Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Conseil national de recherches du Canada, pour le Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Espagne) et pour la Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

La représentation schématique de la procédure est illustrée à la figure 1.
1. Identification bioinformatique de l’îlot de glycosylation flagelle (IFFI) à Aeromonas
<ol><li>Pour identifier les grappes de biosynthétiques PseAc dans les génomes d’Aeromonas , utilisez l’outil tblastn de la base de données NCBI26. Tout d’abord, récupérez les protéines orthologues en PseC et PseI ...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferases:+structures,+functions,+and+mechanisms.">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li><li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate-active+enzymes+database+(CAZy)+in+2013.">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).</li><li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine-linked+protein+glycosylation:+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems.">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).</li><li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation.">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems.">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li><li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li><li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin.">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li><li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural,+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori.">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li><li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

L’étape précoce critique de cette méthode est l’identification des régions impliquées dans la glycosylation des flagelles et des GT putatifs, car ces enzymes présentent une homologie élevée et sont impliquées dans de nombreux processus. L’analyse bioinformatique des génomes d’Aeromonas dans les bases de données publiques montre que cette région est adjacente à la région polaire flagellelle 2, qui contient les gènes de flagelline dans de nombreuses souches et contient des gènes impliqués ...

La glycosylation des protéines a été décrite chez les bactéries Gram positif et Gram négatif et consiste en la fixation covalente d’un glycane à une chaîne latérale d’acide aminé 1,2. Chez les procaryotes, ce processus se produit généralement via deux mécanismes enzymatiques majeurs: O- et N-glycosylation 3. Dans l’O-glycosylation, le glycane est attaché au groupe hydroxyle d’un résidu de sérine (Ser) ou de thréonine (Thr). Dans la N-glycosylation, le glycane est attaché à l’azote amide de la chaîne latérale d’un résidu d’asparagine (Asn) dans les séquences tripeptides Asn-X-Ser/Thr, où X pourrait être n’importe quel acide aminé à l’exception de la proline.
Les glycanes peuvent adopter des structures linéaires ou ramifiées et sont composés de monosaccharides ou de polysaccharides liés de manière covalente par des liaisons glycosidiques. Chez les procaryotes, les glycanes présentent généralement une diversité dans la composition et la structure du sucre par rapport aux glycanes eucaryotes4. En outre, deux voies de glycosylation bactériennes différentes qui diffèrent dans la façon dont le glycane est assemblé et transféré à la protéine acceptrice ont été décrites: glycosylation séquentielle et en bloc 5,6. Pour la glycosylation séquentielle, le glycane complexe est construit directement sur la protéine par addition successive de monosaccharides. Dans la glycosylation en bloc, un glycane pré-assemblé est transféré à la protéine à partir d’un oligosaccharide lié aux lipides par une oligosaccharyltransférase spécialisée (OTase). Il a été démontré que les deux voies sont impliquées dans les processus de glycosylation N et O 7.
La glycosylation des protéines joue un rôle dans la modulation des propriétés physico-chimiques et biologiques des protéines. La présence d’un glycane peut influencer la façon dont la protéine interagit avec son ligand, ce qui affecte l’activité biologique de la protéine, mais peut également affecter la stabilité des protéines, la solubilité, la susceptibilité à la protéolyse, l’immunogénicité et les interactions microbe-hôte 8,9. Cependant, plusieurs paramètres de glycosylation, tels que le nombre de glycanes, la composition du glycane, la position et le mécanisme d’attachement, pourraient également affecter la fonction et la structure des protéines.
Les glycosyltransférases (GT) sont les enzymes clés dans la biosynthèse des glycanes complexes et des glycoconjugués. Ces enzymes catalysent la formation de liaison glycosidique entre une fraction de sucre d’une molécule donneuse activée et un accepteur de substrat spécifique. Les GT peuvent utiliser à la fois des nucléotides et des non-nucléotides comme molécules donneuses et cibler différents accepteurs de substrat, tels que des protéines, des saccharides, des acides nucléiques et des lipides10. Par conséquent, la compréhension des GT au niveau moléculaire est importante pour identifier leurs mécanismes d’action et leur spécificité, et permet également de comprendre comment la composition en sucre des glycanes qui modifient les molécules pertinentes est liée à la pathogénicité. La base de données sur les enzymes glucidiques actives (CAZy)11 classe les GT en fonction de leur homologie de séquence, ce qui fournit un outil prédictif puisque, dans la plupart des familles GT, le pli structurel et les mécanismes d’action sont invariants. Cependant, quatre raisons rendent difficile la prédiction de la spécificité du substrat de nombreux GT : 1) aucun motif de séquence clair déterminant la spécificité du substrat n’a été déterminé chez les procaryotes12, 2) de nombreux GT et OTases montrent la promiscuité du substrat13,14, 3) les GT fonctionnels sont difficiles à produire à haut rendement sous forme recombinante et 4) l’identification des substrats donneurs et accepteurs est complexe. Malgré cela, des études récentes sur la mutagénèse ont permis d’obtenir des avancées significatives dans la compréhension des mécanismes catalytiques et de soustraire la liaison des GT.
