Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Research Council Canada, for Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spania) og for Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Den skjematiske representasjonen av prosedyren vises i figur 1.
1. Bioinformatisk identifikasjon av flagella glykosyleringsøy (FGIer) i Aeromonas
<ol><li>For å identifisere PseAc biosyntetiske klynger i Aeromonas genomer, bruk tblastnverktøyet fra NCBI database26. Først henter du ortopediske proteiner til PseC og PseI fra A. piscicola AH-3 (identifikasjonskodene er OCA61126.1 og OCA...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacteria:+sweeter+than+ever.">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Never+say+never+again:+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria.">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li><li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+sugars+sticking+out.">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li><li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferases:+structures,+functions,+and+mechanisms.">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li><li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate-active+enzymes+database+(CAZy)+in+2013.">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).</li><li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine-linked+protein+glycosylation:+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems.">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).</li><li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation.">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems.">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li><li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li><li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin.">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li><li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural,+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori.">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li><li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum.">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li><li>Kov&#225;cs, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction.">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703 (1956).</li><li>Fulton, K. M., Mendoza-Barber&#225;, E., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+(Serotype+O11).">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li><li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology,+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida.">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).</li><li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

Det kritiske tidlige trinnet i denne metoden er identifisering av regioner som er involvert i glykosylering av flagella og putative GTs fordi disse enzymene viser høy homologi og er involvert i mange prosesser. Bioinformatisk analyse av Aeromonas-genomer i offentlige databaser viser at denne regionen ligger ved siden av polar flagella-regionen 2, som inneholder flagellingenene i mange stammer og inneholder gener involvert i biosyntesen av pseudaminsyre27. Dette har gjort det mulig å utv...

Proteinglykosylering er beskrevet i både Gram-positive og Gram-negative bakterier og består av kovalent vedlegg av en glykan til en aminosyre sidekjede 1,2. I prokaryoter skjer denne prosessen vanligvis via to store enzymatiske mekanismer: O- og N-glykosylering3. Ved O-glykosylering er glykanen festet til hydroksylgruppen av en serin (Ser) eller treonin (Thr) rester. Ved N-glykosylering er glykanen festet til sidekjeden midt i nitrogenet til en asparagin (Asn) rester i tripeptidsekvensene Asn-X-Ser/Thr, hvor X kan være en hvilken som helst aminosyre unntatt prolin.
Glykaner kan vedta lineære eller forgrenede strukturer og består av monosakkarider eller polysakkarider som er kovalent forbundet med glykosidiske bindinger. I prokaryoter viser glykaner vanligvis mangfold i sukkersammensetning og struktur i forhold til eukaryote glykaner4. Videre er to forskjellige bakterielle glykosyleringsveier som varierer i hvordan glykanen monteres og overføres til akseptorproteinet blitt beskrevet: sekvensiell og en blokkglykosylering 5,6. For sekvensiell glykosylering er den komplekse glykanen bygget opp direkte på proteinet ved etterfølgende tilsetning av monosakkarider. I en blokk glykosylering overføres en forhåndsmontert glykan til proteinet fra en lipidbundet oligosakkarid av en spesialisert oligosakkaryltransferase (OTase). Begge veiene har vist seg å være involvert i N- og O-glykosyleringsprosesser7.
Proteinglykosylering har en rolle i modulering av proteinens fysisk-kjemiske og biologiske egenskaper. Tilstedeværelsen av en glykan kan påvirke hvordan proteinet samhandler med sin ligand, noe som påvirker proteinets biologiske aktivitet, men kan også påvirke proteinstabilitet, løselighet, følsomhet for proteolyse, immunogenisitet og mikrobevertinteraksjoner 8,9. Imidlertid kan flere glykosyleringsparametere, for eksempel antall glykaner, glykansammensetning, posisjon og festemekanisme, også påvirke proteinfunksjon og struktur.
