Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

この研究は、カナダ国立研究評議会、プラン・ナシオナル・デ・イ・イ・コンペティティビダッド(スペイン、エコノミア・イ・コンペティビダド大臣)とカタルーニャ総局(Center de Referència en Biotecnologia)の支援を受けました。

手順の概略図を 図1に示します。
1. アエロモナスにおける鞭毛グリコシル化島(FGI)のバイオインフォマティクス同定
<ol><li>アエロモナスゲノム中のPseAc生合成クラスターを同定するには、NCBIデータベース26のtblastnツールを使用する。まず、配列決定されたアエロモナス株のデータベースから...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacteria:+sweeter+than+ever.">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Never+say+never+again:+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria.">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li><li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+sugars+sticking+out.">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li><li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum.">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li><li>Kov&#225;cs, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction.">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703 (1956).</li><li>Fulton, K. M., Mendoza-Barber&#225;, E., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+(Serotype+O11).">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li><li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology,+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida.">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).</li><li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

この方法の重要な初期段階のステップは、鞭毛および推定GTのグリコシル化に関与する領域の同定であり、これらの酵素は高い相同性を示し、多くのプロセスに関与している。公開データベースにおける アエロモナ スゲノムのバイオインフォマティクス解析は、この領域が、多くの株のフラジェリン遺伝子を含み、プセウダミン酸の生合成に関与する遺伝子を含む極性鞭毛領域2に隣?...

