Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom National Research Council Canada für den Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) und für die Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) unterstützt.

Die schematische Darstellung des Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Bioinformatische Identifizierung von Flagellenglykosylierungsinseln (FGIs) in Aeromonas
<ol><li>Um die PseAc-Biosynthesecluster in den Aeromonas-Genomen zu identifizieren, verwenden Sie das tblastn-Tool aus der NCBI-Datenbank26. Rufen Sie zunächst orthologe Proteine zu PseC und PseI von A. piscicola AH-3 (Id...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

Der entscheidende frühe Schritt dieser Methode ist die Identifizierung von Regionen, die an der Glykosylierung von Flagellen und mutmaßlichen GTs beteiligt sind, da diese Enzyme eine hohe Homologie aufweisen und an vielen Prozessen beteiligt sind. Die bioinformatische Analyse von Aeromonas-Genomen in öffentlichen Datenbanken zeigt, dass diese Region an die polare Flagellenregion 2 angrenzt, die die Flagellin-Gene in vielen Stämmen enthält und Gene enthält, die an der Biosynthese von Pseudaminsäure<sup cla...

Die Proteinglykosylierung wurde sowohl bei Gram-positiven als auch bei Gram-negativen Bakterien beschrieben und besteht aus der kovalenten Bindung eines Glykans an eine Aminosäure-Seitenkette 1,2. In Prokaryoten geschieht dieser Prozess normalerweise über zwei wichtige enzymatische Mechanismen: O- und N-Glykosylierung 3. Bei der O-Glykosylierung wird das Glykan an die Hydroxylgruppe eines Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Rückstands gebunden. Bei der N-Glykosylierung ist das Glykan an den Seitenkettenamidstickstoff eines Asparagins (Asn)-Rests innerhalb der Tripeptidsequenzen Asn-X-Ser/Thr gebunden, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin sein könnte.
Glykane können lineare oder verzweigte Strukturen annehmen und bestehen aus Monosacchariden oder Polysacchariden, die kovalent durch glykosidische Bindungen verbunden sind. In Prokaryoten zeigen Glykane im Vergleich zu eukaryotischen Glykanen in der Regel eine Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur4. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene bakterielle Glykosylierungswege beschrieben, die sich darin unterscheiden, wie das Glykan zusammengesetzt und auf das Akzeptorprotein übertragen wird: sequentielle und en-bloc-Glykosylierung 5,6. Für die sequentielle Glykosylierung wird das komplexe Glykan durch sukzessive Zugabe von Monosacchariden direkt auf dem Protein aufgebaut. Bei der en-bloc-Glykosylierung wird ein vormontiertes Glykan von einem lipidgebundenen Oligosaccharid durch eine spezialisierte Oligosaccharyltransferase (OTase) auf das Protein übertragen. Es wurde gezeigt, dass beide Signalwege an N- und O-Glykosylierungsprozessen beteiligt sind7.
Die Proteinglykosylierung spielt eine Rolle bei der Modulation der physikalisch-chemischen und biologischen Eigenschaften von Proteinen. Das Vorhandensein eines Glykans kann beeinflussen, wie das Protein mit seinem Liganden interagiert, was sich auf die biologische Aktivität des Proteins auswirkt, aber auch die Proteinstabilität, Löslichkeit, Anfälligkeit für Proteolyse, Immunogenität und Mikroben-Wirt-Interaktionenbeeinflussen kann 8,9. Mehrere Glykosylierungsparameter, wie die Anzahl der Glykane, die Zusammensetzung des Glykans, die Position und der Bindungsmechanismus, könnten jedoch auch die Proteinfunktion und -struktur beeinflussen.