Glykosyltransferaser (GTs) er de viktigste enzymene i biosyntesen av komplekse glykaner og glykokonjugater. Disse enzymene katalyserer den glykosidiske bindingsdannelsen mellom en sukkermoiety fra et aktivert donormolekyl og en bestemt substrat akseptor. GTer kan bruke både nukleotider og ikke-nukleotider som donormolekyler og målrette mot forskjellige substrat akseptorer, som proteiner, sakkarider, nukleinsyrer og lipider10. Derfor er det viktig å forstå GTs på molekylært nivå for å identifisere deres virknings- og spesifisitetsmekanismer, og muliggjør også å forstå hvordan sukkersammensetning av glykaner som endrer relevante molekyler er relatert til patogenisitet. Den karbohydrataktive enzymdatabasen (CAZy)11 klassifiserer GT-er i henhold til deres sekvens homologi, som gir et prediktivt verktøy siden, i de fleste av GT-familiene, er den strukturelle folden og virkningsmekanismene konstante. Imidlertid gjør fire grunner det vanskelig å forutsi substratspesifisitet av mange GTs: 1) ikke noe klart sekvensmotiv som bestemmer substratspesifisitet er bestemt i prokaryoter12, 2) mange GTs og OTases viser substrat promiscuity13,14, 3) funksjonelle GTs er vanskelig å produsere i høy avkastning i rekombinant form og 4) identifisering av både donor og akseptor substrater er kompleks. Til tross for dette har nyere mutagenesestudier gjort det mulig å oppnå betydelige fremskritt i forståelsen av katalytiske mekanismer og trekke fra binding av GTs.
I bakterier synes O-glykosylering å være mer utbredt enn N-glykosylering. O-glykosyleringsstedene viser ikke en konsensussekvens, og mange av O-glykosylerte proteiner utskilles eller celleoverflateproteiner, for eksempel flagelliner, pili eller autotransportører1. Flagellin glykosylering viser variasjon i antall akseptorområder, glykansk sammensetning og struktur. For eksempel har Burkholderia spp flagellins bare ett akseptorsted, mens i Campylobacter jejuni har flagellins så mange som 19 akseptorsteder15,16. Videre, for noen bakterier, er glykanen et enkelt monosakkarid, mens andre bakterier har heterogene glykaner kompromittert av forskjellige monosakkarider for å danne oligosakkarider. Denne heterogeniteten oppstår selv blant stammer av samme art. Helicobacter flagellins er bare modifisert av pseudaminsyre (PseAc)17, og Campylobacter flagellins kan endres av PseAc, acetamidinoformen av pseudaminsyren (PseAm) eller legionaminsyre (LegAm), og glykaner avledet fra disse sukkerene med acetyl, N-acetylglucosamin eller propioniske substitusjoner 18,19. I Aeromonas er flagelliner modifisert av glykaner hvis sammensetning spenner fra et enkelt PseAc syrederivat til et heteropolysakkarid20, og vedlegg av glykaner til flagellinmonomerer er alltid via et PseAc-derivat.
Generelt er glykosylering av flagellins avgjørende for flagellarfilamentmontering, motilitet, virulens og vertsspesifikkitet. Men mens flagellins av C. jejuni16, H. pylori17, og Aeromonas sp. 21 kan ikke samles i filament med mindre proteinmonomerene er glykosylerte, Pseudomonas spp. og Burkholderia spp. 15 krever ikke glykosylering for flagellamontering. Videre, i noen C. jejuni stammer, endringer i sukkersammensetningen av flagella glykan påvirke bakteriell-vert interaksjon og kan spille en rolle i å unngå visse immunresponser16. Autoagglutination er en annen fenotypisk egenskap påvirket av modifikasjoner i sammensetningen av glykaner forbundet med flagellins. En lavere autoagglutinasjon fører til en reduksjon i evnen til å danne mikrokolonier og biofilm22. I noen bakterier var flagellaens evne til å utløse en proinflammatorisk respons knyttet til flagellin glykosylering. Således, i P. aeruginosa, glykosylert flagellin induserer en høyere pro-inflammatorisk respons enn unglykosylert23.
Aeromonas er Gram-negative bakterier allestedsnærværende i miljøet, noe som gjør at de kan være i grensesnittet til alle One Health-komponenter 24. Mesofile Aeromonas har et enkelt polart flagellum, som er konstituativt produsert. Mer enn halvparten av kliniske isolasjoner uttrykker også lateral flagellin, inducible i medier eller plater med høy viskositet. Ulike studier har relatert begge flagellatyper med de tidlige stadiene av bakteriell patogenese25. Mens polar flagellins rapportert til dags dato er O-glykosylert på 5-8 Ser eller Thr rester av sine sentrale immunogene domener, laterale flagellins er ikke O-glykosylert i alle stammer. Selv om polar flagella glykaner fra forskjellige stammer viser mangfold i karbohydratsammensetningen og kjedelengden20, har koblingssukker vist seg å være et pseudaminsyrederivat.