Chez les bactéries, l’O-glycosylation semble être plus répandue que la N-glycosylation. Les sites d’O-glycosylation ne montrent pas de séquence consensuelle, et de nombreuses protéines O-glycosylées sont sécrétées ou des protéines de surface cellulaire, telles que les flagellines, les pili ou les autotransporteurs1. La glycosylation de la flagelle montre une variabilité dans le nombre de sites accepteurs, la composition du glycane et la structure. Par exemple, les flagellines de Burkholderia spp n’ont qu’un seul site d’acceptation, tandis que chez Campylobacter jejuni, les flagellènes ont jusqu’à 19 sites d’acceptation15,16. De plus, pour certaines bactéries, le glycane est un monosaccharide unique, tandis que d’autres bactéries possèdent des glycanes hétérogènes compromis de différents monosaccharides pour former des oligosaccharides. Cette hétérogénicité se produit même parmi les souches de la même espèce. Les flagellines Helicobacter ne sont modifiées que par l’acide pseudaminique (PseAc)17, et les flagellines campylobacter peuvent être modifiées par PseAc, la forme acétamidino de l’acide pseudaminique (PseAm) ou de l’acide légionaminique (LegAm), et les glycanes dérivés de ces sucres avec de l’acétyle, de la N-acétylglucosamine ou des substitutions propioniques 18,19. Chez Aeromonas, les flagellènes sont modifiées par des glycanes dont la composition va d’un seul dérivé de l’acide PseAc à un hétéropolysaccharide20, et la fixation des glycanes aux monomères de flagelline se fait toujours via un dérivé PseAc.
En général, la glycosylation des flagellènes est essentielle pour l’assemblage du filament flagellaire, la motilité, la virulence et la spécificité de l’hôte. Cependant, alors que les flagellènes de C. jejuni16, H. pylori17 et Aeromonas sp. 21 ne peut s’assembler en filament que si les monomères de protéines sont glycosylés, Pseudomonas spp. et Burkholderia spp. 15 ne nécessitent pas de glycosylation pour l’assemblage des flagelles. De plus, chez certaines souches de C. jejuni, les changements dans la composition en sucre du flagelle glycane affectent l’interaction bactérie-hôte et peuvent jouer un rôle dans l’évasion de certaines réponses immunitaires16. L’autoagglutination est une autre caractéristique phénotypique affectée par les modifications de la composition des glycanes associées aux flagellines. Une autoagglutination plus faible entraîne une réduction de la capacité à former des microcolonies et du biofilm22. Chez certaines bactéries, la capacité des flagelles à déclencher une réponse pro-inflammatoire était liée à la glycosylation de la flagelline. Ainsi, chez P. aeruginosa, la flagelline glycosylée induit une réponse pro-inflammatoire plus élevée que le23 non glycolycosylé.
Les Aeromonas sont des bactéries à Gram négatif omniprésentes dans l’environnement, ce qui leur permet d’être à l’interface de tous les composants one health 24. Les Aeromonas mésophiles ont un seul flagelle polaire, qui est produit de manière constitutive. Plus de la moitié des isolats cliniques expriment également la flagelline latérale, inductible dans des milieux ou des plaques à haute viscosité. Différentes études ont lié les deux types de flagelles aux premiers stades de la pathogenèse bactérienne25. Alors que les flagellules polaires rapportées à ce jour sont O-glycosylées à 5-8 résidus Ser ou Thr de ses domaines immunogènes centraux, les flagellines latérales ne sont pas O-glycosylées dans toutes les souches. Bien que les glycanes flagelles polaires de différentes souches présentent une diversité dans leur composition glucidique et leur longueur de chaîne20, il a été démontré que le sucre de liaison est un dérivé de l’acide pseudaminique.
Le but de ce manuscrit est de décrire une méthode permettant d’obtenir des mutants nuls dans des GT spécifiques ou des régions chromosomiques contenant des GT afin d’analyser leur implication dans la biosynthèse des polysaccharides pertinents et dans la pathogénicité bactérienne, ainsi que le rôle du glycane lui-même. À titre d’exemple, nous identifions et supprimons une région chromosomique contenant des GT d’Aeromonas pour établir son implication dans la glycosylation de la flagelline polaire et analyser le rôle du glycane de flagelline. Nous montrons comment supprimer un GT spécifique pour établir sa fonction dans la biosynthèse de ce glycane et le rôle du glycane modifié. Bien qu’en utilisant Aeromonas comme exemple, le principe peut être utilisé pour identifier et étudier les îlots de glycosylation flagelle d’autres bactéries à Gram négatif et analyser la fonction des GT impliqués dans la biosynthèse d’autres glycanes tels que le lipopolysaccharide O-antigène.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

