Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el National Research Council Canada, para el Plan Nacional de I+D (Ministerio de Economía y Competitividad, España) y para la Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

La representación esquemática del procedimiento se muestra en la Figura 1.
1. Identificación bioinformática de la isla de glicosilación de flagelos (IFG) en Aeromonas
<ol><li>Para identificar los grupos biosintéticos de PseAc en los genomas de Aeromonas , utilice la herramienta tblastn de la base de datos NCBI26. Primero, recupere las proteínas ortólogas a PseC y PseI de A. piscicola...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. 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El primer paso crítico de este método es la identificación de regiones involucradas en la glicosilación de flagelos y GTs putativos porque estas enzimas muestran alta homología y están involucradas en muchos procesos. El análisis bioinformático de los genomas de Aeromonas en bases de datos públicas muestra que esta región es adyacente a la región de flagelos polares 2, que contiene los genes de flagelina en muchas cepas y contiene genes involucrados en la biosíntesis del ácido pseudamínico<sup clas...

La glicosilación proteica se ha descrito tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas y consiste en la unión covalente de un glicano a una cadena lateralde aminoácidos 1,2. En los procariotas, este proceso generalmente ocurre a través de dos mecanismos enzimáticos principales: O- y N-glicosilación 3. En la O-glicosilación, el glicano se une al grupo hidroxilo de un residuo de serina (Ser) o treonina (Thr). En la N-glicosilación, el glicano se une a la cadena lateral de nitrógeno amida de un residuo de asparagina (Asn) dentro de las secuencias de tripéptidos Asn-X-Ser/Thr, donde X podría ser cualquier aminoácido excepto prolina.
Los glicanos pueden adoptar estructuras lineales o ramificadas y están compuestos de monosacáridos o polisacáridos unidos covalentemente por enlaces glicosídicos. En los procariotas, los glicanos suelen mostrar diversidad en la composición y estructura del azúcar en comparación con los glicanos eucariotas4. Además, se han descrito dos vías de glicosilación bacteriana diferentes que difieren en la forma en que el glicano se ensambla y se transfiere a la proteína aceptora: glicosilación secuencial y en bloque 5,6. Para la glicosilación secuencial, el complejo glicano se acumula directamente sobre la proteína mediante la adición sucesiva de monosacáridos. En la glicosilación en bloque, un glicano preensamblado se transfiere a la proteína desde un oligosacárido ligado a lípidos por una oligosacarilasa especializada (OTasa). Se ha demostrado que ambas vías están involucradas en los procesos de glicosilación N y O 7.
La glicosilación de proteínas tiene un papel en la modulación de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de las proteínas. La presencia de un glicano puede influir en cómo la proteína interactúa con su ligando, lo que afecta la actividad biológica de la proteína, pero también puede afectar la estabilidad de la proteína, la solubilidad, la susceptibilidad a la proteólisis, la inmunogenicidad y las interacciones microbio-huésped 8,9. Sin embargo, varios parámetros de glicosilación, como el número de glicanos, la composición del glicano, la posición y el mecanismo de unión, también podrían afectar la función y la estructura de la proteína.
Las glicosiltransferasas (GT) son las enzimas clave en la biosíntesis de glicanos complejos y glicoconjugados. Estas enzimas catalizan la formación de enlaces glicosídicos entre una fracción de azúcar de una molécula donante activada y un aceptor de sustrato específico. Los GT pueden usar nucleótidos y no nucleótidos como moléculas donantes y dirigirse a diferentes aceptores de sustrato, como proteínas, sacáridos, ácidos nucleicos y lípidos10. Por lo tanto, comprender los GT a nivel molecular es importante para identificar sus mecanismos de acción y especificidad, y también permite comprender cómo la composición de azúcar de los glicanos que modifican moléculas relevantes se relaciona con la patogenicidad. La carbohydrate Active enzyme database (CAZy)11 clasifica los GT según su homología de secuencia, lo que proporciona una herramienta predictiva ya que, en la mayoría de las familias GT, el pliegue estructural y los mecanismos de acción son invariantes. Sin embargo, cuatro razones dificultan la predicción de la especificidad del sustrato de muchos GT: 1) no se ha determinado un motivo de secuencia claro que determine la especificidad del sustrato en procariotas12, 2) muchos GT y OT muestran promiscuidad del sustrato13,14, 3) los GT funcionales son difíciles de producir en alto rendimiento en forma recombinante y 4) la identificación de sustratos donantes y aceptores es compleja. A pesar de ello, recientes estudios de mutagénesis han permitido obtener avances significativos en la comprensión de los mecanismos catalíticos y restar la unión de los GT.
