Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Nacional de Pesquisa do Canadá, pelo Plano Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Espanha) e pelo Centro de Referência em Biotecnologia.

A representação esquemática do procedimento é mostrada na Figura 1.
1. Identificação bioinformática da ilha flagella glicosylation (FGIs) em Aeromonas
<ol><li>Para identificar os clusters biossintéticos PseAc nos genomas de Aeromonas , use a ferramenta tblastn do banco de dados NCBI26. Primeiro, recupere proteínas ortologos para PseC e PseI de A. piscicola AH-3 (códigos de ide...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferases:+structures,+functions,+and+mechanisms.">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li><li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. 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M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+(Serotype+O11).">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li><li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology,+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida.">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).</li><li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

O passo crítico inicial desse método é a identificação de regiões envolvidas na glicosilação de flagela e GTs putativas porque essas enzimas apresentam alta homologia e estão envolvidas em muitos processos. A análise bioinformática dos genomas de Aeromonas em bancos de dados públicos mostra que esta região é adjacente à região de flagela polar 2, que contém os genes flagellin em muitas cepas e contém genes envolvidos na biosíntese do ácido udaminic27. Isso possibilitou...

A glicossylação proteica tem sido descrita em ambas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e consiste no apego covalente de um glicano a uma cadeia lateral de aminoácidos 1,2. Em procariotes, esse processo geralmente ocorre através de dois mecanismos enzimáticos principais: O- e N-glicosylation3. Na O-glicosylation, o glicano é anexado ao grupo hidroxyl de um resíduo serino (Ser) ou threonine (Thr). Na N-glicosylation, o glicano é anexado à cadeia lateral em meio a nitrogênio de um resíduo de asparagine (Asn) dentro das sequências de tripeptídeos Asn-X-Ser/Thr, onde X poderia ser qualquer aminoácido, exceto proline.
Os glicanos podem adotar estruturas lineares ou ramificadas e são compostos de monossacarídeos ou polissacarídeos covalentemente ligados por ligações glicossídicas. Em procariotes, os glicanos costumam mostrar diversidade na composição e estrutura do açúcar em comparação com os glicanos eucarióticos4. Além disso, duas diferentes vias de glicosylation bacteriana que diferem na forma como o glicano é montado e transferido para a proteína aceitadora foram descritas: glicossolation sequencial e en bloco 5,6. Para a glicossicação sequencial, o glicano complexo é construído diretamente sobre a proteína por sucessivas adição de monossacarídeos. Na glicosylation en bloc, um glicano pré-montado é transferido para a proteína a partir de um oligossacarídeo ligado a lipídios por um oligossacaryltransferase especializado (OTase). Ambas as vias mostraram-se envolvidas nos processos de N e O-glicosylation 7.
A glicossomilation proteica tem um papel na modulação das propriedades físico-químicas e biológicas das proteínas. A presença de um glicano pode influenciar como a proteína interage com seu ligante, que afeta a atividade biológica da proteína, mas também pode afetar a estabilidade proteica, solubilidade, suscetibilidade à proteólise, imunogenicidade e interações micróbios8,9. No entanto, vários parâmetros de glicosylation, como o número de glicanos, composição glica, posição e mecanismo de apego, também podem afetar a função e a estrutura da proteína.
As glicosilatransferases (GTs) são as enzimas-chave na biossíntese de glicanos complexos e glicoconjugados. Essas enzimas catalisam a formação de ligação glicósdica entre uma moiety de açúcar de uma molécula de doador ativada e um aceitador de substrato específico. Os GTs podem usar nucleotídeos e não-nucleotídeos como moléculas de doadores e atingir diferentes aceitadores de substratos, como proteínas, sacarídeos, ácidos nucleicos e lipídios10. Portanto, compreender os GTs no nível molecular é importante para identificar seus mecanismos de ação e especificidade, e também permite entender como a composição do açúcar dos glicanos que modificam moléculas relevantes está relacionada à patogenicidade. O banco de dados de enzimas enzimásis Ativos de Carboidratos (CAZy)11 classifica os GTs de acordo com sua sequência de homologia, que fornece uma ferramenta preditiva, uma vez que, na maioria das famílias GT, a dobra estrutural e os mecanismos de ação são invariantes. No entanto, quatro razões dificultam a previsão da especificidade do substrato de muitos GTs: 1) nenhum motivo de sequência clara determinando a especificidade do substrato foi determinado nos procariotes12, 2) muitos GTs e OTases mostram promiscuidade de substrato 13,14, 3) GTs funcionais são difíceis de produzir em alto rendimento em forma recombinante e 4) a identificação de substratos doadores e aceitadores é complexa. Apesar disso, estudos recentes de mutagênese permitiram obter avanços significativos na compreensão de mecanismos catalíticos e subtrair a vinculação dos GTs.
