatiereactie voor. Incubeer 's nachts bij 20 graden Celsius. Inactiveer later T4-ligase bij 70 graden Celsius gedurende 20 minuten.Ent de Escherichia coli-stam in Luria Bertani Miller-bouillon en incubeer bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM totdat een optische dichtheid tussen 0,4 en 0,6 wordt waargenomen. Pellet de bacteriecultuur door centrifugeren op 5.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Suspensie van de pellet in gekoeld gedestilleerd water en herhaal het reinigingsproces nog twee keer.Breng de bacteriesuspensie over naar microfugebuizen en herhaal de centrifugatie bij 14.000 keer G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg na het resuspenderen van de pellet in gekoeld water ongeveer 3,5 microliter van het ligatiemengsel toe en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Breng de inhoud over in een gekoelde twee millimeter gap elektroporatie cuvette.Voeg na elektroporatie het SOC-medium toe en breng de inhoud over naar een kweekbuis. Incubeer gedurende een uur bij 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM. Plaat de getransformeerde cellen op LB agar platen aangevuld met chlooramfenicol.Controleer het invoegen van het deletieconstruct in pDM4 door PCR met behulp van primers die de pDM4-kloonzijde flankeren. Bereid 's nachts culturen voor zodat de ontvangende Aeromonas-stam rifampicineresistent is en twee verschillende stammen van Escherichia coli. De donorstam met het pDM4 recombinante plasmide en de helperstam met het PRK 2073 plasmide bij 30 graden Celsius.Suspensie hetzelfde aantal kolonies van de donor-, ontvanger- en helperstammen in drie LB-buizen met 150 microliter LB. Meng vervolgens op een LB-agarplaat zonder antibiotica de drie bacteriële suspensies in twee druppels bij een verhouding tussen ontvanger en helper tot donor van vijf op één tot één en incubaleer de plaat 's nachts met het gezicht naar boven bij 30 graden Celsius. Oogst bacteriën door een milliliter LB-bouillon toe te voegen aan de LB-agarplaat. Breng de bacteriële suspensie over in een conische microfugebuis van 1,5 milliliter en vortex krachtig.Verspreid 100 microliter van de bacteriële suspensie op LB-agarplaten met rifampicine en chlooramfenicol. Draai 200 microliter en 600 microliter van de monsters naar beneden, suspenstuur de pellet in 100 microliter LB-bouillon en plaat op LB-agar met rifampicine en chlooramfenicol gevolgd door incubatie. Voer een oxidasetest uit om te bevestigen dat de kolonies Aeromonas zijn.Bevestig verder de insertie van pDM4-recombinant plasmide in het specifieke chromosomale gebied door PCR met behulp van de E- en F-primers. Kweek de recombinante kolonies in twee milliliter LB met 10% sucrose en zonder antibiotica 's nachts bij 30 graden Celsius. Na het bereiden van verschillende kweekverdunningen, plaat 100 microliter van de bacterieculturen en verdunningen op LB agarplaat met 10% sucrose en incubeer 's nachts bij 30 graden Celsius.Pak de volgende dag de kolonies op en breng ze over naar LB-platen met en zonder chlooramfenicol. Nadat je ze 's nachts bij 30 graden Celsius hebt uitgebroed, selecteer je de chlooramfenicolgevoelige kolonies. Analyseer de gevoelige kolonies door PCR met behulp van het EF-primerspaar en selecteer de kolonies waarvan het PCR-product correleerde met de grootte van de verwijderde constructie.Plaats een klein druppeltje siliconen in de vier hoeken van de afdekplaat en monteer 's nachts gekweekte cultuur van Aeromonas op een afdekplaat. Plaats een uitgegraven dia op de afdekplaat en draai de dia ondersteboven. Analyseer de zwemmotiliteit door lichtmicroscopie met behulp van een optische microscoop en breng vervolgens drie microliter van de cultuur over op het midden van een zachte agarplaat.Incubeer de plaat 's nachts met de voorkant naar boven tussen de 25 en 30 graden Celsius. Meet met behulp van een liniaal aan het einde van de incubatie de bacteriële migratie van het plaatcentrum naar de periferie door de agar. Culture Aeromonas stamt 's nachts in 900 milliliter TSB tussen de 25 en 30 graden Celsius.Na centrifugeren suspensie van de pellet in 20 milliliter van 100 millimolaire Tris waterstofchloridebuffer van pH 7,8. Om de verankerde flagella te verwijderen, schuift u de suspensie gedurende drie tot vier minuten in een vortex met een glazen staaf en gaat u vervolgens herhaaldelijk door een spuit van 21 gauge. Pellet de bacteriën door twee opeenvolgende centrifugaties bij vier graden Celsius en verzamel het supernatant in een aparte buis.Na ultracentrifuging van het supernatant, suspensie de pellet in 150 microliter van 100 millimolar Tris waterstofchloride met twee millimolar EDTA-buffer. Breng 150 microliter van de verrijkte fractie flagella over in een dunwandige ultraheldere buis en vul deze met 12 milliliter cesiumchlorideoplossing. Ultracentrifugeer de buis op 60.000 keer G gedurende 48 uur bij vier graden Celsius in een zwaaiende emmerrotor.Verzamel de flagellaband in de cesiumchloridegradiënt met een spuit en dialyseer tegen 100 millimolar Tris waterstofchloride plus twee millimolar EDTA gevolgd door analyse door elektroforese en Coomassie blauwe kleuring of massaspectrometrie. In de volgende figuur is baan WT Aeromonas piscicola AH3. Lanes één tot acht toont chlooramfenicol gevoelige kolonies van de tweede recombinatie.ST is hyperblaas 1KB marker. Lanes één tot drie en vijf tot acht tonen de kolonies met wild type FGI4 gen als lane WT. Baan vier toont een kolonie met het verwijderde FGI4-gen. Lichte microscopie-assays toonden aan dat polaire of laterale flagellamodificaties alleen leiden tot reducties in de migratiediameters, dus AH-3 FGI-mutant en AH-3 FGI-4-mutanten vertonen slechts verminderde motiliteit in relatie tot de wildtype-stam.De figuur toont polair flagellum van AH-3 van baan één, en de geen mutanten in het FGI-gebied van baan twee en FGI-4 gen van baan drie, waarbij beide mutanten polaire flagellines hebben met een lager molecuulgewicht dan de wildtype stam, wat veranderingen in de flagella glycaan suggereert. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat mutaties geen invloed hebben op downstream-genen en leiden tot het onvermogen tot de flagella-assemblage of het onvermogen van filamenten van flagella. Wanneer verandering in flagelline-eiwitten niet detecteerbaar is, is massaspectrometrie-analyse vereist met behulp van het totale eiwit van flagellinepeptiden om de glycaanmassa te kennen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speeksel, speekselklieren en hemolymfe Collectie van Ixodes scapularis Teken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Met behulp van de overlay test om Kwalitatief Meet Bacteriële productie van en gevoeligheid voor pneumokokken Bacteriocines

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generatie en Multi-fenotypische High-inhoud Screening van<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Methoden te remmen Bacteriële Pyomelanin Productie en Bepaal de overeenkomstige stijging van de gevoeligheid voor oxidatieve stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisatie van Twitching Beweeglijkheid en karakterisering van de rol van de<em&gt; PilG</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Tests voor de bestudering van de rol van Vitronectin in bacteriële hechting en een Serum

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...