En las bacterias, la O-glicosilación parece ser más frecuente que la N-glicosilación. Los sitios de O-glicosilación no muestran una secuencia de consenso, y muchas de las proteínas O-glicosiladas son secretadas o proteínas de la superficie celular, como flagelinas, pili o autotransportadores1. La glicosilación de flagelina muestra variabilidad en el número de sitios aceptores, la composición de glicanos y la estructura. Por ejemplo, Burkholderia spp flagellins tienen solo un sitio de aceptación, mientras que en Campylobacter jejuni, flagellins tienen hasta 19 sitios de aceptación15,16. Además, para algunas bacterias, el glicano es un solo monosacárido, mientras que otras bacterias poseen glicanos heterogéneos comprometidos de diferentes monosacáridos para formar oligosacáridos. Esta heterogenicidad ocurre incluso entre cepas de la misma especie. Las flagelinas de Helicobacter solo son modificadas por el ácido pseudamínico (PseAc)17, y las flagelinas de Campylobacter pueden ser modificadas por PseAc, la forma acetamidino del ácido pseudaminic (PseAm) o ácido legionamínico (LegAm), y los glicanos derivados de estos azúcares con acetil, N-acetilglucosamina o sustituciones propiónicas18,19. En Aeromonas, las flagelinas son modificadas por glicanos cuya composición varía desde un solo derivado ácido PseAc hasta un heteropolisacárido20, y la unión de glicanos a los monómeros de flagelina es siempre a través de un derivado PseAc.
En general, la glicosilación de las flagelinas es esencial para el ensamblaje del filamento flagelar, la motilidad, la virulencia y la especificidad del huésped. Sin embargo, mientras que flagelinas de C. jejuni16, H. pylori17, y Aeromonas sp. 21 no puede ensamblarse en filamento a menos que los monómeros de proteínas sean glicosilados, Pseudomonas spp. y Burkholderia spp. 15 no requieren glicosilación para el ensamblaje de flagelos. Además, en algunas cepas de C. jejuni , los cambios en la composición de azúcar del glicano flagelo afectan la interacción bacteriano-huésped y pueden desempeñar un papel en la evasión de ciertas respuestas inmunes16. La autoaglutinación es otra característica fenotípica afectada por modificaciones en la composición de los glicanos asociados con las flagelinas. Una menor autoaglutinación conduce a una reducción en la capacidad de formar microcolonias ybiopelícula 22. En algunas bacterias, la capacidad de los flagelos para desencadenar una respuesta proinflamatoria se relacionó con la glicosilación de flagelina. Así, en P. aeruginosa, la flagelina glicosilada induce una mayor respuesta proinflamatoria que la23 no glicosilada.
Las aeromonas son bacterias Gram-negativas omnipresentes en el medio ambiente, lo que les permite estar en la interfaz de todos los componentes de One Health 24. Las Aeromonas mesófilas tienen un solo flagelo polar, que se produce constitutivamente. Más de la mitad de los aislados clínicos también expresan flagelina lateral, inducible en medios o placas de alta viscosidad. Diferentes estudios han relacionado ambos tipos de flagelos con las primeras etapas de la patogénesis bacteriana25. Mientras que las flagelinas polares reportadas hasta la fecha son O-glicosiladas a 5-8 Ser o Thr residuos de sus dominios inmunogénicos centrales, las flagelinas laterales no son O-glicosiladas en todas las cepas. Aunque los glicanos de flagelo polar de diferentes cepas muestran diversidad en su composición de carbohidratos y longitudde cadena 20, se ha demostrado que el azúcar de enlace es un derivado del ácido pseudaminic.
El objetivo de este manuscrito es describir un método para obtener mutantes nulos en GTs específicos o regiones cromosómicas que contienen GT para analizar su participación en la biosíntesis de polisacáridos relevantes y en la patogenicidad bacteriana, así como el papel del propio glicano. Como ejemplo, identificamos y eliminamos una región cromosómica que contiene GT de Aeromonas para establecer su implicación en la glicosilación polar de flagelina y analizar el papel del glicano de flagelina. Mostramos cómo eliminar un GT específico para establecer su función en la biosíntesis de este glicano y el papel del glicano modificado. Aunque utilizando Aeromonas como ejemplo, el principio se puede utilizar para identificar y estudiar islas de glicosilación de flagelos de otras bacterias Gram-negativas y analizar la función de los GT implicados en la biosíntesis de otros glicanos como el lipopolisacárido del antígeno O.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