Em bactérias, o-glicosylation parece ser mais prevalente do que n-glicosylation. Os locais de o-glicosylation não mostram uma sequência de consenso, e muitas das proteínas O-glicosylated são secretas ou proteínas de superfície celular, como flagellins, pili ou autotransportadores1. A glicossylation flagellin mostra variabilidade no número de locais de aceitação, composição glica e estrutura. Por exemplo, burkholderia spp flagellins têm apenas um site de aceitação, enquanto em Campylobacter jejuni, flagellins têm até 19 locais de aceitação15,16. Além disso, para algumas bactérias, o glicano é um único monossacarídeo, enquanto outras bactérias possuem glicanos heterogêneos comprometidos de diferentes monossacarídeos para formar oligossacarídeos. Essa heterogenicidade ocorre mesmo entre cepas da mesma espécie. As flagellins helicobacter só são modificadas por ácido pseudaminic (PseAc)17, e as flagellins campylobacter podem ser modificadas por PseAc, a forma acetamidino do ácido pseudaminico (PseAm) ou ácido legionamínico (LegAm), e glycans derivados desses açúcares com acetil, N-acetilglucosamina, ou substituições propiônicas 18,19. Em Aeromonas, as flagellins são modificadas por glicanos cuja composição varia de um único derivado ácido PseAc a um heteropolysacarídeo20, e o apego dos glicanos aos monômeros flagellin é sempre através de um derivado PseAc.
Em geral, a glicossylation de flagellins é essencial para a montagem de filamento flagelar, motilidade, virulência e especificidade do hospedeiro. No entanto, enquanto flagellins de C. jejuni16, H. pylori17, e Aeromonas sp. 21 não pode se montar em filamentos a menos que os monômeros proteicos sejam glicosiltos, Pseudomonas spp. e Burkholderia spp. 15 não requerem glicossylation para montagem flagela. Além disso, em algumas cepas de C. jejuni , alterações na composição do açúcar da flagelaglicano podem afetar a interação bacteriana-hospedeira e podem desempenhar um papel na fuga de certas respostas imunes16. A autoaglictinação é outra característica fenotípica afetada por modificações na composição de glicanos associados a flagellins. Uma autoagglutinação mais baixa leva a uma redução na capacidade de formar microcolônias e biofilme22. Em algumas bactérias, a capacidade de flagela para desencadear uma resposta pró-inflamatória estava ligada à glicoslação flagellina. Assim, em P. aeruginosa, o flagellin glicosilado induz uma resposta pró-inflamatória maior do que o ungcosylated23.
Aeromonas são bactérias Gram-negativas onipresentes no ambiente, o que permite que elas estejam na interface de todos os componentes do One Health 24. Aeromonas mesofílicas têm um único flagelo polar, que é produzido constitutivamente. Mais da metade dos isolados clínicos também expressam flagellin lateral, indutível em mídia ou placas de alta viscosidade. Diferentes estudos relacionaram ambos os tipos de flagela com os estágios iniciais da patogênese bacteriana25. Enquanto as bandeiras polares relatadas até o momento são O-glycosylated em 5-8 Resíduos de Ser ou Thr de seus domínios imunológicos centrais, flagellins laterais não são O-glycosylated em todas as cepas. Embora as glicans flagella polares de diferentes cepas mostrem diversidade em sua composição de carboidratos e comprimento da cadeia20, o açúcar de ligação tem se mostrado um derivado de ácido pseudaminic.
O objetivo deste manuscrito é descrever um método para obter mutantes nulos em GTs específicos ou regiões cromossômicas contendo GTs para analisar seu envolvimento na biossíntese de polissacarídeos relevantes e na patogenicidade bacteriana, bem como o papel do próprio glicano. Como exemplo, identificamos e excluímos uma região cromossômica contendo GTs de Aeromonas para estabelecer seu envolvimento na glicosilação de bandeira polar e analisar o papel do glicano flagellin. Mostramos como excluir um GT específico para estabelecer sua função na biosíntese deste glicano e o papel do glicano modificado. Embora usando Aeromonas como exemplo, o princípio pode ser usado para identificar e estudar ilhas de glicosilação flagella de outras bactérias Gram-negativas e analisar a função de GTs envolvidos na biosíntese de outros glicanos, como o lipopólio-de-o-antígeno.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