Glykosyltransferasen (GTs) sind die Schlüsselenzyme bei der Biosynthese komplexer Glykane und Glykokonjugate. Diese Enzyme katalysieren die glykosidische Bindungsbildung zwischen einem Zuckeranteil aus einem aktivierten Donormolekül und einem spezifischen Substratakzeptor. GTs können sowohl Nukleotide als auch Nicht-Nukleotide als Donormoleküle verwenden und auf verschiedene Substratakzeptoren wie Proteine, Saccharide, Nukleinsäuren und Lipideabzielen 10. Daher ist das Verständnis von GTs auf molekularer Ebene wichtig, um ihre Wirkmechanismen und Spezifität zu identifizieren, und ermöglicht auch das Verständnis, wie die Zuckerzusammensetzung von Glykanen, die relevante Moleküle modifizieren, mit der Pathogenität zusammenhängt. Die Carbohydrate Active Enzymdatenbank (CAZy)11 klassifiziert GTs nach ihrer Sequenzhomologie, was ein prädiktives Werkzeug darstellt, da in den meisten GT-Familien die strukturelle Falte und die Wirkmechanismen invariant sind. Vier Gründe machen es jedoch schwierig, die Substratspezifität vieler GTs vorherzusagen: 1) In Prokaryoten wurde kein klares Sequenzmotiv bestimmt, das die Substratspezifität bestimmt 12, 2) viele GTs und OTasen zeigen Substratpromiskuität13,14, 3) funktionelle GTs sind in rekombinanter Form schwer in hoher Ausbeute herzustellen und 4) die Identifizierung von Donor- und Akzeptorsubstraten ist komplex. Trotzdem haben neuere Mutagenesestudien es ermöglicht, signifikante Fortschritte im Verständnis katalytischer Mechanismen zu erzielen und die Bindung von GTs zu subtrahieren.
Bei Bakterien scheint die O-Glykosylierung häufiger anzutreffen als die N-Glykosylierung. Die O-Glykosylierungsstellen zeigen keine Konsenssequenz, und viele der O-glykosylierten Proteine sind sezernierte oder zelloberflächennahe Proteine, wie Flagelline, Pili oder Autotransporter1. Die Flagellinglykosylierung zeigt eine Variabilität in der Anzahl der Akzeptorstellen, der Glykanzusammensetzung und der Struktur. Zum Beispiel haben Burkholderia spp Flagelline nur eine Akzeptorstelle, während in Campylobacter jejuni Flagelline bis zu 19 Akzeptorstellen15,16 haben. Darüber hinaus ist das Glykan für einige Bakterien ein einzelnes Monosaccharid, während andere Bakterien heterogene Glykane besitzen, die von verschiedenen Monosacchariden kompromittiert sind, um Oligosaccharide zu bilden. Diese Heterogenität tritt sogar bei Stämmen derselben Art auf. Helicobacter-Flagelline werden nur durch Psedaminsäure (PseAc)17 modifiziert, und Campylobacter-Flagellanine können durch PseAc, die Acetamidino-Form der Psedaminsäure (PseAm) oder Legionaminsäure (LegAm) und Glykane, die von diesen Zuckern abgeleitet sind, mit Acetyl, N-Acetylglucosamin oder Propionsubstitutionen18,19 modifiziert werden. In Aeromonas werden Flagelline durch Glykane modifiziert, deren Zusammensetzung von einem einzelnen PseAc-Säurederivat bis zu einem Heteropolysaccharid20 reicht, und die Bindung von Glykanen an die Flagellinmonomere erfolgt immer über ein PseAc-Derivat.
Im Allgemeinen ist die Glykosylierung von Flagellinen für die Flagella-Filament-Assemblierung, Motilität, Virulenz und Wirtsspezifität unerlässlich. Während jedoch Flagellins von C. jejuni16, H. pylori17 und Aeromonas sp. 21 kann sich nicht zu Filament zusammensetzen, es sei denn, die Proteinmonomere sind glykosyliert, Pseudomonas spp. und Burkholderia spp. 15 erfordern keine Glykosylierung für die Flagellenmontage. Darüber hinaus beeinflussen bei einigen C. jejuni-Stämmen Veränderungen in der Zuckerzusammensetzung des Flagellenglykans die Bakterien-Wirt-Interaktion und können eine Rolle bei der Umgehung bestimmter Immunantwortenspielen 16. Autoagglutination ist ein weiteres phänotypisches Merkmal, das durch Modifikationen in der Zusammensetzung von Glykanen, die mit Flagellinen assoziiert sind, beeinflusst wird. Eine geringere Autoagglutination führt zu einer Verringerung der Fähigkeit, Mikrokolonien und Biofilm22 zu bilden. Bei einigen Bakterien war die Fähigkeit von Flagellen, eine entzündungsfördernde Reaktion auszulösen, mit der Flagellin-Glykosylierung verbunden. So induziert in P. aeruginosa glykosyliertes Flagellin eine höhere entzündungsfördernde Reaktion als unglykosyliertes23.