Målet med dette manuskriptet er å beskrive en metode for å oppnå nullmutanter i spesifikke GTs eller kromosomale regioner som inneholder GTs for å analysere deres engasjement i biosyntesen av relevante polysakkarider og i bakteriell patogenisitet, samt glykanens rolle selv. Som et eksempel identifiserer og sletter vi en kromosomregion som inneholder GTer av Aeromonas for å etablere sitt engasjement i polar flagellin glykosylering og analysere rollen til flagellin glykan. Vi viser hvordan du sletter en bestemt GT for å etablere sin funksjon i biosyntesen til denne glykanen og rollen som modifisert glykan. Selv om du bruker Aeromonas som eksempel, kan prinsippet brukes til å identifisere og studere flagella glykosyleringsøyer av andre Gram-negative bakterier og analysere funksjonen til GTs involvert i biosyntesen til andre glykaner som O-antigen lipopolysakkarid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

Studien av glykosylering i prokaryoter er et raskt voksende område. Bakterier har forskjellige glykosylerte strukturer på overflaten hvis glykaner utgjør en belastningsspesifikk strekkode. De tilhørende glykanene viser høyere mangfold i sukkersammensetning og struktur enn for eukaryoter og er viktige i bakteriell-vert anerkjennelsesprosesser og interaksjon med miljøet. I patogene bakterier har glykoproteiner vært involvert i ulike stadier av den smittsomme prosessen, og glykanmodifikasjoner kan forstyrre spesifikke funksjoner av glykoproteiner. Til tross for fremskrittene i forståelsen av glykansk sammensetning, struktur og biosynteseveier, forblir forståelsen av glykoproteinenes rolle i patogenisitet eller interaksjon med miljøet svært begrenset. Videre, i noen bakterier, deles enzymene som kreves for proteinglykosylering med andre polysakkaridbiosyntetiske veier, som lipopolysakkarid og kapselbiosyntetiske veier. Den funksjonelle betydningen av glykosylering har blitt belyst i flere bakterier gjennom mutasjon av spesifikke gener som antas å være involvert i glykosyleringsprosessen og studien av dens innvirkning på uttrykket av målglykoproteinet og modifiserende glykan. Mesofile Aeromonas har en enkelt og O-glykosylert polar flagellum. Flagellar glykaner viser mangfold i karbohydratsammensetning og kjedelengde mellom Aeromonas stammer. Imidlertid viser alle stammer analysert til dags dato et pseudaminsyrederivat som koblingssukkeret som endrer serin- eller treoninrester. Pseudaminsyrederivatet er nødvendig for polar flagellamontering, og tapet har innvirkning på vedheft, biofilmdannelse og kolonisering. Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen beskriver hvordan bygging av nullmutanter kan brukes til å forstå involvering av gener eller genomregioner som inneholder putative glykosyltransferaser i biosyntesen til en flagellar glykan. Dette inkluderer potensialet til å forstå funksjonen til glykosyltransferaser involvert og glykanens rolle. Dette oppnås ved å sammenligne glykanmangelmutanten med villtypestammen.

Denne metodikken gir et effektivt system for å generere nullmutanter i gener eller kromosomale regioner i Aeromonas som kan påvirke flagellaglykosylering og rollen som flagellafilament (figur 1).
Protokollen starter med bioinformatisk identifisering av putative FGIer og genene som koder GTs presenterer i denne regionen. I Aeromonas er den kromosomale plasseringen av FGIer basert på påvisning av tre typer gener: gener involvert i biosyntesen a...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Her beskriver vi byggingen av nullmutanter av Aeromonas i spesifikke glykosyltransferaser eller regioner som inneholder glykosyltransferaser, motilitetsanalysene og flagellarensing utført for å etablere involvering og funksjon av deres kodede enzymer i biosyntesen til en glykan, samt rollen til denne glykanen i bakteriell patogenese.