El estudio de la glicosilación en procariotas es un área de rápido crecimiento. Las bacterias albergan diferentes estructuras glicosiladas en su superficie cuyos glicanos constituyen un código de barras específico de la cepa. Los glicanos asociados muestran una mayor diversidad en la composición y estructura del azúcar que los de los eucariotas y son importantes en los procesos de reconocimiento bacteriano-huésped y la interacción con el medio ambiente. En las bacterias patógenas, las glicoproteínas han estado involucradas en diferentes etapas del proceso infeccioso, y las modificaciones de los glicanos pueden interferir con las funciones específicas de las glicoproteínas. Sin embargo, a pesar de los avances realizados en la comprensión de la composición, la estructura y las vías de biosíntesis de los glicanos, la comprensión del papel de las glicoproteínas en la patogenicidad o la interacción con el medio ambiente sigue siendo muy limitada. Además, en algunas bacterias, las enzimas requeridas para la glicosilación de proteínas se comparten con otras vías biosintéticas de polisacáridos, como las vías biosintéticas de lipopolisacáridos y cápsulas. La importancia funcional de la glicosilación se ha dilucidado en varias bacterias a través de la mutación de genes específicos que se cree que están involucrados en el proceso de glicosilación y el estudio de su impacto en la expresión de la glicoproteína objetivo y el glicano modificador. Las Aeromonas mesófilas tienen un flagelo polar único y O-glicosilado. Los glicanos flagelares muestran diversidad en la composición de carbohidratos y la longitud de la cadena entre las cepas de Aeromonas . Sin embargo, todas las cepas analizadas hasta la fecha muestran un derivado del ácido pseudamínico como el azúcar de enlace que modifica los residuos de serina o treonina. El derivado del ácido pseudamínico es necesario para el ensamblaje de flagelos polares, y su pérdida tiene un impacto en la adhesión, la formación de biopelículas y la colonización. El protocolo detallado en este artículo describe cómo se puede utilizar la construcción de mutantes nulos para comprender la participación de genes o regiones del genoma que contienen glicosiltransferasas putativas en la biosíntesis de un glicano flagelar. Esto incluye el potencial para comprender la función de las glicosiltransferasas involucradas y el papel del glicano. Esto se logrará comparando el mutante deficiente en glicanos con la cepa de tipo salvaje.

Esta metodología proporciona un sistema eficaz para generar mutantes nulos en genes o regiones cromosómicas de Aeromonas que pueden afectar la glicosilación de flagelos y el papel del filamento de flagelos (Figura 1).
El protocolo comienza con la identificación bioinformática de los supuestos IGI y los genes que codifican los GT presentes en esta región. En Aeromonas, la localización cromosómica de los FGIs se basa en la detección de tre...

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Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Aquí, describimos la construcción de mutantes nulos de Aeromonas en glicosiltransferasas específicas o regiones que contienen glicosiltransferasas, los ensayos de motilidad y la purificación de flagelos realizados para establecer la participación y función de sus enzimas codificadas en la biosíntesis de un glicano, así como el papel de este glicano en la patogénesis bacteriana.

Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Por lo tanto, los derivados del ácido neumínico solo están presentes en bacterias patógenas, los flagelos aminiglicosilados contienen este azúcar. En el marco, la deleción de la región contenida en los genes puede ayudar a encontrar grupos de glicosilación de flagelos. Esta técnica, la última región o genes específicos, como las glicosiltransferasas que tienen una alta homología entre ellas y están implicadas en diferentes procesos, y analizan su implicación en el proceso de glicosilación de flagelos.Esta técnica también puede ayudar a encontrar el papel de las glicosiltransferasas involucradas en la biosíntesis de polisacáridos relevantes en bacterias patógenas y también el papel de las proteínas codificantes de genes involucradas en la formación de flagelos. Demostrando el procedimiento estará Maite Polo, técnica de mi laboratorio. Diseñe dos pares de cebadores que amplifiquen las regiones de ADN aguas arriba y aguas abajo del gen o región seleccionada que se eliminará.Los cebadores A y D deben incluir en los cinco extremos primos, un sitio de restricción para una endonucleasa que permita la clonación en pDM4. Asegúrese de que los cebadores B y C estén dentro del gen que se va a eliminar o dentro del primer y último gen de la región que se va a eliminar. Asegúrese de que ambos cebadores estén en el marco y ubicados entre cinco y seis codones dentro del gen.Asegúrese de que ambos cebadores incluyan una secuencia complementaria de 21 pares de bases en los cinco extremos principales para unir los amplicones de ADN AB y CD.Utilice 100 nanogramos de ADN cromosómico purificado como plantilla en dos conjuntos de PCR asimétricas con cebadores AB y CD seguidos del análisis de los productos resultantes en gel de agarosa al 1%. Purificar y cuantificar los amplicones extirpados del gel electroforético. Mezclar 100 nanogramos de cada amplicón con reactivos de PCR sin imprimación.Después de extenderlo, agregue imprimaciones A y D y amplíelas como un solo fragmento. A continuación, analice, purifique y cuantifique los productos resultantes como se describió anteriormente. Digiera un microgramo de pDM4 y 400 nanogramos de amplicón AD con una endonucleasa.Combine la pDM4 digerida con el amplicóN AD en un vector molar para insertar una proporción de uno a cuatro y preparar la reacción de ligadura. Incubar durante la noche a 20 grados centígrados. Más tarde, inactivar la ligasa T4 a 70 grados centígrados durante 20 minutos.Inocular la cepa de Escherichia coli en caldo Luria Bertani Miller e incubar a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM hasta observar una densidad óptica entre 0,4 y 0,6. Pellet el cultivo de bacterias por centrifugación a 5.000 veces G y cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Suspenda el pellet en agua destilada refrigerada y repita el proceso de limpieza dos veces más.Transfiera la suspensión de bacterias a tubos de microfugas y repita la centrifugación a 14.000 veces G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Después de volver a suspender el pellet en agua fría, agregue aproximadamente 3.5 microlitros de la mezcla de ligadura e incube en hielo durante cinco minutos. Transfiera el contenido a una cubeta de electroporación de dos milímetros refrigerada.Después de la electroporación, agregue el medio SOC y transfiera el contenido a un tubo de cultivo. Incubar durante una hora a 30 grados centígrados con agitación a 200 RPM. Placa las células transformadas en placas de agar LB suplementadas con cloranfenicol.Verifique la inserción de la construcción de eliminación en pDM4 mediante PCR utilizando cebadores que flanqueen el lado de clonación de pDM4. Prepare cultivos nocturnos para que el receptor de la cepa Aeromonas sea resistente a la rifampicina y dos cepas diferentes de Escherichia coli. La cepa donante con el plásmido recombinante pDM4 y la cepa auxiliar con el plásmido PRK 2073 a 30 grados centígrados.Suspender el mismo número de colonias de las cepas donante, receptora y ayudante en tres tubos LB con 150 microlitros de LB. Luego, en una placa de agar LB sin antibióticos, mezcle las tres suspensiones bacterianas en dos gotas en un receptor para ayudar a la proporción de donante de cinco a uno a uno, e incube la placa boca arriba durante la noche a 30 grados centígrados. Cosecha las bacterias agregando un mililitro de caldo LB a la placa de agar LB. Transfiera la suspensión bacteriana a un tubo cónico de microfugio de 1,5 mililitros y vórtice vigoroso.Extienda 100 microlitros de la suspensión bacteriana en placas de agar LB con rifampicina y cloranfenicol. Haga girar 200 microlitros y 600 microlitros de las muestras, suspenda el pellet en 100 microlitros de caldo LB y plato en agar LB con rifampicina y cloranfenicol seguido de incubación. Realizar una prueba de oxidasa para confirmar que las colonias son Aeromonas.Confirmar además la inserción de plásmido recombinante pDM4 en la región cromosómica específica mediante PCR utilizando los cebadores E y F. Cultive las colonias recombinantes en dos mililitros de LB con 