Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

이 연구는 캐나다 국립 연구위원회 (Plan Nacional de I + D) (Ministerio de Economía y Competitividad, Spain) 및 Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia)의 지원을 받았다.

절차의 개략적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 에어로모나스에서 편모 글리코실화 섬 (FGIs)의 생물 정보학 식별
<ol><li>Aeromonas 게놈에서 PseAc 생합성 클러스터를 확인하려면, NCBI 데이터베이스(26)로부터의 tblastn 도구를 사용한다. 먼저, 서열화된 Aeromonas 균주의 데이터베이스로부터 A. piscic...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

이 방법의 중요한 초기 단계는 편모 및 추정 GT의 글리코실화에 관여하는 영역을 확인하는 것인데, 이는 이들 효소가 높은 상동성을 보이고 많은 과정에 관여하기 때문이다. 공공 데이터베이스에서 Aeromonas 게놈의 생물 정보학 분석은이 영역이 많은 균주의 편모 유전자를 포함하고 pseudaminic acid27의 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 극성 편모 영역 2에 인접 해 있음을 ?...

단백질 글리코실화는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 둘 다에 기술되어 있으며, 아미노산 측쇄 1,2에 대한 글리칸의 공유 부착으로 구성된다. 원핵생물에서, 이 과정은 보통 두 가지 주요 효소적 메카니즘을 통해 발생한다: O- 및 N-글리코실화3. O-글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기의 히드록실기에 부착된다. N-글리코실화에서, 글리칸은 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser/Thr 내의 아스파라긴(Asn) 잔기의 측쇄 아미드 질소에 부착되며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.
글리칸은 선형 또는 분지 구조를 채택 할 수 있으며 글리코시드 결합에 의해 공유적으로 연결된 단당류 또는 다당류로 구성됩니다. 원핵생물에서, 글리칸은 보통 진핵 글리칸4과 비교하여 설탕 조성 및 구조에서 다양성을 나타낸다. 더욱이, 글리칸이 조립되고 수용체 단백질로 전달되는 방법에 있어서 상이한 두 개의 상이한 박테리아 글리코실화 경로가 기술되었다: 순차적 및 엔블럭 글리코실화 5,6. 순차적 글리코실화를 위해, 복합 글리칸은 단당류의 연속적인 첨가에 의해 단백질 상에 직접 구축된다. 엔블럭 글리코실화에서, 미리 조립된 글리칸은 특수화된 올리고사카릴트랜스퍼라제(OTase)에 의해 지질-연결된 올리고당으로부터 단백질로 전사된다. 두 경로 모두 N- 및 O-글리코실화 과정7에 관여하는 것으로 나타났다.
단백질 글리코실화는 단백질의 물리화학적 및 생물학적 특성을 조절하는 역할을 한다. 글리칸의 존재는 단백질이 리간드와 상호 작용하는 방식에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 만 단백질 안정성, 용해도, 단백질 분해에 대한 감수성, 면역원성 및 미생물 - 숙주 상호 작용 8,9에도 영향을 줄 수 있습니다. 그러나, 글리칸의 수, 글리칸 조성, 위치 및 부착 메카니즘과 같은 몇몇 글리코실화 파라미터는 또한 단백질 기능 및 구조에 영향을 미칠 수 있다.
글리코실트랜스퍼라제(GTs)는 복합 글리칸과 글리코컨쥬게이트의 생합성에 있어서 핵심 효소이다. 이들 효소는 활성화된 공여체 분자로부터의 당 모이어티와 특정 기질 수용체 사이의 글리코시드 결합 형성을 촉매한다. GTs는 공여체 분자로서 뉴클레오티드 및 비뉴클레오티드 둘 다를 사용할 수 있고, 단백질, 당류, 핵산 및 지질(10)과 같은 상이한 기질 수용체를 표적으로 할 수 있다. 따라서 분자 수준에서 GT를 이해하는 것은 작용 메커니즘과 특이성을 확인하는 데 중요하며 관련 분자를 변형시키는 글리 칸의 당 조성이 병원성과 어떻게 관련되어 있는지 이해할 수 있습니다. 탄수화물 활성 효소 데이터베이스 (CAZy)11은 GT를 서열 상동성에 따라 분류하며, 이는 대부분의 GT 패밀리에서 구조적 폴드 및 작용 메커니즘이 불변하기 때문에 예측 도구를 제공합니다. 그러나, 많은 GTs의 기질 특이성을 예측하기 어려운 네 가지 이유: 1) 원핵생물에서 기질 특이성을 결정하는 명확한 서열 모티프가 결정되지 않은12, 2) 많은 GTs 및 OTases는 기질 난잡함을 나타내고13,14, 3) 기능적 GTs는 재조합 형태로 고수율로 생산하기 어렵고 4) 공여체 및 수용체 기질 둘 다의 확인은 복잡하다. 그럼에도 불구하고, 최근의 돌연변이 유발 연구는 촉매 메커니즘의 이해와 GT의 뺄셈 결합에 상당한 진보를 얻는 것을 가능하게했다.