タンパク質グリコシル化は、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方において記載されており、アミノ酸側鎖1,2へのグリカンの共有結合からなる。原核生物では、このプロセスは、通常、2つの主要な酵素機構を介して起こる:O−およびN−グリコシル化3。O-グリコシル化において、グリカンはセリン(Ser)またはスレオニン(Thr)残基のヒドロキシル基に結合している。N-グリコシル化において、グリカンはトリペプチド配列Asn-X-Ser/Thr内のアスパラギン(Asn)残基の側鎖アミド窒素に結合し、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る。
グリカンは、直鎖状または分枝鎖状の構造を採用することができ、グリコシド結合によって共有結合で結合された単糖または多糖類から構成される。原核生物において、グリカンは通常、真核生物グリカン4と比較して糖組成および構造において多様性を示す。さらに、グリカンが組み立てられ、アクセプタータンパク質に移される方法において異なる2つの異なる細菌グリコシル化経路が記載されている:逐次的および 一括 グリコシル化5、6。逐次グリコシル化の場合、複合糖鎖は、単糖の連続的な付加によってタンパク質上に直接構築される。 エンブロック グリコシル化では、予め組み立てられたグリカンが、特殊なオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)によって脂質結合オリゴ糖からタンパク質に転移される。両方の経路が 、N− および O−グリコシル化プロセスに関与することが示されている7。
タンパク質のグリコシル化は、タンパク質の物理化学的および生物学的特性を調節する役割を有する。グリカンの存在は、タンパク質がそのリガンドとどのように相互作用するかに影響を与える可能性があり、これはタンパク質の生物学的活性に影響を与えるが、タンパク質の安定性、溶解性、タンパク質分解に対する感受性、免疫原性、および微生物と宿主の相互作用にも影響し得る8,9。しかし、グリカンの数、グリカン組成、位置、および結合機構などのいくつかのグリコシル化パラメータも、タンパク質の機能および構造に影響を及ぼす可能性がある。
糖転移酵素(GT)は、複合グリカンおよび複合糖質の生合成における重要な酵素である。これらの酵素は、活性化されたドナー分子からの糖部分と特定の基質アクセプターとの間のグリコシド結合形成を触媒する。GTsは、ドナー分子としてヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの両方を使用し、タンパク質、糖類、核酸、および脂質などの異なる基質アクセプターを標的とすることができる10。したがって、GTを分子レベルで理解することは、その作用機序や特異性を解明するために重要であり、また、関連する分子を修飾する糖鎖の糖組成が病原性にどのように関連しているかを理解することを可能にする。炭水化物活性酵素データベース(CAZy)11は、GTを配列相同性に従って分類し、ほとんどのGTファミリーにおいて構造的フォールドおよび作用機序が不変であるため、予測ツールを提供する。しかしながら、多くのGTの基質特異性を予測することが困難な理由は、1)原核生物において基質特異性を決定する明確な配列モチーフが決定されていない、12)多くのGTおよびOTaseが基質混交性を示す13、14、3)機能的GTsが組換え形態で高収率で生産することが困難である、および4)ドナーおよびアクセプター基質の両方の同定が複雑である。それにもかかわらず、最近の突然変異誘発研究は、触媒機構の理解において著しい進歩を得て、GTの結合を差し引くことを可能にした。
細菌では、O-グリコシル化はN-グリコシル化よりも一般的であるようである。O-グリコシル化部位はコンセンサス配列を示さず、O-グリコシル化タンパク質の多くは、フラジェリン、ピリ、または自己輸送体などの分泌タンパク質または細胞表面タンパク質1である。クラジェリングリコシル化は、アクセプター部位の数、グリカン組成、および構造に変動性を示す。例えば、バークホルデリア属の鞭毛虫は1つのアクセプター部位しか持たないが、カンピロバクター・ジェジュニでは、鞭毛虫は19のアクセプター部位15,16個しか持たない。さらに、いくつかの細菌にとって、グリカンは単一の単糖であり、他の細菌はオリゴ糖を形成するために異なる単糖の妥協した不均一なグリカンを有する。この異原性は、同じ種の株間でも生じる。ヘリコバクター鞭毛虫はプセウダミン酸(PseAc)17によってのみ修飾され、カンピロバクター鞭毛虫はPseAc、プセウダミン酸(PseAm)またはレジオナミン酸(LegAm)のアセトアミジノ型、およびアセチル、N-アセチルグルコサミン、またはプロピオン置換18,19を有するこれらの糖に由来するグリカンによって修飾することができる。アエロモナスでは、鞭毛虫は、その組成が単一のPseAc酸誘導体からヘテロ多糖20までの範囲のグリカンによって修飾され、フラジェリンモノマーへのグリカンの結合は常にPseAc誘導体を介して行われる。
一般に、鞭毛虫のグリコシル化は、鞭毛フィラメントアセンブリ、運動性、ビルレンス、および宿主特異性に不可欠である。しかし、 C. jejuni16、 H. pylori17、 および Aeromonas sp.21は 、タンパク質モノマーがグリコシル化されない限り、フィラメントに組み立てることができない、 シュードモナス 属および バークホルデリア属。15は 鞭毛集合のためにグリコシル化を必要としない。さらに、いくつかの C. jejuni 株では、鞭毛グリカンの糖組成の変化が細菌−宿主相互作用に影響を及ぼし、特定の免疫応答を回避する上で役割を果たし得る16。自己凝集は、フラジェリンに関連するグリカンの組成における修飾によって影響を受ける別の表現型特性である。より低い自己凝集は、マイクロコロニーおよびバイオフィルム22を形成する能力の低下をもたらす。いくつかの細菌において、炎症促進反応を誘発する鞭毛の能力は、鞭毛グリコシル化と関連していた。したがって、 緑膿菌において、グリコシル化フラジェリンは、非グリコシル化23よりも高い炎症誘発性応答を誘導する。
アエロモナは、環境中に遍在するグラム陰性菌であり、これにより、それらがすべてのOne Health成分24の界面に存在することを可能にする。中温性アエロモナスは、恒常的に産生される単一の極性鞭毛を有する。臨床分離株の半分以上はまた、高粘度媒体またはプレート中で誘導可能な側方鞭毛を発現する。異なる研究は、両方の鞭毛タイプを細菌病因の初期段階と関連付けている25。現在までに報告された極性鞭毛は、その中心免疫原性ドメインの5〜8 SerまたはThr残基でO-グリコシル化されているが、側方鞭毛はすべての株においてO-グリコシル化されていない。異なる株由来の極性鞭毛グリカンはそれらの糖鎖組成および鎖長20において多様性を示すが、連結糖はプセウダミン酸誘導体であることが示された。
この原稿の目的は、GTを含む特定のGTまたは染色体領域におけるヌル変異体を取得し、関連する多糖類の生合成および細菌病原性におけるそれらの関与、ならびにグリカン自体の役割を分析する方法を説明することである。一例として、 アエロモナスの GTを含む染色体領域を同定・除去し、極性フラジェリングリコシル化への関与を確立し、フラジェリングリカンの役割を解析します。我々は、このグリカンの生合成におけるその機能を確立するために特定のGTを削除する方法と修飾グリカンの役割を示す。 アエロモナス を例にとりますが、この原理は、他のグラム陰性菌の鞭毛グリコシル化島を同定して研究し、O抗原リポ多糖などの他のグリカンの生合成に関与するGTの機能を分析するために使用できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