L’étude de la glycosylation chez les procaryotes est un domaine en croissance rapide. Les bactéries abritent différentes structures glycosylées à leur surface dont les glycanes constituent un code-barres spécifique à la souche. Les glycanes associés présentent une plus grande diversité dans la composition et la structure du sucre que ceux des eucaryotes et sont importants dans les processus de reconnaissance bactérie-hôte et l’interaction avec l’environnement. Chez les bactéries pathogènes, les glycoprotéines ont été impliquées à différentes étapes du processus infectieux, et les modifications du glycane peuvent interférer avec des fonctions spécifiques des glycoprotéines. Cependant, malgré les progrès réalisés dans la compréhension de la composition, de la structure et des voies de biosynthèse des glycanes, la compréhension du rôle des glycoprotéines dans la pathogénicité ou l’interaction avec l’environnement reste très limitée. En outre, chez certaines bactéries, les enzymes nécessaires à la glycosylation des protéines sont partagées avec d’autres voies biosynthétiques polysaccharidiques, telles que les voies biosynthétiques des lipopolysaccharides et des capsules. L’importance fonctionnelle de la glycosylation a été élucidée chez plusieurs bactéries par mutation de gènes spécifiques que l’on pense être impliqués dans le processus de glycosylation et l’étude de son impact sur l’expression de la glycoprotéine cible et du glycane modificateur. Les Aeromonas mésophiles ont un flagelle polaire unique et O-glycosylé. Les glycanes flagellaires présentent une diversité dans la composition glucidique et la longueur de la chaîne entre les souches d’Aeromonas . Cependant, toutes les souches analysées à ce jour montrent un dérivé de l’acide pseudaminique comme sucre de liaison qui modifie les résidus de sérine ou de thréonine. Le dérivé de l’acide pseudaminique est nécessaire pour l’assemblage des flagelles polaires, et sa perte a un impact sur l’adhésion, la formation de biofilm et la colonisation. Le protocole détaillé dans cet article décrit comment la construction de mutants nuls peut être utilisée pour comprendre l’implication de gènes ou de régions du génome contenant des glycosyltransférases putatives dans la biosynthèse d’un glycane flagellaire. Cela inclut le potentiel de comprendre la fonction des glycosyltransférases impliquées et le rôle du glycane. Ceci sera réalisé en comparant le mutant déficient en glycane à la souche de type sauvage.

Cette méthodologie fournit un système efficace pour générer des mutants nuls dans les gènes ou les régions chromosomiques d’Aeromonas qui peuvent affecter la glycosylation des flagelles et le rôle du filament de flagelle (Figure 1).
Le protocole commence par l’identification bioinformatique des FFI putatifs et des gènes codant pour les GT présents dans cette région. Chez Aeromonas, la localisation chromosomique des FFI est basée su...

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Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Ici, nous décrivons la construction de mutants nuls d’Aeromonas dans des glycosyltransférases spécifiques ou des régions contenant des glycosyltransférases, les tests de motilité et la purification des flagelles effectués pour établir l’implication et la fonction de leurs enzymes codées dans la biosynthèse d’un glycane, ainsi que le rôle de ce glycane dans la pathogenèse bactérienne.

Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Ainsi, les dérivés de l’acide neurminique ne sont présents que dans les bactéries pathogènes, les flagelles aminiglycosylés contiennent ce sucre. Dans le cadre, la délétion de la région contenue dans les gènes peut aider à trouver des grappes de glycosylation flagelle. Cette technique, la dernière région ou les gènes spécifiques, tels que les glycosyltransférases qui ont une homologie élevée entre eux et sont impliqués dans différents processus, et analyser son implication dans le processus de glycosylation des flagelles.Cette technique peut également aider à trouver le rôle des glycosyltransférases impliquées dans la biosynthèse des polysaccharides pertinents dans les bactéries pathogènes et aussi le rôle des protéines codant pour les gènes impliquées dans la formation des flagelles. Démonstration de la procédure par Maite Polo, technicienne de mon laboratoire. Concevez deux paires d’amorces qui amplifient les régions d’ADN en amont et en aval du gène ou de la région sélectionnée à supprimer.Les amorces A et D doivent inclure à l’extrémité des cinq amorces, un site de restriction pour une endonucléase qui permet le clonage dans pDM4. Assurez-vous que les amorces B et C se trouvent dans le gène à supprimer ou à l’intérieur du premier et du dernier gène de la région à supprimer. Assurez-vous que les deux amorces sont dans le cadre et situées entre cinq et six codons à l’intérieur du gène.Assurez-vous que les deux amorces comprennent une séquence complémentaire de 21 paires de bases à l’extrémité des cinq amorces pour joindre les amplicons d’ADN AB et CD.Utilisez 100 nanogrammes d’ADN chromosomique purifié comme modèle dans deux ensembles de PCR asymétriques avec amorces AB et CD suivies de l’analyse des produits résultants dans du gel d’agarose à 1%. Purifier et quantifier les amplicons excisés du gel électrophorétique. Mélanger 100 nanogrammes de chaque amplicon avec des réactifs PCR sans apprêt.Après l’avoir étendu, ajoutez des amorces A et D et amplifiez-les en un seul fragment. Ensuite, analysez, purifiez et quantifiez les produits résultants comme décrit précédemment. Digérer un microgramme de pDM4 et 400 nanogrammes d’amplicon AD avec une endonucléase.Combinez le pDM4 digéré avec l’amplicon AD à un vecteur molaire pour insérer un rapport de un à quatre et préparer la réaction de ligature. Incuber pendant la nuit à 20 degrés Celsius. Plus tard, inactivez la ligase T4 à 70 degrés Celsius pendant 20 minutes.Inoculer la souche Escherichia coli dans le bouillon Luria Bertani Miller et incuber à 30 degrés Celsius en agitant à 200 tr / min jusqu’à ce qu’une densité optique comprise entre 0,4 et 0,6 soit observée. Granuler la culture de la bactérie par centrifugation à 5 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Suspendez le granulé dans de l’eau distillée réfrigérée et répétez le processus de nettoyage deux fois de plus.Transférer la suspension bactérienne dans des tubes de microfuge et répéter la centrifugation à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir remis la pastille dans de l’eau glacée, ajouter environ 3,5 microlitres du mélange de ligature et incuber sur de la glace pendant cinq minutes. Transférer le contenu dans une cuvette d’électroporation réfrigérée de deux millimètres.Après l’électroporation, ajouter le milieu SOC et transférer le contenu dans un tube de culture. Incuber pendant une heure à 30 degrés Celsius en agitant à 200 RPM. Plaquer les cellules transformées sur des plaques de gélose LB complétées par du chloramphénicol.Vérifiez l’insertion de la construction de suppression dans pDM4 par PCR à l’aide d’amorces qui flanquent le côté clonage pDM4. Préparer des cultures pendant la nuit afin que la souche Aeromonas réceptrice résistante à la rifampicine et deux souches différentes d’Escherichia coli. La souche donneuse avec le plasmide recombinant pDM4 et la souche auxiliaire avec le plasmide PRK 2073 à 30 degrés Celsius.Suspendre le même nombre de colonies de souches donneuses, receveuses et auxiliaires dans trois tubes LB avec 150 microlitres de LB. Ensuite, sur une plaque de gélose LB sans antibiotiques, mélangez les trois suspensions bactériennes en deux gouttes chez un rapport receveur/aide/donneur de cinq à un pour un, et incubez la plaque face vers le haut pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Récoltez les bactéries en ajoutant un millilitre de bouillon LB à la plaque de gélose LB. Transférer la suspension bactérienne dans un tube de microfuge conique de 1,5 millilitre et vortexr vigoureusement.