Aeromonas sind gramnegative Bakterien, die in der Umwelt allgegenwärtig sind, wodurch sie sich an der Schnittstelle aller One Health-Komponenten befinden können 24. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes polares Flagellum, das konstitutiv produziert wird. Mehr als die Hälfte der klinischen Isolate exprimieren auch laterales Flakellin, induzierbar in hochviskosen Medien oder Platten. Verschiedene Studien haben beide Flagellentypen mit den frühen Stadien der bakteriellen Pathogenese in Verbindung gebracht25. Während die bisher berichteten polaren Flagelline bei 5-8 Ser- oder Thr-Resten ihrer zentralen immunogenen Domänen O-glykosyliert sind, sind laterale Flagellaline nicht in allen Stämmen O-glykosyliert. Obwohl polare Flagellenglykane aus verschiedenen Stämmen eine Vielfalt in ihrer Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge20 aufweisen, hat sich gezeigt, dass der verbindende Zucker ein Pseudaminsäurederivat ist.
Das Ziel dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Gewinnung von Nullmutanten in spezifischen GTs oder chromosomalen Regionen, die GTs enthalten, zu beschreiben, um ihre Beteiligung an der Biosynthese relevanter Polysaccharide und an der bakteriellen Pathogenität sowie die Rolle des Glykans selbst zu analysieren. Als Beispiel identifizieren und löschen wir eine chromosomale Region, die GTs von Aeromonas enthält, um ihre Beteiligung an der polaren Flagellin-Glykosylierung festzustellen und die Rolle des Flagellin-Glykans zu analysieren. Wir zeigen, wie man ein spezifisches GT löscht, um seine Funktion bei der Biosynthese dieses Glykans und die Rolle des modifizierten Glykans zu bestimmen. Obwohl Aeromonas als Beispiel verwendet wird, kann das Prinzip verwendet werden, um Flagellenglykosylierungsinseln anderer gramnegativer Bakterien zu identifizieren und zu untersuchen und die Funktion von GTs zu analysieren, die an der Biosynthese anderer Glykane wie dem O-Antigen-Lipopolysaccharid beteiligt sind.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

Die Untersuchung der Glykosylierung in Prokaryoten ist ein schnell wachsendes Gebiet. Bakterien beherbergen auf ihrer Oberfläche unterschiedliche glykosylierte Strukturen, deren Glykane einen stammspezifischen Barcode bilden. Die assoziierten Glykane zeigen eine höhere Vielfalt in der Zuckerzusammensetzung und -struktur als die von Eukaryoten und sind wichtig für bakterielle Wirtserkennungsprozesse und die Interaktion mit der Umwelt. In pathogenen Bakterien waren Glykoproteine an verschiedenen Stadien des Infektionsprozesses beteiligt, und Glykanmodifikationen können bestimmte Funktionen von Glykoproteinen beeinträchtigen. Trotz der Fortschritte beim Verständnis der Zusammensetzung, Struktur und Biosynthesewege von Glykanen bleibt das Verständnis der Rolle von Glykoproteinen bei der Pathogenität oder der Wechselwirkung mit der Umwelt sehr begrenzt. Darüber hinaus werden bei einigen Bakterien die für die Proteinglykosylierung erforderlichen Enzyme mit anderen Polysaccharid-Biosynthesewegen, wie Lipopolysaccharid- und Kapsel-Biosynthesewegen, geteilt. Die funktionelle Bedeutung der Glykosylierung wurde in mehreren Bakterien durch Mutation spezifischer Gene aufgeklärt, von denen angenommen wird, dass sie am Glykosylierungsprozess beteiligt sind, und durch die Untersuchung seiner Auswirkungen auf die Expression des Zielglykoproteins und des modifizierenden Glykans. Mesophile Aeromonas haben ein einzelnes und O-glykosyliertes polares Flagellum. Flagellar-Glykane zeigen eine Vielfalt in der Kohlenhydratzusammensetzung und Kettenlänge zwischen Aeromonas-Stämmen. Alle bisher analysierten Stämme zeigen jedoch ein Pseudaminsäurederivat als verbindenden Zucker, der Serin- oder Threoninreste modifiziert. Das Pseudaminsäurederivat wird für die Anordnung polarer Flagellen benötigt, und sein Verlust hat Auswirkungen auf die Adhäsion, die Bildung von Biofilmen und die Besiedlung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll beschreibt, wie die Konstruktion von Nullmutanten verwendet werden kann, um die Beteiligung von Genen oder Genomregionen, die mutmaßliche Glykosyltransferasen enthalten, an der Biosynthese eines Flagellenglykans zu verstehen. Dazu gehört auch das Potenzial, die Funktion der beteiligten Glykosyltransferasen und die Rolle des Glykans zu verstehen. Dies wird erreicht, indem die Glykanmangel-Mutante mit der Wildtyp-Sorte verglichen wird.

