Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Research Council Canada, för Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) och för Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Den schematiska representationen av proceduren visas i figur 1.
1. Bioinformatisk identifiering av flagellaglykosyleringsö (GCI) i Aeromonas
<ol><li>För att identifiera PseAc biosyntetiska kluster i Aeromonas genom, använd tblastn-verktyget från NCBI-databasen26. Hämta först ortologa proteiner till PseC och PseI av A. piscicola AH-3 (identifieringskoderna är OCA61126.1 och OCA611...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacteria:+sweeter+than+ever.">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Never+say+never+again:+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria.">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li><li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+sugars+sticking+out.">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li><li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferases:+structures,+functions,+and+mechanisms.">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li><li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate-active+enzymes+database+(CAZy)+in+2013.">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).</li><li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine-linked+protein+glycosylation:+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems.">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).</li><li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation.">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems.">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li><li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li><li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin.">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li><li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural,+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori.">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li><li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum.">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li><li>Kov&#225;cs, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction.">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703 (1956).</li><li>Fulton, K. M., Mendoza-Barber&#225;, E., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+(Serotype+O11).">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li><li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology,+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida.">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).</li><li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

Det kritiska tidiga steget i denna metod är identifieringen av regioner som är involverade i glykosylering av flageller och förmodade GT eftersom dessa enzymer visar hög homologi och är involverade i många processer. Bioinformatisk analys av Aeromonas genom i offentliga databaser visar att denna region ligger intill den polära flagellregionen 2, som innehåller flagellingenerna i många stammar och innehåller gener som är involverade i biosyntesen av pseudaminsyra27. Detta har gj...