Generasjon av null mutanter for å belyse rollen som bakterielle glykosyltransferaser i bakteriell bevegelighet

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Så neurminsyrederivat er bare tilstede i patogene bakterier, aminiglykosylert flagella inneholder dette sukkeret. Ved rammesletting av regionen som finnes i genene, kan det bidra til å finne flagella glykosyleringsklynger. Denne teknikken, den nyeste spesifikke regionen eller genene, for eksempel glykosyltransferaser som har høy homologi mellom dem og er involvert i forskjellige prosesser, og analyserer dets engasjement i flagella glykosyleringsprosess.Denne teknikken kan også bidra til å finne rollen som glykosyltransferaser involvert i biosyntesen av relevante polysakkarider i patogene bakterier og også rollen som genkoding av proteiner involvert i flagelladannelse. Å demonstrere prosedyren vil Maite Polo, en tekniker av laboratoriet mitt. Design to par primere som forsterker DNA-regioner oppstrøms og nedstrøms for det valgte genet eller området som skal slettes.Primere A og D må inkludere på fem prime end, et begrensningssted for en endonuclease som tillater kloning i pDM4. Sørg for at primere B og C er innenfor genet som skal slettes eller inne i det første og siste genet i regionen som skal slettes. Sørg for at begge primerne er i ramme og plassert mellom fem og seks codons inne i genet.Forsikre deg om at begge primerne inkluderer en 21 basepar gratis sekvens på fem prime enden for å bli med DNA-amplikoner AB og CD.Use 100 nanogram renset kromosomalt DNA som mal i to sett med asymmetriske PCRs med AB og CD primere etterfulgt av analyse av resulterende produkter i 1% agarose gel. Rens og kvantifisere de utskilte amlikonene fra elektroforetisk gel. Bland 100 nanogram av hver amplikon med PCR-reagenser uten primer.Etter å ha utvidet den, legg til A- og D-primere og forsterk dem som et enkelt fragment. Deretter analyserer og kvantifiserer du de resulterende produktene som tidligere beskrevet. Fordøye ett mikrogram pDM4 og 400 nanogram AD-amplikon med en endonuklease.Kombiner den fordøyde pDM4 med AD-amplikon ved en molarvektor for å sette inn forholdet mellom en og fire og forberede ligasjonsreaksjonen. Inkuber over natten ved 20 grader Celsius. Senere inaktiverer du T4-ligaer ved 70 grader Celsius i 20 minutter.Inokulert Escherichia coli belastning i Luria Bertani Miller buljong og inkubere ved 30 grader Celsius med risting ved 200 RPM til en optisk tetthet mellom 0,4 og 0,6 observeres. Pellet bakteriekulturen ved sentrifugering ved 5000 ganger G og fire grader Celsius i 15 minutter. Suspender pelletsen i kjølt destillert vann og gjenta rengjøringsprosessen to ganger til.Overfør bakteriefjæringen til mikrofunksjonsrør og gjenta sentrifugeringen ved 14.000 ganger G og fire grader Celsius i fem minutter. Etter å ha resuspendert pellet i kjølt vann, tilsett ca. 3,5 mikroliter av ligasjonsblandingen og inkuber på is i fem minutter. Overfør innholdet til en kjølt to millimeter gap elektroporering cuvette.Etter elektroporasjon legg til SOC-mediet og overfør innholdet til et kulturrør. Inkuber i en time ved 30 grader Celsius med risting ved 200 RPM. Plate de transformerte cellene på LB agar plater supplert med kloramfenikol.Kontroller innsettingen av slettingskonstruksjonen i pDM4 av PCR ved hjelp av primere som flankerer pDM4-kloningssiden. Forbered kulturer over natten slik at mottakeren Aeromonas stammer rifampicin resistent og to forskjellige stammer av Escherichia coli. Donorstammen med pDM4 rekombinant plasmid, og hjelperstammen med PRK 2073 plasmid ved 30 grader Celsius.Suspender samme antall kolonier av donor-, mottaker- og hjelperstammene i tre LB-rør med 150 mikroliter LB. Deretter blander på en LB agarplate uten antibiotika de tre bakterielle suspensjonene i to dråper hos en mottaker for å hjelpe til med donorforhold på fem til en til en, og inkuberer platen med forsiden opp over natten ved 30 grader Celsius. Høst bakterier ved å tilsette en milliliter LB kjøttkraft til LB agarplaten. Overfør bakteriell suspensjon til et konisk 1,5 milliliter mikrofugerør og kraftig virvel.Spred 100 mikroliter av bakteriell suspensjon på LB agarplater med rifampicin og kloramfenikol. Spinn ned 200 mikroliter og 600 mikroliter av prøvene, suspender pellet i 100 mikroliter LB buljong og plate på LB agar med rifampicin og kloramfenikol etterfulgt