O estudo da glicosylation em procariotes é uma área de rápido crescimento. As bactérias abrigam diferentes estruturas glicosylated em sua superfície cujos glicanos constituem um código de barras específico para a cepa. Os glicanos associados apresentam maior diversidade na composição e estrutura do açúcar do que os de eucariotes e são importantes nos processos de reconhecimento de hospedeiros bacterianos e na interação com o meio ambiente. Em bactérias patogênicas, as glicoproteínas estiveram envolvidas em diferentes estágios do processo infeccioso, e modificações glicais podem interferir com funções específicas de glicoproteínas. No entanto, apesar dos avanços na compreensão das vias de composição, estrutura e biossíntese glicano, a compreensão do papel das glicoproteínas na patogenicidade ou interação com o ambiente permanece muito limitada. Além disso, em algumas bactérias, as enzimas necessárias para a glicossiltação proteica são compartilhadas com outras vias biossintéticas de polissacarídeo, como lipopoliposcarídeos e vias biossintéticas de cápsulas. A importância funcional da glicossylation tem sido elucidada em várias bactérias através da mutação de genes específicos considerados envolvidos no processo de glicosylation e no estudo de seu impacto na expressão da glicoproteína alvo e da glican modificadora. Aeromonas mesofílicas têm um único e O-glycosylated flagellum polar. Os glicanos flageladores mostram diversidade na composição de carboidratos e comprimento da cadeia entre cepas de Aeromonas. No entanto, todas as cepas analisadas até o momento mostram um derivado de ácido pseudaminic como o açúcar de ligação que modifica resíduos de serina ou threonina. O derivado de ácido pseudaminico é necessário para a montagem de flagella polar, e sua perda tem um impacto na adesão, formação de biofilme e colonização. O protocolo detalhado neste artigo descreve como a construção de mutantes nulos pode ser usada para entender o envolvimento de genes ou regiões do genoma contendo glicosyltransferases putativas na biosíntese de um glicano flagelar. Isso inclui o potencial de compreender a função das glicosyltransferases envolvidas e o papel do glicano. Isso será alcançado comparando o mutante deficiente glicano com a cepa selvagem.

Esta metodologia fornece um sistema eficaz para gerar mutantes nulos em genes ou regiões cromossômicas de Aeromonas que podem afetar a glicosylation flagella e o papel do filamento flagela (Figura 1).
O protocolo começa com a identificação bioinformática dos FGIs putativos e os genes que codificam os GTs presentes nesta região. Em Aeromonas, a localização cromossômica dos FGIs baseia-se na detecção de três tipos de genes: genes envol...

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Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Aqui, descrevemos a construção de mutantes nulos de Aeromonas em glicosyltransferases específicas ou regiões contendo glicosyltransferases, os ensaios de motilidade e a purificação de flagela realizadas para estabelecer o envolvimento e função de suas enzimas codificadas na biossíntese de um glicano, bem como o papel deste glicano em patógenos bacterianos.

Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Assim, a derivada de ácido neurminico só está presente em bactérias patogênicas, flagela aminiglycosylated contêm este açúcar. Na exclusão de quadros da região contida nos genes pode ajudar a encontrar aglomerados de glicossylação flagella. Essa técnica, a mais recente região específica ou genes, como glicosyltransferases que têm alta homologia entre eles e estão envolvidos em diferentes processos, e analisam seu envolvimento no processo de glicosylation flagella.Essa técnica também pode ajudar a encontrar o papel das glicosyltransferases envolvidas na biossíntese de polissacarídeos relevantes em bactérias patogênicas e também o papel das proteínas de codificação genética envolvidas na formação de flagela. Demonstrando o procedimento será Maite Polo, uma técnica do meu laboratório. Projete dois pares de primers que amplificam regiões de DNA rio acima e rio abaixo do gene ou região selecionado a ser excluído.Os primers A e D precisam incluir na extremidade cinco prime, um local de restrição para uma endonuclease que permite a clonagem em pDM4. Certifique-se de que os primers B e C estão dentro do gene a ser excluído ou dentro do primeiro e último gene da região a ser excluído. Certifique-se de que ambos os primers estão em quadro e localizados entre cinco a seis códons dentro do gene.Certifique-se de que ambos os primers incluam uma sequência complementar de 21 pares de base na extremidade principal cinco para juntar amplificadores de DNA AB e CD.Use 100 nanogramas de DNA cromossômico purificado como modelo em dois conjuntos de PCRs assimétricos com primers AB e CD seguidos pela análise de produtos resultantes em 1%aga gelrose. Purificar e quantificar os amplicons excisados do gel eletroforético. Misture 100 nanogramas de cada amplicon com reagentes PCR sem primer.Depois de prorrogá-lo, adicione primers A e D e amplie-os como um único fragmento. Em seguida, analisar, purificar e quantificar os produtos resultantes como descrito anteriormente. Digerir um micrograma de pDM4 e 400 nanogramas de amplicon AD com uma endonuclease.Combine o pDM4 digerido com amplicon AD em um vetor molar para inserir razão de um a quatro e preparar a reação de ligadura. Incubar durante a noite a 20 graus Celsius. Mais tarde, inativar a liga ligase T4 a 70 graus Celsius por 20 minutos.Inoculada escherichia coli em caldo de Luria Bertani Miller e incubar a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM até que uma densidade óptica entre 0,4 e 0,6 seja observada. Pelota a cultura bacteriana por centrifugação a 5.000 vezes G e quatro graus Celsius por 15 minutos. Suspenda a pelota em água destilada resfriada e repita o processo de limpeza mais duas vezes.Transfira a suspensão da bactéria para tubos de microfuge e repita a centrifugação a 14.000 vezes G e quatro graus Celsius por cinco minutos. Depois de reutilizar a pelota em água gelada, adicione aproximadamente 3,5 microliters da mistura de ligadura e incubar no gelo por cinco minutos. Transfira o conteúdo para uma cuvette de eletroporação de dois milímetros refrigerado.Após a eletroporação adicione o meio SOC e transfira o conteúdo para um tubo de cultura. Incubar por uma hora a 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. Emplaque as células transformadas em placas de ágar LB suplementadas com clorofenicol.Verifique a inserção da construção de exclusão em pDM4 pelo PCR usando primers que flanqueiam o lado da clonagem pDM4. Prepare culturas durante a noite para que o receptor Aeromonas cofra resistente à rifampicina e duas cepas diferentes de Escherichia coli. A cepa do doador com o plasmídeo recombinante pDM4, e a cepa auxiliar com o plasmídeo PRK 2073 a 30 graus Celsius.Suspender o mesmo número de colônias de cepas de doadores, receptores e ajudantes em três tubos LB com 150 microliters de LB. Em seguida, em uma placa de ágar LB sem antibióticos misture as três suspensões bacterianas em duas gotas em um receptor para ajudar a proporção de doadores de cinco para um para um, e incubar a placa de frente durante a noite a 30 graus Celsius. Colher bactérias adicionando um mililitro de caldo LB à placa de ágar LB. Transfira a suspensão bacteriana para um tubo de microfuça cônico de 1,5 mililitro e vigorosamente vórtice.Espalhe 100 microliters da suspensão bacteriana em placas de ágar LB com rifampicina e clororamfenicol. Gire 200 microliters e 600 microliters das amostras, suspenda a pelota em 100 microliters de caldo LB e placa no ágar LB com rifampicina e clororamfenicol seguido de incubação. Realize um teste oxidase para confirmar que as colônias são Aeromonas.Confirme ainda a inserção do plasmídeo recombinante pDM4 