Diese Methodik bietet ein effektives System zur Erzeugung von Nullmutanten in Genen oder chromosomalen Regionen von Aeromonas, die die Glykosylierung von Flagellen und die Rolle von Flagellenfilamenten beeinflussen können (Abbildung 1).
Das Protokoll beginnt mit der bioinformatischen Identifizierung von mutmaßlichen FGIs und den Genen, die GTs kodieren, die in dieser Region vorhanden sind. In Aeromonas basiert die chromosomale Lage von FGIs auf...

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Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Hier beschreiben wir die Konstruktion von Nullmutanten von Aeromonas in spezifischen Glykosyltransferasen oder Regionen, die Glykosyltransferasen enthalten, die Motilitätsassays und die Flagellenreinigung, die durchgeführt wurden, um die Beteiligung und Funktion ihrer kodierten Enzyme bei der Biosynthese eines Glykans zu bestimmen, sowie die Rolle dieses Glykans in der bakteriellen Pathogenese.

Erzeugung von Nullmutanten zur Aufklärung der Rolle bakterieller Glykosyltransferasen in der bakteriellen Motilität

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

So sind Neuminsäurederivate nur in pathogenen Bakterien vorhanden, aminiglycosylierte Flagellen enthalten diesen Zucker. Im Rahmen kann die Deletion der in den Genen enthaltenen Region helfen, Flagellenglykosylierungscluster zu finden. Diese Technik, die neueste spezifische Region oder Gene, wie Glykosyltransferasen, die eine hohe Homologie zwischen ihnen haben und an verschiedenen Prozessen beteiligt sind, und analysieren ihre Beteiligung am Flagellenglykosylierungsprozess.Diese Technik kann auch dazu beitragen, die Rolle von Glykosyltransferasen zu ermitteln, die an der Biosynthese relevanter Polysaccharide in pathogenen Bakterien beteiligt sind, sowie die Rolle von Genen, die für Proteine kodieren, die an der Flagellenbildung beteiligt sind. Maite Polo, eine Technikerin meines Labors, demonstriert das Verfahren. Entwerfen Sie zwei Paare von Primern, die DNA-Regionen vor und hinter dem ausgewählten Gen oder der zu löschenden Region amplifizieren.Die Primer A und D müssen am Fünf-Prime-Ende eine Restriktionsstelle für eine Endonuklease enthalten, die das Klonen in pDM4 ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass sich die Primer B und C innerhalb des zu löschenden Gens oder innerhalb des ersten und letzten Gens der zu löschenden Region befinden. Stellen Sie sicher, dass sich beide Primer im Rahmen befinden und sich zwischen fünf und sechs Codons innerhalb des Gens befinden.Stellen Sie sicher, dass beide Primer eine komplementäre Sequenz von 21 Basenpaaren am Fünf-Prime-Ende enthalten, um DNA-Amplikane AB und CD zu verbinden.Verwenden Sie 100 Nanogramm gereinigte chromosomale DNA als Vorlage in zwei Sätzen asymmetrischer PCRs mit AB- und CD-Primern, gefolgt von der Analyse der resultierenden Produkte in 1%Agarosegel. Reinigen und quantifizieren Sie die ausgeschnittenen Amplikone aus elektrophoretischem Gel. Mischen Sie 100 Nanogramm jedes Amplikons mit PCR-Reagenzien ohne Primer.Nachdem Sie es erweitert haben, fügen Sie A- und D-Primer hinzu und verstärken Sie sie als einzelnes Fragment. Als nächstes analysieren, reinigen und quantifizieren Sie die resultierenden Produkte wie zuvor beschrieben. Verdauen Sie ein Mikrogramm pDM4 und 400 Nanogramm AD-Amplicon mit einer Endonuklease.Kombinieren Sie das verdaute pDM4 mit AD-Amplicon bei einem molaren Vektor, um ein Verhältnis von eins zu vier einzufügen, und bereiten Sie die Ligationsreaktion vor. Inkubieren Sie über Nacht bei 20 Grad Celsius. Später deaktivieren Sie die T4-Ligase bei 70 Grad Celsius für 20 Minuten.Escherichia coli Stamm in Luria Bertani Miller Brühe impfen und bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U / min inkubieren, bis eine optische Dichte zwischen 0,4 und 0,6 beobachtet wird. Pelletieren Sie die Bakterienkultur durch Zentrifugation bei 5.000 mal G und vier Grad Celsius für 15 Minuten. Suspendieren Sie das Pellet in gekühltem destilliertem Wasser und wiederholen Sie den Reinigungsvorgang noch zwei weitere Male.