박테리아에서, O-글리코실화는 N-글리코실화보다 더 널리 퍼진 것으로 보인다. O-글리코실화 부위는 컨센서스 서열을 나타내지 않으며, 많은 O-글리코실화 단백질이 분비되거나 세포-표면 단백질, 예컨대 편모, 필리, 또는 자가수송체1. 편모 글리코실화는 수용체 부위의 수, 글리칸 조성, 및 구조에서 가변성을 나타낸다. 예를 들어, Burkholderia spp flagellins에는 하나의 수용체 사이트 만 있고 Campylobacter jejuni에서는 flagellins가 19 개의 수락자 사이트15,16을 가지고 있습니다. 또한, 일부 박테리아의 경우, 글리칸은 단일 단당류이며, 다른 박테리아는 올리고당을 형성하기 위해 다른 단당류로 손상된 이질적인 글리칸을 가지고 있습니다. 이러한 이질성은 동일한 종의 균주들 사이에서도 발생한다. 헬리코박터 편모는 pseudaminic acid (PseAc)17에 의해서만 변형되고, 캄필로박터 편모는 PseAc, 아세타미디노 형태의 pseudaminic acid (PseAm) 또는 레지오나민산 (LegAm)에 의해 변형될 수 있고, 이들 당으로부터 유래된 글리칸은 아세틸, N-아세틸글루코사민, 또는 프로피온성 치환18,19로 유도된다. Aeromonas에서 편모는 단일 PseAc 산 유도체에서 헤테로 다당류20에 이르는 조성의 글리 칸에 의해 변형되며 편모 단량체에 글리 칸을 부착하는 것은 항상 PseAc 유도체를 통해 이루어집니다.
일반적으로, 편모의 글리코실화는 편모 필라멘트 조립, 운동성, 독성, 및 숙주 특이성에 필수적이다. 그러나, C. jejuni16, H. pylori17 및 Aeromonas sp의 편모가 있는 동안. 도 21은 단백질 단량체가 글리코실화되지 않는 한 필라멘트로 조립할 수 없으며, 슈도모나스 spp. 및 Burkholderia spp. 도 15는 편모 조립을 위한 글리코실화를 필요로 하지 않는다. 더욱이, 일부 C. jejuni 균주에서, 편모 글리칸의 당 조성의 변화는 박테리아-숙주 상호작용에 영향을 미치고, 특정 면역 반응(16)을 회피하는 역할을 할 수 있다. 자가 응집은 편모와 관련된 글리 칸의 조성의 변형에 의해 영향을받는 또 다른 표현형 특성입니다. 더 낮은 자가응집은 마이크로콜로니 및 생물막(22)을 형성하는 능력의 감소를 유도한다. 일부 박테리아에서, 편모가 전염증 반응을 촉발시키는 능력은 편모 글리코실화와 관련이 있었다. 따라서, P. aeruginosa에서, 당화 편모는 당화되지 않은23보다 더 높은 전염증 반응을 유도한다.
에어로모나스는 그람 음성 박테리아로 환경에 유비쿼터스이며, 이는 모든 One Health 구성 요소(24)의 계면에 있을 수 있게 한다. 중온성 에어로모나스는 단일 극성 편모를 가지고 있으며, 이는 구성적으로 생산됩니다. 임상 단리물의 절반 이상은 또한 고점도 매질 또는 플레이트에서 유도성 측방향 편모를 발현한다. 다른 연구는 두 편모 유형을 박테리아 병인의 초기 단계와 관련시켰다25. 현재까지 보고된 극성 편모는 그의 중심 면역원성 도메인의 5-8 Ser 또는 Thr 잔기에서 O-글리코실화되는 반면, 측방 편모는 모든 균주에서 O-글리코실화되지 않는다. 상이한 균주로부터의 극성 편모 글리칸이 그들의 탄수화물 조성 및 사슬 길이20에서 다양성을 나타내지만, 연결 당은 pseudaminic acid 유도체인 것으로 나타났다.
이 원고의 목표는 GT를 포함하는 특정 GT 또는 염색체 영역에서 null 돌연변이를 얻는 방법을 설명하여 관련 다당류의 생합성 및 박테리아 병원성뿐만 아니라 글리칸 자체의 역할에 대한 관여를 분석하는 것입니다. 예를 들어, 우리는 극성 편모 글리코실화에 대한 관여를 확립하고 편모 글리칸의 역할을 분석하기 위해 Aeromonas 의 GT를 포함하는 염색체 영역을 확인하고 삭제합니다. 우리는이 글리 칸의 생합성과 변형 된 글리 칸의 역할에서 그 기능을 확립하기 위해 특정 GT를 삭제하는 방법을 보여줍니다. Aeromonas 를 예로 들자면, 이 원리는 다른 그람 음성 박테리아의 편모 글리코실화 섬을 확인 및 연구하고, O-항원 리포폴리사카라이드와 같은 다른 글리칸의 생합성에 관여하는 GT의 기능을 분석하는데 사용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