na região cromossômica específica pelo PCR usando os primers E e F. Cresça as colônias recombinantes em dois mililitros de LB com 10% de sacarose e sem antibióticos durante a noite a 30 graus Celsius. Depois de preparar diferentes diluições culturais, placa 100 microlitres das culturas bacterianas e diluições na placa de ágar LB com 10% de sacarose e incubar durante a noite a 30 graus Celsius.No dia seguinte, pegue as colônias e transfira-as para placas LB com e sem clororamfenicol. Depois de incuba-los durante a noite a 30 graus Celsius, selecione as colônias sensíveis ao cloroamfenicol. Analise as colônias sensíveis por PCR usando o par de primers EF e selecione as colônias cujo produto PCR está correlacionado com o tamanho da construção excluída.Coloque uma pequena gota de silicone nos quatro cantos do slide da tampa e monte a cultura cultivada durante a noite de Aeromonas em um slide de cobertura. Coloque um slide escavado no slide da tampa e vire o slide de cabeça para baixo. Analise a motilidade da natação por microscopia leve usando um microscópio óptico, em seguida, transfira três microlitros da cultura para o centro de uma placa de ágar macia.Incubar a placa de frente para cima durante a noite entre 25 e 30 graus Celsius. Usando uma régua no final da incubação, meça a migração bacteriana do centro da placa em direção à periferia através do ágar. Cultura Aeromonas se esforça durante a noite em 900 mililitros TSB entre 25 e 30 graus Celsius.Após a centrifugação, suspenda a pelota em 20 mililitros de 100 mililitros tris tampão de cloreto de hidrogênio de pH 7.8. Para remover a flagela ancorada, ria a suspensão em um vórtice com uma barra de vidro por três a quatro minutos, e depois passe repetidamente por uma seringa calibre 21. Pellule a bactéria por duas centrífugas consecutivas a quatro graus Celsius e colete o sobrenatante em um tubo separado.Depois de ultracentrifugar o supernascer, suspenda a pelota em 150 microliters de 100 mililitros de hidrogênio Tris contendo dois amortecedores EDTA milimolares. Transfira 150 microliters da fração enriquecida de flagela para um tubo ultra claro murado fino, e encha-o com 12 mililitros de solução de cloreto de césio. Ultracentrificar o tubo a 60.000 vezes G por 48 horas a quatro graus Celsius em um rotor de balde balançando.Colete a banda flagela no gradiente de cloreto de césio com uma seringa e dialyze contra cloreto de hidrogênio Tris de 100 milimolar mais dois milimolares EDTA seguido de análise por eletroforese e coloração azul Coomassie ou espectrometria de massa. Na figura a seguir, a pista WT é Aeromonas piscicola AH3. As pistas de um a oito mostram colônias sensíveis ao clorofínico da segunda recombinação.ST é marcador de 1KB de hiper bexiga. As pistas de um a três e cinco a oito mostram as colônias com o gene FGI4 tipo selvagem como pista WT. Lane quatro mostra uma colônia com o gene FGI4 excluído. Os ensaios de microscopia leve mostraram que modificações polares ou laterais de flagela só levam a reduções nos diâmetros de migração, assim, os mutantes AH-3 FGI e AH-3 FGI-4 mostram apenas a redução da motilidade em relação à cepa do tipo selvagem.A figura mostra flagelo polar de AH-3 da pista um, e os não mutantes na região FGI da pista dois e gene FGI-4 da pista três, onde ambos os mutantes têm flagellins polares com menor peso molecular do que a cepa tipo selvagem, o que sugere alterações naflaella glycan. É importante garantir que as mutações não afetem genes a jusante e levem a incapacidade para o conjunto flagella ou a incapacidade de filamentos de flagela. Quando a mudança nas proteínas flagellin não são detectáveis, a análise de espectrometria de massa é necessária usando a proteína total de peptídeos flagellin para conhecer a massa glican.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Imunologia e Infecção

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Medir a carga bacteriana e resposta imune em camundongos infectados com Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

A saliva, glândula salivar, e Coleta de hemolinfa de carrapatos Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Imagem bacteriana Bioluminescent<em&gt; Em Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Métodos para inibir bacteriana Pyomelanin Produção e determinar o correspondente aumento de sensibilidade ao estresse oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualização de Twitching motilidade e Caracterização do papel da<em&gt; PilG</em&gt; in<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Ensaios para estudar o papel do vitronectina na adesão bacteriana e resistência de soro

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...