Übertragen Sie die Bakteriensuspension in Mikrofugenröhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation bei 14.000 mal G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Nachdem Sie das Pellet in gekühltem Wasser wieder suspendiert haben, fügen Sie etwa 3,5 Mikroliter der Ligationsmischung hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis. Überführen Sie den Inhalt in eine gekühlte Elektroporationsküvette mit zwei Millimetern Spalt.Nach der Elektroporation das SOC-Medium zugeben und den Inhalt in ein Kulturröhrchen überführen. Eine Stunde bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 200 U/min inkubieren. Platte die transformierten Zellen auf LB-Agarplatten ergänzt mit Chloramphenicol.Überprüfen Sie das Einfügen des Löschkonstrukts in pDM4 durch PCR mit Primern, die die pDM4-Klonierungsseite flankieren. Bereiten Sie über Nacht Kulturen vor, damit der Empfänger Aeromonas Rifampicin resistent und zwei verschiedene Stämme von Escherichia coli ist. Der Spenderstamm mit dem rekombinanten Plasmid pDM4 und der Helferstamm mit dem Plasmid PRK 2073 bei 30 Grad Celsius.Suspendieren Sie die gleiche Anzahl von Kolonien der Spender-, Empfänger- und Helferstämme in drei LB-Röhren mit 150 Mikrolitern LB. Dann mischen Sie auf einer LB-Agarplatte ohne Antibiotika die drei bakteriellen Suspensionen in zwei Tropfen bei einem Verhältnis von Empfänger zu Helfer zu Spender von fünf zu eins zu eins und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 30 Grad Celsius nach oben. Ernten Sie Bakterien, indem Sie einen Milliliter LB-Brühe in die LB-Agarplatte geben. Die bakterielle Suspension in ein konisches 1,5-Milliliter-Mikrofugenröhrchen und einen kräftigen Wirbel überführen.100 Mikroliter der Bakteriensuspension auf LB-Agarplatten mit Rifampicin und Chloramphenicol verteilen. Drehen Sie 200 Mikroliter und 600 Mikroliter der Proben aus, suspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern LB-Brühe und Platte auf LB-Agar mit Rifampicin und Chloramphenicol, gefolgt von Inkubation. Führen Sie einen Oxidase-Test durch, um zu bestätigen, dass es sich bei den Kolonien um Aeromonas handelt.Weiterhin wird die Insertion von pDM4-rekombinantem Plasmid in die spezifische chromosomale Region durch PCR unter Verwendung der E- und F-Primer bestätigt. Züchten Sie die rekombinanten Kolonien in zwei Millilitern LB mit 10% Saccharose und ohne Antibiotika über Nacht bei 30 Grad Celsius. Nach der Herstellung verschiedener Kulturverdünnungen werden 100 Mikroliter der Bakterienkulturen und Verdünnungen auf LB-Agarplatte mit 10% Saccharose beschichtet und über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert.Am nächsten Tag holen Sie die Kolonien ab und übertragen sie auf LB-Platten mit und ohne Chloramphenicol. Nachdem Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius inkubiert haben, wählen Sie die Chloramphenicol-empfindlichen Kolonien aus. Analysieren Sie die empfindlichen Kolonien mittels PCR mit dem EF-Primer-Paar und wählen Sie die Kolonien aus, deren PCR-Produkt mit der Größe des gelöschten Konstrukts korreliert.Legen Sie einen kleinen Tropfen Silikon in die vier Ecken der Abdeckfolie und montieren Sie die über Nacht gewachsene