Étaler 100 microlitres de la suspension bactérienne sur des plaques de gélose LB avec de la rifampicine et du chloramphénicol. Essorez 200 microlitres et 600 microlitres des échantillons, suspendez la pastille dans 100 microlitres de bouillon LB et plaquez sur gélose LB avec rifampicine et chloramphénicol suivie d’une incubation. Effectuez un test d’oxydase pour confirmer que les colonies sont des Aeromonas.Confirmer en outre l’insertion du plasmide recombinant pDM4 dans la région chromosomique spécifique par PCR à l’aide des amorces E et F. Cultivez les colonies recombinantes dans deux millilitres de LB avec 10% de saccharose et sans antibiotiques pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Après avoir préparé différentes dilutions de culture, plaquer 100 microlitres des cultures bactériennes et des dilutions sur plaque de gélose LB avec 10% de saccharose et incuber pendant la nuit à 30 degrés Celsius.Le lendemain, ramassez les colonies et transférez-les sur des plaques LB avec et sans chloramphénicol. Après les avoir incubés pendant la nuit à 30 degrés Celsius, sélectionnez les colonies sensibles au chloramphénicol. Analysez les colonies sensibles par PCR à l’aide de la paire d’amorces EF et sélectionnez les colonies dont le produit PCR est en corrélation avec la taille de la construction supprimée.Mettez une petite goutte de silicone aux quatre coins de la glissière de couverture et montez pendant la nuit la culture cultivée d’Aeromonas sur une glissière de couverture. Placez une glissière excavée sur la glissière de couverture et retournez la glissière à l’envers. Analysez la motilité de nage par microscopie optique à l’aide d’un microscope optique, puis transférez trois microlitres de la culture au centre d’une plaque de gélose molle.Incuber la plaque face vers le haut pendant la nuit entre 25 et 30 degrés Celsius. À l’aide d’une règle à la fin de l’incubation, mesurez la migration bactérienne du centre de la plaque vers la périphérie à travers la gélose. Culture Aeromonas souches pendant la nuit dans 900 millilitres TSB entre 25 et 30 degrés Celsius.Après centrifugation, suspendre la pastille dans 20 millilitres de 100 millimolaires de chlorure d’hydrogène Tris tampon de pH 7,8. Pour retirer les flagelles ancrés, trempez la suspension dans un vortex avec une barre de verre pendant trois à quatre minutes, puis passez de manière répétitive à travers une seringue de calibre 21. Abattez les bactéries par deux centrifugations consécutives à quatre degrés Celsius et recueillez le surnageant dans un tube séparé.Après ultracentrifugation du surnageant, suspendre la pastille dans 150 microlitres de chlorure d’hydrogène Tris de 100 millimolaires contenant deux millimolaires tampon EDTA. Transférer 150 microlitres de la fraction enrichie de flagelles dans un tube ultra clair à paroi mince et le remplir de 12 millilitres de solution de chlorure de césium. Ultracentrifugez le tube à 60 000 fois G pendant 48 heures à quatre degrés Celsius dans un rotor à godet oscillant.Recueillir la bande flagellaire dans le gradient de chlorure de césium avec une seringue et dialyze contre 100 millimolaires chlorure d’hydrogène Tris plus deux millimolaires EDTA suivi d’une analyse par électrophorèse et coloration bleu de Coomassie ou spectrométrie de masse. Dans la figure suivante, la voie WT est Aeromonas piscicola AH3. Les voies un à huit montrent des colonies sensibles au chloramphénicol de la deuxième recombinaison.ST est un marqueur hyper vésical de 1 Ko. Les voies un à trois et cinq à huit montrent les colonies avec le gène de type sauvage FGI4 comme voie WT. La quatrième voie montre une colonie avec le gène FGI4 supprimé. Les essais de microscopie optique ont montré que les modifications des flagelles polaires ou latéraux n’entraînent que des réductions des diamètres de migration, de sorte que les mutants AH-3 FGI et AH-3 FGI-4 ne montrent qu’une motilité réduite par rapport à la souche de type sauvage.La figure montre le flagelle polaire de AH-3 de la première voie, et les mutants sans mutants dans la région FGI de la voie deux et le gène FGI-4 de la voie trois, dans lequel les deux mutants ont des flagellules polaires de poids moléculaire inférieur à celui de la souche de type sauvage, ce qui suggère des altérations du flagelle glycane. Il est important de s’assurer que les mutations n’affectent pas les gènes en aval et conduisent à l’incapacité de l’assemblage des flagelles ou à l’incapacité des filaments de flagelles. Lorsque les changements dans les protéines de flagelline ne sont pas détectables, une analyse par spectrométrie de masse est nécessaire en utilisant la protéine totale des peptides de flagelline afin de connaître la masse de glycane.

Research

JoVE Journal

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Recherche

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