Name: generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Bu çalışma Kanada Ulusal Araştırma Konseyi tarafından, Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) için desteklenmiştir.

Prosedürün şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Aeromonas'ta flagella glikozilasyon adasının (FGI'lar) biyoinformatik tanımlanması
<ol><li>Aeromonas genomlarındaki PseAc biyosentetik kümelerini tanımlamak için, NCBI veritabanı26'daki tblastn aracını kullanın. İlk olarak, sıralanmış Aeromonas suşlarının veritabanlarından A. piscicola AH-3'ü...

<ol>
	<li>Sch&#228;ffer, C., Messner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+facets+of+prokaryotic+glycosylation.">Emerging facets of prokaryotic glycosylation.</a> FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).</li><li>De Maayer, P., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flashy+flagella:+flagellin+modification+is+relatively+common+and+highly+versatile+among+the+Enterobacteriaceae.">Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae.</a> BMC Genomics. 17, 377 (2016).</li><li>Nothaft, H., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacteria:+sweeter+than+ever.">Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever.</a> Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).</li><li>Benz, I., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Never+say+never+again:+protein+glycosylation+in+pathogenic+bacteria.">Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria.</a> Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).</li><li>Guerry, P., Szymanski, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+sugars+sticking+out.">Campylobacter sugars sticking out.</a> Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).</li><li>Hug, I., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogies+and+homologies+in+lipopolysaccharide+and+glycoprotein+biosynthesis+in+bacteria.">Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria.</a> Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).</li><li>Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pour+some+sugar+on+it:+the+expanding+world+of+bacterial+protein+O-linked+glycosylation.">Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation.</a> Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).</li><li>Szymanski, C. M., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+glycosylation+in+bacterial+mucosal+pathogens.">Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.</a> Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).</li><li>Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+coating:+bacterial+protein+glycosylation+and+host-microbe+interactions.">Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions.</a> Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).</li><li>Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosyltransferases:+structures,+functions,+and+mechanisms.">Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms.</a> Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).</li><li>Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carbohydrate-active+enzymes+database+(CAZy)+in+2013.">The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013.</a> Nucleic Acids Research. 42, 490-495 (2014).</li><li>Weerapana, E., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asparagine-linked+protein+glycosylation:+from+eukaryotic+to+prokaryotic+systems.">Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems.</a> Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).</li><li>Faridmoayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+substrate+promiscuity+of+the+Neisseria+oligosaccharyl+transferase+involved+in+protein+O-glycosylation.">Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).</li><li>Wacker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+bacterial+oligosaccharyltransferase+suggests+a+common+transfer+mechanism+for+the+bacterial+and+eukaryotic+systems.">Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).</li><li>Scott, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+glycosylation+in+Burkholderia+pseudomallei+and+Burkholderia+thailandensis.">Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).</li><li>Thibault, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+carbohydrate+moieties+and+glycosylation+motifs+in+Campylobacter+jejuni+flagellin.">Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).</li><li>Schirm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural,+genetic+and+functional+characterization+of+the+flagellin+glycosylation+process+in+Helicobacter+pylori.">Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).</li><li>McNally, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+metabolomics+analysis+of+Campylobacter+coli+VC167+reveals+legionaminic+acid+derivatives+as+novel+flagellar+glycans.">Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).</li><li>Logan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+carbohydrate+modifications+on+Campylobacter+jejuni+11168+flagellin+using+metabolomics-based+approaches.">Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches.</a> FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).</li><li>Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+glycosylation+of+polar+and+lateral+flagellins+in+Aeromonas+hydrophila+AH-3.">Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).</li><li>Canals, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-structural+flagella+genes+affecting+both+polar+and+lateral+flagella-mediated+motility+in+Aeromonas+hydrophila.">Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila.</a> Microbiology. 