Proteinglykosylering har beskrivits i både grampositiva och gramnegativa bakterier och består av den kovalenta bindningen av en glykan till en aminosyra sidokedja 1,2. I prokaryoter sker denna process vanligtvis via två stora enzymatiska mekanismer: O- och N-glykosylering 3. Vid O-glykosylering är glykanen bunden till hydroxylgruppen av en serin (Ser) eller treonin (Thr) rest. Vid N-glykosylering är glykanen bunden till sidokedjeamidkväve av en asparagin (Asn) rest inom tripeptidsekvenserna Asn-X-Ser / Thr, där X kan vara vilken aminosyra som helst utom prolin.
Glykaner kan anta linjära eller grenade strukturer och består av monosackarider eller polysackarider kovalent kopplade av glykosidbindningar. I prokaryoter visar glykaner vanligtvis mångfald i sockerkomposition och struktur i jämförelse med eukaryota glykaner4. Vidare har två olika bakteriella glykosyleringsvägar som skiljer sig åt i hur glykanen sätts ihop och överförs till acceptorproteinet beskrivits: sekventiell och en bloc glykosylering 5,6. För sekventiell glykosylering byggs den komplexa glykanen upp direkt på proteinet genom successiv tillsats av monosackarider. Vid en bloc glykosylering överförs en förmonterad glykan till proteinet från en lipidbunden oligosackarid genom ett specialiserat oligosackaryltransferas (OTase). Båda vägarna har visat sig vara involverade i N- och O-glykosyleringsprocesser 7.
Proteinglykosylering har en roll i modulering av de fysikalisk-kemiska och biologiska egenskaperna hos proteiner. Närvaron av en glykan kan påverka hur proteinet interagerar med sin ligand, vilket påverkar proteinets biologiska aktivitet, men kan också påverka proteinstabilitet, löslighet, mottaglighet för proteolys, immunogenicitet och mikrob-värdinteraktioner 8,9. Emellertid kan flera glykosyleringsparametrar, såsom antalet glykaner, glykansammansättning, position och bindningsmekanism, också påverka proteinfunktionen och strukturen.
Glykosyltransferaser (GT) är de viktigaste enzymerna i biosyntesen av komplexa glykaner och glykokonjugat. Dessa enzymer katalyserar den glykosidiska bindningsbildningen mellan en sockerdel från en aktiverad donatormolekyl och en specifik substratacceptor. GT kan använda både nukleotider och icke-nukleotider som donatormolekyler och rikta in sig på olika substratacceptorer, såsom proteiner, sackarider, nukleinsyror och lipider10. Därför är det viktigt att förstå GT på molekylär nivå för att identifiera deras verkningsmekanismer och specificitet, och gör det också möjligt att förstå hur sockerkompositionen hos glykaner som modifierar relevanta molekyler är relaterade till patogenicitet. Kolhydrataktiv enzymdatabas (CAZy)11 klassificerar GT enligt deras sekvenshomologi, vilket ger ett prediktivt verktyg eftersom i de flesta GT-familjerna är den strukturella vikningen och verkningsmekanismerna invarianta. Fyra skäl gör det dock svårt att förutsäga substratspecificitet hos många GT: 1) inget tydligt sekvensmotiv som bestämmer substratspecificitet har bestämts i prokaryoter12, 2) många GT och OTases visar substratpromiskuitet 13,14, 3) funktionella GT är svåra att producera i högt utbyte i rekombinant form och 4) identifieringen av både donator- och acceptorsubstrat är komplex. Trots detta har de senaste mutagenesstudierna gjort det möjligt att erhålla betydande framsteg i förståelsen av katalytiska mekanismer och subtrahera bindning av GT.
I bakterier verkar O-glykosylering vara vanligare än N-glykosylering. O-glykosyleringsställena visar ingen konsensussekvens, och många av de O-glykosylerade proteinerna utsöndras eller cellyteproteiner, såsom flagelliner, pili eller autotransporter1. Flagellin glykosylering visar variation i antalet acceptorställen, glykankomposition och struktur. Till exempel har Burkholderia spp flagellins bara en acceptorplats, medan i Campylobacter jejuni har flagelliner så många som 19 acceptorplatser15,16. Vidare är glykanen för vissa bakterier en enda monosackarid, medan andra bakterier har heterogena glykaner som komprometteras av olika monosackarider för att bilda oligosackarider. Denna heterogenitet förekommer även bland stammar av samma art. Helicobacter flagelliner modifieras endast av pseudaminsyra (PseAc)17, och Campylobacter flagelliner kan modifieras av PseAc, acetamidinoformen av pseudaminsyra (PseAm) eller legionaminsyra (LegAm) och glykaner härledda från dessa sockerarter med acetyl, N-acetylglukosamin eller propioniska substitutioner18,19. I Aeromonas modifieras flagelliner av glykaner vars sammansättning sträcker sig från ett enda PseAc-syraderivat till en heteropolysackarid20, och bindningen av glykaner till flagellinmonomererna sker alltid via ett PseAc-derivat.
I allmänhet är glykosylering av flagelliner avgörande för flagellär filamentmontering, rörlighet, virulens och värdspecificitet. Men medan flagelliner av C. jejuni16, H. pylori17 och Aeromonas sp. 21 kan inte sättas ihop till filament om inte proteinmonomererna är glykosylerade, Pseudomonas spp. 15 kräver inte glykosylering för flagellamontering. Dessutom, i vissa C. jejuni-stammar, påverkar förändringar i sockersammansättningen av flagellaglykan bakteriell-värdinteraktion och kan spela en roll för att undvika vissa immunsvar16. Autoagglutination är en annan fenotypisk egenskap som påverkas av modifieringar i sammansättningen av glykaner associerade med flagelliner. En lägre autoagglutination leder till en minskning av förmågan att bilda mikrokolonier och biofilm22. I vissa bakterier var flagellens förmåga att utlösa ett proinflammatoriskt svar kopplat till flagellinglykosylering. Således inducerar glykosylerat flagellin i P. aeruginosa ett högre proinflammatoriskt svar än otykosylerat23.
Aeromonas är gramnegativa bakterier som finns överallt i miljön, vilket gör att de kan vara i gränssnittet för alla One Health-komponenter 24. Mesofila Aeromonas har ett enda polärt flagellum, som är konstitutivt producerat. Mer än hälften av kliniska isolat uttrycker också lateral flagellin, inducerbar i medier eller plattor med hög viskositet. Olika studier har relaterat båda flagelltyperna med de tidiga stadierna av bakteriell patogenes25. Medan polära flagelliner som hittills rapporterats är O-glykosylerade vid 5-8 Ser- eller Thr-rester av dess centrala immunogena domäner, är laterala flagelliner inte O-glykosylerade i alla stammar. Även om polära flagellaglykaner från olika stammar visar mångfald i sin kolhydratsammansättning och kedjelängd20, har det länkande sockret visat sig vara ett pseudaminsyraderivat.
Målet med detta manuskript är att beskriva en metod för att erhålla nollmutanter i specifika GT eller kromosomala regioner innehållande GT för att analysera deras engagemang i biosyntesen av relevanta polysackarider och i bakteriell patogenicitet, liksom glykanens roll. Som ett exempel identifierar och tar vi bort en kromosomal region som innehåller GT av Aeromonas för att fastställa dess engagemang i polär flagellinglykosylering och analysera flagellinglykanens roll. Vi visar hur man tar bort en specifik GT för att fastställa dess funktion i biosyntesen av denna glykan och rollen som modifierad glykan. Även om aeromonas används som exempel kan principen användas för att identifiera och studera flagellaglykosyleringsöar av andra gramnegativa bakterier och analysera funktionen hos GT som är involverade i biosyntesen av andra glykaner, såsom O-antigen lipopolysackarid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