原核生物におけるグリコシル化の研究は急速に成長している分野です。細菌は、その表面に異なるグリコシル化構造を有し、そのグリカンは株特異的バーコードを構成する。関連するグリカンは、真核生物のグリカンよりも糖組成および構造において高い多様性を示し、細菌宿主認識プロセスおよび環境との相互作用において重要である。病原性細菌では、糖タンパク質は感染プロセスのさまざまな段階に関与しており、糖鎖修飾は糖タンパク質の特定の機能を妨げる可能性がある。しかしながら、糖鎖の組成、構造、および生合成経路の理解においてなされた進歩にもかかわらず、病原性または環境との相互作用における糖タンパク質の役割の理解は非常に限られている。さらに、いくつかの細菌では、タンパク質グリコシル化に必要な酵素は、リポ多糖およびカプセル生合成経路などの他の多糖生合成経路と共有される。グリコシル化の機能的重要性は、グリコシル化プロセスに関与すると考えられる特定の遺伝子の変異と、それが標的糖タンパク質および修飾グリカンの発現に及ぼす影響の研究を通じて、いくつかの細菌において解明されてきた。中温性 アエロモナスは 、単一および O-グリコシル化極性鞭毛を有する。べん毛グリカンは、 アエロモナ ス株間の炭水化物組成および鎖長の多様性を示す。しかしながら、現在までに分析された全ての株は、セリンまたはスレオニン残基を修飾する連結糖としてプセウダミン酸誘導体を示す。プセウダミン酸誘導体は極性鞭毛集合に必要であり、その喪失は接着、バイオフィルム形成、およびコロニー形成に影響を与える。この記事で詳述するプロトコルは、鞭毛グリカンの生合成における推定糖転移酵素を含む遺伝子またはゲノム領域の関与を理解するために、ヌル変異体の構築をどのように使用できるかを説明しています。これには、関与する糖転移酵素の機能および糖鎖の役割を理解する可能性が含まれる。これは、グリカン欠損変異体を野生型株と比較することによって達成されるであろう。

この方法論は、鞭毛グリコシル化および鞭毛フィラメントの役割に影響を及ぼす可能性のある アエロモナ スの遺伝子または染色体領域においてヌル変異体を生成するための効果的なシステムを提供する(図1)。
このプロトコルは、推定FGIのバイオインフォマティクス同定から始まり、GTをコードする遺伝子がこの領域に存在する。アエロモ...

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Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

ここでは、特定の糖転移酵素または糖転移酵素を含む領域における アエロモナ スのヌル変異体の構築、グリカンの生合成におけるそれらのコードされた酵素の関与および機能を確立するために行われる運動性アッセイ、および鞭毛精製、ならびに細菌病因におけるこのグリカンの役割について説明する。