원핵생물에서 글리코실화에 대한 연구는 빠르게 성장하는 영역이다. 박테리아는 표면에 다른 당화 된 구조를 가지고 있으며, 글리 칸은 균주 별 바코드를 구성합니다. 관련 글리 칸은 진핵 생물보다 설탕 조성과 구조에서 더 높은 다양성을 보여 주며 박테리아 - 숙주 인식 과정 및 환경과의 상호 작용에 중요합니다. 병원성 박테리아에서 당단백질은 감염 과정의 여러 단계에 관여했으며 글리 칸 변형은 당단백질의 특정 기능을 방해 할 수 있습니다. 그러나, 글리칸 조성, 구조 및 생합성 경로의 이해에서 이루어진 진보에도 불구하고, 병원성 또는 환경과의 상호작용에서 당단백질의 역할에 대한 이해는 매우 제한적이다. 또한, 일부 박테리아에서, 단백질 글리코실화에 필요한 효소는 리포폴리사카라이드 및 캡슐 생합성 경로와 같은 다른 다당류 생합성 경로와 공유된다. 글리코실화의 기능적 중요성은 글리코실화 과정에 관여하는 것으로 생각되는 특정 유전자의 돌연변이와 표적 당단백질 및 변형 글리칸의 발현에 미치는 영향에 대한 연구를 통해 여러 박테리아에서 해명되었다. 중온성 에어로모나스는 단일 및 O 글리코실화 극성 편모를 갖는다. 편모 글리 칸은 Aeromonas 균주 간의 탄수화물 구성과 사슬 길이의 다양성을 보여줍니다. 그러나, 현재까지 분석된 모든 균주는 세린 또는 트레오닌 잔기를 변형시키는 연결 당으로서 pseudaminic acid 유도체를 보여준다. pseudaminic acid 유도체는 극성 편모 조립에 필요하며 그 손실은 접착, 생물막 형성 및 식민지화에 영향을 미칩니다. 이 기사에 자세히 설명된 프로토콜은 편모 글리칸의 생합성에서 추정적 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 유전자 또는 게놈 영역의 관여를 이해하기 위해 널 돌연변이체의 구축이 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다. 여기에는 글리코실트랜스퍼라제의 기능 및 글리칸의 역할을 이해할 수 있는 잠재력이 포함된다. 이는 글리칸 결핍 돌연변이체를 야생형 균주와 비교함으로써 달성될 것이다.