10% de sacarosa y sin antibióticos durante la noche a 30 grados centígrados. Después de preparar diferentes diluciones de cultivo, placa 100 microlitros de los cultivos bacterianos y diluciones en placa de agar LB con 10% de sacarosa e incubar durante la noche a 30 grados centígrados.Al día siguiente, recoja las colonias y transfiéralas a placas LB con y sin cloranfenicol. Después de incubarlos durante la noche a 30 grados centígrados, seleccione las colonias sensibles al cloranfenicol. Analice las colonias sensibles por PCR utilizando el par de cebadores EF y seleccione las colonias cuyo producto de PCR se correlacionó con el tamaño de la construcción eliminada.Coloque una pequeña gota de silicona en las cuatro esquinas del portaobjetos de la cubierta y monte el cultivo cultivado durante la noche de Aeromonas en un portaobjetos de cubierta. Coloque una corredera excavada en la corredera de la cubierta y gire la corredera boca abajo. Analice la motilidad de la natación mediante microscopía de luz utilizando un microscopio óptico, luego transfiera tres microlitros del cultivo al centro de una placa de agar blando.Incubar la placa boca arriba durante la noche entre 25 y 30 grados centígrados. Usando una regla al final de la incubación, mida la migración bacteriana desde el centro de la placa hacia la periferia a través del agar. Cultivo Aeromonas se cuela durante la noche en 900 mililitros TSB entre 25 y 30 grados centígrados.Después de la centrifugación, suspenda el pellet en 20 mililitros de tampón de cloruro de hidrógeno Tris milimolar de pH 7.8. Para quitar los flagelos anclados, coloque la suspensión en un vórtice con una barra de vidrio durante tres o cuatro minutos, y luego pase repetidamente a través de una jeringa de calibre 21. Peletizar la bacteria mediante dos centrifugaciones consecutivas a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante en un tubo separado.Después de ultracentrifugar el sobrenadante, suspenda el pellet en 150 microlitros de cloruro de hidrógeno Tris milimolar 100 que contiene dos tampones milimolares de EDTA. Transfiera 150 microlitros de la fracción enriquecida de flagelos a un tubo ultra claro de pared delgada y llénelo con 12 mililitros de solución de cloruro de cesio. Ultracentrifugar el tubo a 60.000 veces G durante 48 horas a cuatro grados centígrados en un rotor de cucharón oscilante.Recoger la banda de flagelos en el gradiente de cloruro de cesio con una jeringa y dializar contra cloruro de hidrógeno Tris 100 milimolar más dos milimolares EDTA seguido de análisis por electroforesis y tinción azul de Coomassie o espectrometría de masas. En la siguiente figura, el carril WT es Aeromonas piscicola AH3. Los carriles uno a ocho muestran colonias sensibles al cloranfenicol de la segunda recombinación.ST es un marcador de hiper vejiga de 1KB. Los carriles uno a tres y cinco a ocho muestran las colonias con el gen FGI4 de tipo salvaje como carril WT. El carril cuatro muestra una colonia con el gen FGI4 eliminado. Los ensayos de microscopía de luz mostraron que las modificaciones de flagelos polares o laterales solo conducen a reducciones en los diámetros de migración, por lo tanto, los mutantes AH-3 FGI y AH-3 FGI-4 muestran solo una motilidad reducida en relación con la cepa de tipo salvaje.La figura muestra el flagelo polar de AH-3 del carril uno, y los no mutantes en la región FGI del carril dos y el gen FGI-4 del carril tres, en el que ambos mutantes tienen flagelinas polares con menor peso molecular que la cepa de tipo salvaje, lo que sugiere alteraciones en los flagelos de glicano. Es importante asegurarse de que las mutaciones no afecten a los genes aguas abajo y conduzcan a la incapacidad del ensamblaje de flagelos o a la incapacidad de filamentos de flagelos. Cuando el cambio en las proteínas de flagelina no es detectable, se requiere un análisis de espectrometría de masas utilizando la proteína total de los péptidos de flagelina para conocer la masa de glicanos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Luciferasa utilizando a las infecciones bacterianas de la imagen en ratones

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Investigación

Inmunología e Infección

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

La medición de la carga bacteriana y la respuesta inmune en ratones infectados con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

La saliva, la glándula salival, y la Colección hemolinfa de las garrapatas Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Imágenes bacteriana Bioluminiscente<em&gt; En Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Métodos para inhibir bacteriana Pyomelanin Producción y determinar el correspondiente aumento en la sensibilidad al estrés oxidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

La visualización de Contracciones Motilidad y caracterización del papel de la<em&gt; Pilg</em&gt; en<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Ensayos para estudiar el rol de vitronectina en la adhesión bacteriana y resistencia de suero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...