Studien av glykosylering i prokaryoter är ett snabbt växande område. Bakterier har olika glykosylerade strukturer på ytan vars glykaner utgör en stamspecifik streckkod. De associerade glykanerna visar högre mångfald i sockerkomposition och struktur än hos eukaryoter och är viktiga i bakteriell-värdigenkänningsprocesser och interaktion med miljön. I patogena bakterier har glykoproteiner varit involverade i olika stadier av den infektiösa processen, och glykanmodifieringar kan störa specifika funktioner hos glykoproteiner. Trots de framsteg som gjorts i förståelsen av glykankomposition, struktur och biosyntesvägar är förståelsen för glykoproteinernas roll i patogenicitet eller interaktion med miljön fortfarande mycket begränsad. Vidare delas i vissa bakterier de enzymer som krävs för proteinglykosylering med andra polysackaridbiosyntetiska vägar, såsom lipopolysackarid och kapselbiosyntetiska vägar. Den funktionella betydelsen av glykosylering har belysts i flera bakterier genom mutation av specifika gener som tros vara involverade i glykosyleringsprocessen och studien av dess inverkan på uttrycket av målglykoproteinet och den modifierande glykanen. Mesofila Aeromonas har en enda och O-glykosylerad polär flagellum. Flagellärglykaner visar mångfald i kolhydratsammansättning och kedjelängd mellan Aeromonas-stammar . Alla stammar som hittills analyserats visar emellertid ett pseudaminsyraderivat som det länkande sockret som modifierar serin- eller treoninrester. Pseudaminsyraderivatet krävs för polär flagellamontering, och dess förlust har en inverkan på vidhäftning, biofilmbildning och kolonisering. Protokollet som beskrivs i denna artikel beskriver hur konstruktionen av nollmutanter kan användas för att förstå involveringen av gener eller genomregioner som innehåller förmodade glykosyltransferaser i biosyntesen av en flagellär glykan. Detta inkluderar potentialen att förstå funktionen hos de involverade glykosyltransferaserna och glykanens roll. Detta kommer att uppnås genom att jämföra glykanbristmutanten med vildtypsstammen.

Denna metod ger ett effektivt system för att generera nollmutanter i gener eller kromosomala regioner i Aeromonas som kan påverka flagellaglykosylering och flagellafilamentets roll (Figur 1).
Protokollet börjar med den bioinformatiska identifieringen av förmodade FGIs och generna som kodar för GT presenteras i denna region. I Aeromonas är den kromosomala placeringen av FGIs baserad på detektion av tre typer av gener: gener som är involver...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Här beskriver vi konstruktionen av nollmutanter av Aeromonas i specifika glykosyltransferaser eller regioner innehållande glykosyltransferaser, motilitetsanalyserna och flagellarening som utförs för att fastställa involveringen och funktionen hos deras kodade enzymer i biosyntesen av en glykan, liksom rollen för denna glykan i bakteriell patogenes.

Generering av nollmutanter för att belysa rollen som bakteriella glykosyltransferaser i bakteriell motilitet