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

そこでニュールミン酸誘導体は病原性細菌にのみ存在し、アミニグリコシル化鞭毛はこの糖を含んでいる。遺伝子に含まれる領域のインフレーム欠失は、鞭毛グリコシル化クラスターを見つけるのを助けることができる。この技術は、それらの間で高い相同性を有する糖転移酵素などの最新の特定の領域または遺伝子が異なるプロセスに関与しており、鞭毛糖鎖付加プロセスへのその関与を解析するものである。この技術は、病原性細菌における関連する多糖類の生合成に関与する糖転移酵素の役割、および鞭毛形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子の役割を見出すのにも役立つ可能性がある。手順を実演すると、私の研究室の技術者であるマイテポロになります。選択した遺伝子または欠失する領域の上流および下流のDNA領域を増幅する2対のプライマーを設計する。プライマーAおよびDは、5つのプライム末端に、pDM4におけるクローニングを可能にするエンドヌクレアーゼの制限部位を含む必要がある。プライマーBおよびCが、欠失する遺伝子内または欠失する領域の最初と最後の遺伝子の内側にあることを確認します。両方のプライマーがフレーム内にあり、遺伝子内の5〜6つのコドンの間に配置されていることを確認します。両方のプライマーが 5 つのプライム末端に 21 塩基対の相補配列を含むことを確認し、DNA アンプリコン AB および CD.AB プライマーと CD プライマーを使用した 2 組の不斉 PCR で 100 ナノグラムの精製染色体 DNA を鋳型として使用し、その後、得られた生成物を 1%アガロースゲルで分析します。電気泳動ゲルから切り出したアンプリコンを精製および定量する。各アンプリコン100ナノグラムをプライマーなしでPCR試薬と混合する。それを拡張した後、AプライマーとDプライマーを加え、それらを単一の断片として増幅する。次に、前述のように、得られた生成物を分析、精製、定量化します。1マイクログラムのpDM4および400ナノグラムのADアンプリコンをエンドヌクレアーゼで消化する。消化したpDM4とADアンプリコンをモルベクターで結合させ、挿入比を1対4にし、ライゲーション反応を調製する。摂氏20度で一晩インキュベートする。その後、T4リガーゼを摂氏70度で20分間不活性化する。エシェリヒア・コリ株をルリア・ベルタニ・ミラー培養液に接種し、0.4~0.6の光学密度が観察されるまで200RPMで振とうしながら摂氏30度でインキュベートします。ペレットは、細菌培養物を5,000倍Gおよび4°Cで15分間遠心分離することによって行う。ペレットをチルド蒸留水に懸濁し、洗浄工程をさらに2回繰り返す。細菌懸濁液をマイクロフュージチューブに移し、14, 000回Gおよび4°Cで5分間遠心分離を繰り返す。ペレットを冷水に再懸濁した後、約3.5マイクロリットルのライゲーション混合物を加え、氷上で5分間インキュベートする。内容物を冷やした2ミリメートルギャップエレクトロポレーションキュベットに移す。エレクトロポレーション後、SOC培地を加え、内容物を培養管に移す。摂氏30度で1時間インキュベートし、200RPMで振とうする。形質転換細胞をクロラムフェニコールを添加したLB寒天プレート上にプレートする。pDM4クローニング側に隣接するプライマーを用いたPCRによりpDM4への欠失構築物の挿入を確認する。レシピエントアエロモナス株がリファンピシン耐性となるように一晩培養物を準備し、大腸菌の2つの異なる株を準備する。ドナー株をpDM4組換えプラスミドで、ヘルパー株をPRK 2073プラスミドを摂氏30度で得た。ドナー、レシピエント、およびヘルパー株の同数のコロニーを、150マイクロリットルのLBを有する3つのLBチューブに懸濁させる。次いで、抗生物質を含まないLB寒天プレート上で、3つの細菌懸濁液を2滴に混合し、レシピエント対ヘルパー対ドナー比が5対1対1で、プレートを摂氏30度で一晩上を向いてインキュベートした。LB寒天プレートに1ミリリットルのLBブロスを加えて細菌を採取する。細菌懸濁液を円錐形の1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、激しく渦巻きます。リファンピシンおよびクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上に100マイクロリットルの細菌懸濁液を広げる。200マイクロリットルおよび600マイクロリットルのサンプルをスピンダウンし、ペレットを100マイクロリットルのLBブロスに懸濁し、リファンピシンおよびクロラムフェニコールを含むLB寒天上にプレートし、続いてインキュベーションした。