153, 1165-1175 (2007).</li><li>Howard, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Campylobacter+jejuni+glycosylation+island+important+in+cell+charge,+legionaminic+acid+biosynthesis,+and+colonization+of+chickens.">Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens.</a> Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).</li><li>Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+specific+amino+acids+in+the+N-terminus+of+Pseudomonas+aeruginosa+flagellin+and+of+flagellin+glycosylation+in+the+innate+immune+response.">Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response.</a> Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).</li><li>Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aeromonas:+the+multifaceted+middleman+in+the+One+Health+world.">Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world.</a> Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).</li><li>Gav&#237;n, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+flagella+of+Aeromonas+species+are+essential+for+epithelial+cell+adherence+and+biofilm+formation.">Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation.</a> Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).</li><li>Altschul, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Forn-Cun&#237;, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+flagella+glycosylation+in+Aeromonas:+Genomic+characterization+and+Involvement+of+a+specific+glycosyltransferase+(Fgi-1)+in+heterogeneous+flagella+glycosylation.">Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).</li><li>Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+A+is+essential+for+the+virulence+of+Vibrio+anguillarum.">Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum.</a> Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).</li><li>Kov&#225;cs, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Pseudomonas+pyocyanea+by+the+oxidase+reaction.">Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction.</a> Nature. 178 (4535), 703 (1956).</li><li>Fulton, K. M., Mendoza-Barber&#225;, E., Twine, S. M., Tom&#225;s, J. M., Merino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+glycosylated+and+lateral+non-glycosylated+flagella+from+Aeromonas+hydrophila+strain+AH-1+(Serotype+O11).">Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11).</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).</li><li>Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alternative+sigma+factor+RpoQ+regulates+colony+morphology,+biofilm+formation+and+motility+in+the+fish+pathogen+Aliivibrio+salmonicida.">The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida.</a> BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).</li><li>Pawar, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+tools+to+tackle+c-di-GMP-dependent+signalling+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).</li><li>Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomic+analysis+of+Burkholderia+pseuomallei+Bsa+Type+III+secretion+system+effectors+using+hypersecreting+mutants.">Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants.</a> The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).</li></ol>

Bu yöntemin kritik erken adımı, flagella ve varsayılan GT'lerin glikozilasyonunda yer alan bölgelerin tanımlanmasıdır, çünkü bu enzimler yüksek homoloji gösterir ve birçok süreçte yer alır. Aeromonas genomlarının halka açık veri tabanlarındaki biyoinformatik analizi, bu bölgenin birçok suşta flagellin genlerini içeren ve pseudaminik asit27'nin biyosentezinde rol oynayan genleri içeren polar flagella bölgesi 2'ye bitişik olduğunu göstermektedir. Bu, Aerom...

Protein glikozilasyonu hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde tanımlanmıştır ve bir glikan'ın bir amino asit yan zincirine kovalent bağlanmasından oluşur 1,2. Prokaryotlarda, bu süreç genellikle iki ana enzimatik mekanizma ile gerçekleşir: O- ve N-glikozilasyon 3. O-glikozilasyonda, glikan bir serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntısının hidroksil grubuna bağlanır. N-glikozilasyonda, glikan, X'in prolin hariç herhangi bir amino asit olabileceği Tripeptit dizileri Asn-X-Ser / Thr içindeki bir asparagin (Asn) kalıntısının yan zincir amid azotuna bağlanır.
Glikanlar doğrusal veya dallanmış yapıları benimseyebilir ve glikosidik bağlarla kovalent olarak bağlanmış monosakkaritlerden veya polisakkaritlerden oluşur. Prokaryotlarda, glikanlar genellikle ökaryotik glikanlara kıyasla şeker bileşiminde ve yapısında çeşitlilik gösterir4. Ayrıca, glikanın nasıl monte edildiği ve alıcı proteine nasıl aktarıldığı konusunda farklılık gösteren iki farklı bakteriyel glikozilasyon yolu tanımlanmıştır: sıralı ve en blok glikozilasyon 5,6. Sıralı glikozilasyon için, kompleks glikan, monosakaritlerin art arda eklenmesiyle doğrudan protein üzerinde oluşturulur. En blok glikozilasyonda, önceden monte edilmiş bir glikan, özel bir oligosakkariltransferaz (OTaz) tarafından lipite bağlı bir oligosakkaritten proteine aktarılır. Her iki yolun da N- ve O-glikozilasyon işlemlerinde rol oynadığı gösterilmiştir7.
Protein glikozilasyonu, proteinlerin fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin modüle edilmesinde rol oynar. Bir glikanın varlığı, proteinin biyolojik aktivitesini etkileyen proteinin ligandı ile nasıl etkileşime girdiğini etkileyebilir, ancak protein stabilitesini, çözünürlüğünü, proteolize duyarlılığını, immünojenitesini ve mikrop-konakçı etkileşimlerini de etkileyebilir 8,9. Bununla birlikte, glikan sayısı, glikan bileşimi, pozisyon ve bağlanma mekanizması gibi çeşitli glikozilasyon parametreleri de protein fonksiyonunu ve yapısını etkileyebilir.