이 방법론은 편모 글리코실화 및 편모 필라멘트의 역할에 영향을 줄 수 있는 Aeromonas 의 유전자 또는 염색체 영역에서 널 돌연변이를 생성하는 효과적인 시스템을 제공합니다(그림 1).
이 프로토콜은 추정 FGI의 생물 정보학 적 확인과 GT를 코딩하는 유전자가이 영역에 제시하는 것으로 시작됩니다. 에어로모나스에서 FGI의 염색체 위치는 세 ?...

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Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

그래서 신경산 유도체는 병원성 박테리아에만 존재하며, aminiglycosylated flagella는이 설탕을 함유하고 있습니다. 프레임에서 유전자에 포함된 영역의 결실은 편모 글리코실화 클러스터를 찾는 것을 도울 수 있다. 이러한 기술은, 그들 사이에 높은 상동성을 가지며 상이한 과정에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제와 같은 최신 특정 영역 또는 유전자, 및 편모 글리코실화 과정에 대한 그의 관여를 분석한다.이 기술은 또한 병원성 박테리아에서 관련 다당류의 생합성에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제의 역할과 편모 형성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 역할을 찾는 데 도움이 될 수 있다. 절차를 시연하면 내 실험실의 기술자 인 Maite Polo가 될 것입니다. 결실될 선택된 유전자 또는 영역의 상류 및 하류의 DNA 영역을 증폭시키는 두 쌍의 프라이머를 설계한다.프라이머 A 및 D는 pDM4에서의 클로닝을 허용하는 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위인 다섯 개의 프라임 말단에 포함할 필요가 있다. 프라이머 B 및 C가 결실될 유전자 내에 있거나 결실될 영역의 첫 번째 및 마지막 유전자 내에 있는지 확인하십시오. 두 프라이머가 프레임 내에 있고 유전자 내부에 다섯 개에서 여섯 개의 코돈 사이에 위치하는지 확인하십시오.두 프라이머 모두 DNA 앰플리콘 AB 및 CD에 결합하기 위해 다섯 개의 프라임 말단에 21개의 염기쌍 무료 서열을 포함하는지 확인하십시오.정제된 염색체 DNA 100나노그램을 AB 및 CD 프라이머가 있는 비대칭 PCR 두 세트에서 주형으로 사용한 다음 1%아가로스 겔에서 결과물을 분석합니다. 전기영동 겔로부터 적출된 앰플리콘을 정제하고 정량화한다. 각 앰플리콘 100나노그램을 프라이머 없이 PCR 시약과 섞는다.그것을 확장 한 후, A 및 D 프라이머를 추가하고 단일 단편으로 증폭하십시오. 다음으로 앞서 설명한 바와 같이 결과 제품을 분석, 정제 및 정량화합니다. pDM4 한 마이크로 그램과 400 나노그램의 AD 앰플리콘을 엔도뉴클레아제로 소화하십시오.소화된 pDM4를 몰 벡터에서 AD 앰플리콘과 결합하여 하나 내지 4의 비율로 삽입하고 라이게이션 반응을 준비한다. 섭씨 20도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 나중에 섭씨 70도에서 20 분 동안 T4 리가아제를 비활성화하십시오.에스케리치아 콜리 균주를 루리아 베르타니 밀러 브로스에 접종하고 0.4와 0.6 사이의 광학 밀도가 관찰될 때까지 200RPM에서 진탕하면서 섭씨 30도에서 배양한다. 균 배양물을 섭씨 5, 000배 및 사섭씨 5도에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛화한다. 펠렛을 차가운 증류수에 현탁시키고 세척 과정을 두 번 더 반복하십시오.박테리아 현탁액을 마이크로퍼지 튜브로 옮기고 섭씨 14, 000배 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리를 반복한다. 