オキシダーゼ試験を行い、コロニーがアエロモナスであることを確認する。さらにEプライマー及びFプライマーを用いたPCRにより特異的染色体領域へのpDM4組換えプラスミドの挿入を確認する。組換えコロニーを2ミリリットルのLBで10%スクロースで抗生物質なしで摂氏30度で一晩成長させる。異なる培養希釈液を調製した後、100マイクロリットルの細菌培養物および希釈物を10%スクロースでLB寒天プレート上にプレートし、摂氏30度で一晩インキュベートした。翌日、コロニーを拾い上げ、クロラムフェニコールの有無にかかわらずLBプレートに移す。それらを摂氏30度で一晩インキュベートした後、クロラムフェニコール感受性コロニーを選択する。EFプライマーペアを用いたPCRにより感受性コロニーを分析し、PCR産物が欠失した構築物のサイズと相関するコロニーを選択する。カバースライドの四隅にシリコーンの小さな滴を入れ、カバースライドに一晩成長したアエロモナスの培養物をマウントします。カバースライドの上に掘削スライドを置き、スライドを裏返します。光学顕微鏡を用いた光学顕微鏡により遊泳運動性を分析し、次いで培養物3マイクロリットルを軟寒天プレートの中心に移す。プレートを摂氏25〜30度の間で一晩上向きにインキュベートします。インキュベーションの最後に定規を用いて、プレート中心から寒天を通る周辺への細菌移動を測定する。培養アエロモナスは、摂氏25〜30度の間の900ミリリットルTSBで一晩株を培養する。遠心分離後、ペレットを20ミリリットルの100ミリモルのトリス塩化水素緩衝液にpH7.8の懸濁させる。固定された鞭毛を除去するには、ガラスバーで渦の中で懸濁液を3〜4分間透けてから、21ゲージシリンジに繰り返し通します。摂氏4度で2回連続遠心分離により細菌をペレット化し、上清を別のチューブに集めた。上清を超遠心分離した後、ペレットを150マイクロリットルの100ミリモルのトリス塩化水素2ミリモルEDTA緩衝液を含む緩衝液に懸濁する。鞭毛の濃縮画分の150マイクロリットルを薄壁の超透明チューブに移し、12ミリリットルの塩化セシウム溶液で満たす。チューブを60,000倍Gで超遠心分離機で、スイングバケットローターで摂氏4度で48時間処理します。鞭毛バンドをシリンジで塩化セシウム勾配に集め、100ミリモルの塩化トリス水素と2ミリモルのEDTAを比べて透析し、電気泳動とクーマシーブルー染色または質量分析による分析を行った。次の図では、レーンWTはアエロモナス・ピシコーラAH3です。レーン1〜8は、第2の組換えのクロラムフェニコール感受性コロニーを示す。STは1KBマーカーのハイパーブラダーである。レーン1~3及び5~8は、野生型FGI4遺伝子を有するコロニーをレーンWTとして示す。レーン4は、欠失したFGI4遺伝子を有するコロニーを示す。光学顕微鏡アッセイは、極性または側方鞭毛修飾が遊走直径の減少のみをもたらすことを示し、したがって、AH−3 FGI変異体およびAH−3 FGI−4変異体は、野生型株に関連して減少した運動性のみを示す。図はレーン1のAH-3由来の極性鞭毛を示しており、レーン2のFGI領域に変異体がなく、レーン3のFGI-4遺伝子では、両変異体は野生株よりも分子量の低い極性鞭毛を有しており、鞭毛糖の変化を示唆している。突然変異が下流の遺伝子に影響を与えず、鞭毛アセンブリ不能または鞭毛のフィラメントの不能を招かないようにすることが重要です。フラジェリンタンパク質の変化が検出できない場合、グリカン質量を知るためにフラジェリンペプチドの全タンパク質を用いた質量分析が必要である。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

免疫・感染学

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

に感染したマウスにおける細菌負荷と免疫応答の測定リステリア菌</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

定性的にオーバーレイアッセイを使用すると、肺炎球菌バクテリオシンに対する細菌の産生と感度を測定します

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em&gt; PilG</em&gt;で<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

細菌の付着と血清抵抗性ビトロネクチンの役割を研究するための試金

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...