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Så neurmininsyraderivat är endast närvarande i patogena bakterier, aminiglykosylerad flagella innehåller detta socker. I ramradering av region som finns i generna kan hjälpa till att hitta flagella glykosyleringskluster. Denna teknik, den senaste specifika regionen eller generna, såsom glykosyltransferaser som har hög homologi mellan dem och är involverade i olika processer och analyserar dess engagemang i flagellaglykosyleringsprocessen.Denna teknik kan också hjälpa till att hitta rollen av glykosyltransferaser som är involverade i biosyntesen av relevanta polysackarider i patogena bakterier och även rollen som genkodande proteiner som är involverade i flagellabildning. Att demonstrera proceduren kommer Maite Polo, en tekniker i mitt laboratorium. Designa två par primers som förstärker DNA-regioner uppströms och nedströms om den valda genen eller regionen som ska raderas.Primers A och D måste inkludera i femprimtalsänden, en begränsningsplats för ett endonukleas som tillåter kloning i pDM4. Se till att primers B och C finns i genen som ska raderas eller inuti den första och sista genen i regionen som ska raderas. Se till att båda primersna är i ram och ligger mellan fem till sex kodon inuti genen.Se till att båda primersna innehåller en 21 baspar gratis sekvens vid de fem primtalsänden för att sammanfoga DNA-amplikoner AB och CD.Använd 100 nanogram renat kromosomalt DNA som mall i två uppsättningar asymmetriska PCR med AB- och CD-primers följt av analys av resulterande produkter i 1% agarosgel. Rena och kvantifiera de utskurna amplikonerna från elektroforetisk gel. Blanda 100 nanogram av varje amplicon med PCR-reagens utan primer.Efter att ha förlängt det, tillsätt A- och D-primers och förstärk dem som ett enda fragment. Därefter analysera, rena och kvantifiera de resulterande produkterna som tidigare beskrivits. Smält ett mikrogram pDM4 och 400 nanogram AD-amplicon med ett endonukleas.Kombinera den smälta pDM4 med AD-amplicon vid en molär vektor för att infoga förhållandet mellan en och fyra och förbered ligeringsreaktionen. Inkubera över natten vid 20 grader Celsius. Senare inaktivera T4-ligasen vid 70 grader Celsius i 20 minuter.Inokulera Escherichia coli-stammen i Luria Bertani Miller-buljongen och inkubera vid 30 grader Celsius med skakning vid 200 RPM tills en optisk densitet mellan 0,4 och 0,6 observeras. Pelletera bakteriekulturen genom centrifugering vid 5 000 gånger G och fyra grader Celsius i 15 minuter. Suspendera pelleten i kylt destillerat vatten och upprepa rengöringsprocessen ytterligare två gånger.Överför bakteriesuspensionen till mikrofugerör och upprepa centrifugeringen vid 14 000 gånger G och fyra grader Celsius i fem minuter. Efter att pelleten har återsusperats i kylt vatten, tillsätt cirka 3,5 mikroliter av ligeringsblandningen och inkubera på is i fem minuter. Överför innehållet till en kyld två millimeters gapelektroporeringskuvett.Efter elektroporering tillsätt SOC-mediet och överför innehållet till ett odlingsrör. Inkubera i en timme vid 30 grader Celsius med skakning vid 200 rpm. Platta de transformerade cellerna på LB-agarplattor kompletterade med kloramfenikol.Kontrollera införandet av raderingskonstruktionen i pDM4 med PCR med hjälp av primers som flankerar pDM4-kloningssidan. Förbered kulturer över natten så att mottagaren Aeromonas stammar rifampicinresistent och två olika stammar av Escherichia coli. Donatorstammen med pDM4-rekombinant plasmid och hjälparstammen med PRK 2073-plasmiden vid 30 grader Celsius.Suspendera samma antal kolonier av givar-, mottagar- och hjälparstammarna i tre LB-rör med 150 mikroliter LB. Blanda sedan de tre bakteriesuspensionerna i två droppar på en LB-agarplatta utan antibiotika vid en mottagare till hjälpare till givarförhållande på fem till en till en och inkubera plattan uppåt över natten vid 30 grader Celsius. Skörda bakterier genom att tillsätta en milliliter LB-buljong till LB-agarplattan. Överför bakteriesuspensionen till ett koniskt 1,5 ml mikrofugerör och kraftigt virvel.Sprid 100 mikroliter av bakteriesuspensionen på LB-agarplattor med rifampicin och kloramfenikol. Snurra ner 200 mikroliter och 600 mikroliter av proverna, suspendera pelleten i 100 mikroliter LB-buljong och platta på LB-agar med rifampicin och kloramfenikol följt av inkubation. Utför ett oxidastest för att bekräfta att kolonierna är Aeromonas.Bekräfta ytterligare införandet av pDM4 rekombinant plasmid i den specifika kromosomala regionen med PCR med användning av E- och F-primrarna. Odla de rekombinanta kolonierna i två milliliter LB med 10% sackaros och utan antibiotika över natten