펠렛을 냉각수에 재현탁시킨 후, 약 3.5 마이크로리터의 라이게이션 혼합물을 첨가하고, 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 내용물을 냉각된 두 밀리미터 간격 전기 천공 큐벳으로 옮깁니다.전기천공 후 SOC 배지를 첨가하고 내용물을 배양 튜브로 옮긴다. 섭씨 30도에서 한 시간 동안 인큐베이션하고 200RPM에서 진탕한다. 형질전환된 세포를 클로람페니콜로 보충된 LB 한천 플레이트 상에 플레이트화한다.pDM4 클로닝 측을 플랭크하는 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 pDM4 내로의 결실 작제물의 삽입을 확인한다. 수용자 에어로모나스 균주가 리팜피신 내성 균주와 대장균의 두 가지 다른 균주가 되도록 하룻밤 배양물을 준비한다. 공여체 균주를 pDM4 재조합 플라스미드와 함께, 섭씨 30도에서 PRK 2073 플라스미드를 갖는 헬퍼 균주.150 마이크로리터의 LB를 가진 세 개의 LB 튜브에 기증자, 수혜자 및 도우미 균주의 동일한 수의 콜로니를 중단시킨다. 그런 다음 항생제가 없는 LB 한천 플레이트 상에서 세 개의 박테리아 현탁액을 수용자에서 두 방울로 섞어 조력자 대 공여체 비율이 다섯 대 일대일 비율인 후, 플레이트를 섭씨 30도에서 밤새 위로 향하게 배양한다. LB 한천 플레이트에 LB 국물 한 밀리리터를 첨가하여 박테리아를 수확합니다. 박테리아 현탁액을 원뿔형 1.5 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브로 옮기고 격렬하게 소용돌이친다.100 마이크로 리터의 박테리아 현탁액을 리팜피신과 클로람페니콜로 LB 한천 플레이트에 퍼뜨립니다. 200 마이크로리터 및 600 마이크로리터의 샘플을 스핀다운하고, 펠렛을 100 마이크로리터의 LB 브로스에 현탁시키고, 플레이트를 리팜피신 및 클로람페니콜로 LB 한천 상에 현탁시킨 다음, 인큐베이션하였다. 옥시다제 테스트를 수행하여 콜로니가 에어로모나스인지 확인합니다.또한 E와 F 프라이머를 이용한 PCR을 통해 pDM4 재조합 플라스미드를 특정 염색체 영역에 삽입한 것을 확인하였다. 재조합 콜로니를 10 % 수크로오스와 항생제없이 섭씨 30도에서 하룻밤 사이에 LB의 두 밀리리터로 성장시킵니다. 상이한 배양 희석물을 준비한 후, 박테리아 배양물 100 마이크로리터 및 희석액을 LB 한천 플레이트 상에 10%sucrose로 플레이트하고 섭씨 30도에서 밤새 인큐베이션한다.다음날 콜로니를 집어 들고 클로람페니콜 유무에 관계없이 LB 플레이트로 옮깁니다. 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양한 후, 클로람페니콜 민감성 콜로니를 선택한다. EF 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 민감한 콜로니를 분석하고 PCR 산물이 삭제된 구축물의 크기와 상관관계가 있는 콜로니를 선택한다.커버 슬라이드의 네 모서리에 작은 실리콘 방울을 넣고 커버 슬라이드에 밤새 자란 Aeromonas 배양물을 장착하십시오. 발굴 된 슬라이드를 커버 슬라이드에 놓고 슬라이드를 거꾸로 돌립니다. 광학 현미경을 사용하여 광 현미경으로 수영 운동성을 분석 한 다음 배양물의 세 마이크로 리터를 부드러운 한천 플레이트의 중앙으로 옮깁니다.플레이트를 섭씨 25도에서 30도 사이에서 밤새 위로 향하게하십시오. 인큐베이션의 끝에서 통치자를 사용하여, 한천을 통해 플레이트 중심에서 주변부쪽으로 박테리아 이동을 측정한다. 배양 에어로모나스는 섭씨 25도에서 30도 사이의 900 밀리리터 TSB에서 하룻밤 동안 균주를 균주.원심분리 후, 펠렛을 pH 7.8의 100 밀리몰 트리스 염화수소 완충액의 20 밀리리터에 현탁시킨다. 