Kultur von Aeromonas auf einer Abdeckfolie. Legen Sie eine ausgegrabene Rutsche auf die Abdeckrutsche und drehen Sie die Rutsche auf den Kopf. Analysieren Sie die Schwimmmotilität durch Lichtmikroskopie mit einem optischen Mikroskop und übertragen Sie dann drei Mikroliter der Kultur auf die Mitte einer weichen Agarplatte.Brüten Sie die Platte über Nacht zwischen 25 und 30 Grad Celsius aus. Messen Sie mit einem Lineal am Ende der Inkubation die bakterielle Migration vom Plattenzentrum zur Peripherie durch den Agar. Culture Aeromonas belastet über Nacht in 900 Milliliter TSB zwischen 25 und 30 Grad Celsius.Nach der Zentrifugation suspendieren Sie das Pellet in 20 Milliliter 100 millimolar Tris-Chlorwasserstoffpuffer mit einem pH-Wert von 7,8. Um die verankerte Flagelle zu entfernen, steilen Sie die Aufhängung in einem Wirbel mit einer Glasstange für drei bis vier Minuten aus und gehen Sie dann wiederholt durch eine 21-Gauge-Spritze. Pelletieren Sie die Bakterien durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationen bei vier Grad Celsius und sammeln Sie den Überstand in einem separaten Röhrchen.Nach dem Ultrazentrifugieren des Überstands suspendieren Sie das Pellet in 150 Mikrolitern 100 millimolärem Tris-Chlorwasserstoff, das zwei millimolare EDTA-Puffer enthält. Übertragen Sie 150 Mikroliter der angereicherten Fraktion der Flagellen auf ein dünnwandiges ultraklares Rohr und füllen Sie es mit 12 Millilitern Cäsiumchloridlösung. Ultrazentrifugieren Sie das Rohr bei 60.000 mal G für 48 Stunden bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Eimerrotor.Sammeln Sie das Flagellenband mit einer Spritze in den Cäsiumchloridgradienten und dialysieren Sie gegen 100 Millimolar Tris-Chlorwasserstoff plus zwei millimolare EDTA, gefolgt von einer Analyse durch Elektrophorese und Coomassie-Blaufärbung oder Massenspektrometrie. In der folgenden Abbildung ist Bahn WT Aeromonas piscicola AH3. Die Bahnen eins bis acht zeigen Chloramphenicol-empfindliche Kolonien der zweiten Rekombination.ST ist Hyperblase 1KB Marker. Die Bahnen eins bis drei und fünf bis acht zeigen die Kolonien mit dem Wildtyp-FGI4-Gen als Lane WT. Spur vier zeigt eine Kolonie mit dem gelöschten FGI4-Gen. Lichtmikroskopische Assays zeigten, dass polare oder laterale Flagellenmodifikationen nur zu einer Verringerung der Migrationsdurchmesser führen, so dass AH-3 FGI-Mutanten und AH-3 FGI-4-Mutanten nur eine reduzierte Motilität in Bezug auf den Wildtypstamm zeigen.Die Abbildung zeigt das polare Flagellum von AH-3 der ersten Spur und die No-Mutanten in der FGI-Region der zweiten und das FGI-4-Gen der dritten Spur, wobei beide Mutanten polare Flagellaline mit niedrigerem Molekulargewicht als der Wildtypstamm aufweisen, was auf Veränderungen im Flagellenglykan hindeutet. Es ist wichtig sicherzustellen, dass Mutationen keine nachgeschalteten Gene beeinflussen und die Unfähigkeit zur Flagellenanordnung oder die Unfähigkeit von Filamenten von Flagellen führen. Wenn Veränderungen in Flagellinproteinen nicht nachweisbar sind, ist eine massenspektrometrische Analyse unter Verwendung des Gesamtproteins von Flagellinpeptiden erforderlich, um die Glykanmasse zu kennen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Verfahren zur Inhibierung Bakterielle Pyomelanin Produktion und Bestimmen der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisierung von Twitching Motilität und Charakterisierung der Rolle des<em&gt; Pilg</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Assays für die Untersuchung der Rolle von Vitronectin in bakterielle Adhäsion und Serum-Widerstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...