av inkubasjon. Utfør en oksidasetest for å bekrefte at koloniene er Aeromonas.Bekreft videre innsetting av pDM4 rekombinant plasmid i den spesifikke kromosomale regionen av PCR ved hjelp av E- og F-primerne. Dyrk de rekombinante koloniene i to milliliter LB med 10% sukrose og uten antibiotika over natten ved 30 grader Celsius. Etter å ha forberedt forskjellige kulturfortynning, plate 100 mikroliter av bakteriekulturer og fortynning på LB agar plate med 10% sukrose og inkubere over natten på 30 grader Celsius.Neste dag, plukke opp koloniene og overføre dem til LB plater med og uten kloramfenikol. Etter å ha inkubert dem over natten ved 30 grader Celsius, velg kloramfenikolfølsomme kolonier. Analyser de følsomme koloniene av PCR ved hjelp av EF-primerparet, og velg koloniene der PCR-produktet er korrelert med størrelsen på den slettede konstruksjonen.Legg en liten dråpe silikon i de fire hjørnene av dekselsklie og monter over natten dyrket kultur av Aeromonas på en dekselsklie. Plasser et utgravd lysbilde på dekselskuffen, og snu lysbildet opp-ned. Analyser svømmemotilitet ved lett mikroskop ved hjelp av et optisk mikroskop, og overfør deretter tre mikroliter av kulturen til midten av en myk agarplate.Inkuber platen med forsiden opp over natten mellom 25 og 30 grader Celsius. Ved hjelp av en linjal på slutten av inkubasjonen måler du bakterievandringen fra platesenteret mot periferien gjennom agaren. Kultur Aeromonas stammer over natten i 900 milliliter TSB mellom 25 og 30 grader Celsius.Etter sentrifugering, suspendere pellet i 20 milliliter av 100 millimolar Tris hydrogenkloridbuffer av pH 7,8. For å fjerne den forankrede flagellaen, rens suspensjonen i en virvel med en glassstang i tre til fire minutter, og pass deretter repeterende gjennom en 21 gauge sprøyte. Pellet bakteriene med to påfølgende sentrifuger ved fire grader Celsius og samle supernatanten i et eget rør.Etter ultracentrifuging supernatant, suspendere pellet i 150 mikroliter av 100 millimolar Tris hydrogenklorid som inneholder to millimolar EDTA buffer. Overfør 150 mikroliter av den berikede brøkdelen av flagella til et tynt inngjerdet ultraklart rør, og fyll det med 12 milliliter cesiumkloridoppløsning. Ultracentrifuge røret på 60.000 ganger G i 48 timer ved fire grader Celsius i en svingende bøtterotor.Samle flagellabåndet i cesiumkloridgradienten med en sprøyte og dialyze mot 100 millimeter Tris hydrogenklorid pluss to millimeter EDTA etterfulgt av analyse av elektroforese og Coomassie blå farging eller massespektrometri. I figuren nedenfor er lane WT Aeromonas piscicola AH3. Baner en til åtte viser kloramfenikol følsomme kolonier av den andre rekombinasjonen.ST er hyperblære 1KB markør. Lanes en til tre og fem til åtte viser koloniene med wild type FGI4 gen som lane WT. Lane fire viser en koloni med det slettede FGI4-genet. Lette mikroskopianalyser viste at polare eller laterale flagella modifikasjoner bare fører til reduksjoner i migrasjonsdiametrene, og dermed viser AH-3 FGI mutant og AH-3 FGI-4 mutanter bare redusert bevegelighet i forhold til den ville typestammen.Figuren viser polar flagellum fra AH-3 av lane en, og ingen mutanter i FGI-regionen av lane to og FGI-4 gen av lane tre, hvor begge mutanter har polar flagellins med lavere molekylvekt enn den ville typen belastning, noe som antyder endringer i flagella glykan. Det er viktig å sikre at mutasjoner ikke påvirker nedstrømsgener og fører manglende evne til flagella-samlingen eller manglende evne til filamenter av flagella. Når endring i flagellinproteiner ikke kan påvises, kreves massespektrometrianalyse ved hjelp av det totale proteinet av flagellinpeptider for å kjenne glykanmassen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bakteriell Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Bruke overlegg analysen til Kvalitativt Mål Bakteriell Produksjon av og følsomhet for pneumokokk Bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder for å hemme bakterie Pyomelanin Produksjon og Bestem tilsvarende økning i Følsomhet for oksidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisering av Rykninger motilitet og karakterisering av rollen til<em&gt; PilG</em&gt; i<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser for å studere rollen til Vitronectin i bakteriell vedheft og Serum motstand

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...