고정 된 편모를 제거하려면 유리 막대가있는 소용돌이에 서스펜션을 서너 분 동안 깎은 다음 21 게이지 주사기를 통해 반복적으로 통과하십시오. 섭씨 네 도에서 두 번의 연속 원심분리에 의해 박테리아를 펠릿화하고 상청액을 별도의 튜브로 수집한다.상청액을 초원심분리한 후, 펠렛을 두 밀리몰 EDTA 완충액을 함유하는 100 밀리몰 트리스 염화수소의 150 마이크로리터에 현탁시킨다. 편모의 농축 된 부분 150 마이크로 리터를 얇은 벽으로 둘러싸인 초투명 튜브로 옮기고 12 밀리리터의 염화 세슘 용액으로 채 웁니다. 튜브를 60, 000 배 G에서 48 시간 동안 섭씨 4도에서 스윙 버킷 로터에서 초원심분리합니다.편모 밴드를 주사기로 염화세슘 구배로 모으고 100 밀리몰 트리스 염화수소와 두 밀리몰 EDTA에 대해 투석한 다음 전기 영동 및 쿠마시 블루 염색 또는 질량 분광법으로 분석합니다. 다음 그림에서, 레인 WT는 에어로모나스 피시콜라 AH3이다. 레인 하나 내지 여덟 개는 클로람페니콜 민감성 콜로니를 두 번째 재조합의 나타낸다.ST는 하이퍼 방광 1KB 마커입니다. 레인 하나 내지 셋 및 다섯내지 여덟은 레인 WT로서 야생형 FGI4 유전자를 갖는 콜로니를 나타낸다. 레인 4는 결실된 FGI4 유전자를 갖는 콜로니를 나타낸다. 광 현미경 분석은 극성 또는 측방향 편모 변형이 단지 이동 직경의 감소로 이어진다는 것을 보여주었고, 따라서, AH-3 FGI 돌연변이체 및 AH-3 FGI-4 돌연변이체는 야생형 균주와 관련하여 감소된 운동성만을 보여준다.도면은 레인 1의 AH-3으로부터의 극성 편모를 보여주고, 레인 2의 FGI 영역과 레인 3의 FGI-4 유전자에 돌연변이가 없음을 보여주며, 여기서 두 돌연변이체 모두 야생형 균주보다 낮은 분자량을 갖는 극성 편모를 가지며, 이는 편모 글리칸의 변화를 시사한다. 돌연변이가 하류 유전자에 영향을 미치지 않고 편모 조립에 대한 무능력 또는 편모의 필라멘트의 무능을 유도하는 것이 중요합니다. 편모 단백질의 변화가 검출 가능하지 않을 때, 글리칸 질량을 알기 위해 편모 펩티드의 총 단백질을 사용하여 질량 분광법 분석이 필요합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

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감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

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Ixodes Scapularis 진드기의 타액, 침샘 및 Hemolymph 컬렉션

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

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발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

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세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

방법은 세균 Pyomelanin 생산을 억제하고 산화 스트레스에 감도에 대응 증가를 확인하는 방법

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성<em&gt; PilG</em&gt;에서<em&gt; Xylella의 fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

세균성 접착 및 혈 청 저항에 Vitronectin의 역할을 공부에 대 한 분석

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...