vid 30 grader Celsius. Efter beredning av olika odlingsutspädningar, platta 100 mikroliter av bakteriekulturerna och utspädningar på LB-agarplattan med 10% sackaros och inkubera över natten vid 30 grader Celsius.Nästa dag, plocka upp kolonierna och överför dem till LB-plattor med och utan kloramfenikol. Efter att ha inkuberat dem över natten vid 30 grader Celsius, välj de kloramfenikolkänsliga kolonierna. Analysera de känsliga kolonierna med PCR med hjälp av EF-primerparet och välj de kolonier vars PCR-produkt korrelerade med storleken på den borttagna konstruktionen.Lägg en liten droppe silikon i de fyra hörnen på täckglaset och montera över natten odlad kultur av Aeromonas på en täckglas. Placera en utgrävd bild på omslagsbilden och vänd bilden upp och ner. Analysera simmotilitet med ljusmikroskopi med hjälp av ett optiskt mikroskop och överför sedan tre mikroliter av kulturen till mitten av en mjuk agarplatta.Inkubera plattan med framsidan uppåt över natten mellan 25 och 30 grader Celsius. Använd en linjal i slutet av inkubationen och mät bakteriemigrationen från plattcentret mot periferin genom agar. Kultur Aeromonas stammar över natten i 900 ml TSB mellan 25 och 30 grader Celsius.Efter centrifugering suspendera pelleten i 20 ml 100 millimolär Tris vätekloridbuffert med pH 7,8. För att ta bort den förankrade flagellen, skär suspensionen i en virvel med en glasstång i tre till fyra minuter och passera sedan repetitivt genom en 21 gauge spruta. Pelletera bakterierna genom två på varandra följande centrifugeringar vid fyra grader Celsius och samla supernatanten i ett separat rör.Efter ultracentrifugering av supernatanten, suspendera pelleten i 150 mikroliter av 100 millimolär Tris väteklorid innehållande två millimolar EDTA-buffert. Överför 150 mikroliter av den berikade fraktionen av flageller till ett tunnväggigt ultraklart rör och fyll det med 12 ml cesiumkloridlösning. Ultracentrifugera röret vid 60 000 gånger G i 48 timmar vid fyra grader Celsius i en svängande skopretor.Samla flagellabandet i cesiumkloridgradienten med en spruta och dialysera mot 100 millimolär Tris väteklorid plus två millimolar EDTA följt av analys med elektrofores och Coomassie blå färgning eller masspektrometri. I följande bild är körfält WT Aeromonas piscicola AH3. Körfält en till åtta visar kloramfenikolkänsliga kolonier av den andra rekombinationen.ST är hyperblåsan 1KB markör. Körfält ett till tre och fem till åtta visar kolonierna med vild typ FGI4-gen som lane WT. Lane four visar en koloni med den borttagna FGI4-genen. Ljusmikroskopianalyser visade att polära eller laterala flagellamodifieringar endast leder till minskningar av migrationsdiametrarna, så AH-3 FGI-mutant och AH-3 FGI-4-mutanter visar endast minskad rörlighet i förhållande till stammen av vild typ.Figuren visar polär flagellum från AH-3 i körfält ett, och no-mutanterna i FGI-regionen i körfält två och FGI-4-genen i körfält tre, där båda mutanterna har polära flagelliner med lägre molekylvikt än stammen av vild typ, vilket tyder på förändringar i flagellglykanen. Det är viktigt att se till att mutationer inte påverkar nedströms gener och leder oförmågan till flagellaaggregatet eller oförmågan hos filament av flagella. När förändring i flagellinproteiner inte är detekterbara krävs masspektrometrianalys med användning av det totala proteinet av flagellinpeptider för att känna till glykanmassan.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Använda luciferas till bild bakteriella infektioner hos möss

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Att mäta bakteriehalten och immunsvar hos möss som blivit infekterade med Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Introduktion Shear stress i studien av bakteriell vidhäftning

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliv, spottkörtel och hemolymfa Collection från Ixodes scapularis fästingar

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminiscent Bakteriell Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Använda Overlay-analys för att Kvalitativt Mät Bakteriell Produktion av och känslighet för pneumokockinfektioner bakteriociner

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder för att inhibera bakteriell Pyomelanin Produktion och Bestäm motsvarande ökning i känslighet för oxidativ stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualisering av Twitching rörlighet och karakterisering av roll<em&gt; PilG</em&gt; i<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Analyser för studerar roll för Aktiebolaget Trav &amp; galopp i bakteriell vidhäftning och Serum motstånd

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...