Glikoziltransferazlar (GT'ler), kompleks glikanların ve glikokonjugatların biyosentezinde anahtar enzimlerdir. Bu enzimler, aktive edilmiş bir donör molekülünden gelen bir şeker parçası ile spesifik bir substrat alıcısı arasındaki glikosidik bağ oluşumunu katalize eder. GT'ler hem nükleotitleri hem de nükleotit olmayanları donör moleküller olarak kullanabilir ve proteinler, sakaritler, nükleik asitler ve lipitler gibi farklı substrat alıcılarını hedefleyebilir10. Bu nedenle, GT'leri moleküler düzeyde anlamak, etki mekanizmalarını ve özgüllüklerini tanımlamak için önemlidir ve ayrıca ilgili molekülleri değiştiren glikanların şeker bileşiminin patojenite ile nasıl ilişkili olduğunu anlamayı sağlar. Karbonhidrat Aktif enzim veritabanı (CAZy)11, GT'leri dizi homolojilerine göre sınıflandırır, bu da GT ailelerinin çoğunda yapısal kıvrım ve etki mekanizmaları değişmez olduğu için öngörücü bir araç sağlar. Bununla birlikte, dört neden birçok GT'nin substrat özgüllüğünü tahmin etmeyi zorlaştırmaktadır: 1) prokaryotlarda substrat özgüllüğünü belirleyen net bir dizi motifi belirlenmemiştir 12, 2) birçok GT ve OTaz, substrat karışıklığı göstermektedir13,14, 3) fonksiyonel GT'lerin rekombinant formda yüksek verimde üretilmesi zordur ve 4) hem donör hem de alıcı substratların tanımlanması karmaşıktır. Buna rağmen, son mutagenez çalışmaları, katalitik mekanizmaların anlaşılmasında ve GT'lerin bağlanmasının çıkarılmasında önemli ilerlemeler elde etmeyi mümkün kılmıştır.
Bakterilerde, O-glikozilasyon, N-glikozilasyondan daha yaygın görünmektedir. O-glikozilasyon bölgeleri bir konsensüs dizisi göstermez ve O-glikozile proteinlerin çoğu salgılanır veya flagellinler, pili veya ototransporterler gibi hücre yüzeyi proteinleri1. Flagellin glikozilasyonu, alıcı bölgelerin sayısında, glikan bileşiminde ve yapısında değişkenlik gösterir. Örneğin, Burkholderia spp flagellin'lerin yalnızca bir alıcı bölgesi varken, Campylobacter jejuni'de flagellinlerin 19 alıcı bölgesi15,16'ya kadar vardır. Ayrıca, bazı bakteriler için glikan tek bir monosakarittir, diğer bakteriler ise oligosakaritler oluşturmak için farklı monosakaritlerden ödün veren heterojen glikanlara sahiptir. Bu heterojenlik, aynı türün suşları arasında bile meydana gelir. Helicobacter flagellinleri sadece pseudaminic asit (PseAc)17 tarafından modifiye edilir ve Campylobacter flagellinler, pseudaminic asidin (PseAm) veya lejyonaminik asidin (LegAm) asetamidin formu olan PseAc ve asetil, N-asetilglukozamin veya propiyonik ikameler18,19 ile bu şekerlerden türetilen glikanlar tarafından modifiye edilebilir. Aeromonas'ta, flagellinler, bileşimi tek bir PseAc asit türevinden heteropolisakkarit20'ye kadar değişen glikanlar tarafından modifiye edilir ve glikanların flagellin monomerlerine bağlanması her zaman bir PseAc türevi aracılığıyladır.
Genel olarak, flagellinlerin glikozilasyonu, flagellar filament montajı, motilite, virülans ve konakçı özgüllüğü için gereklidir. Bununla birlikte, C. jejuni16, H. pylori17 ve Aeromonas sp. 21, protein monomerleri glikozile edilmedikçe, Pseudomonas spp. ve Burkholderia spp. olmadıkça filament halinde birleşemez. 15 flagella montajı için glikozilasyon gerektirmez. Ayrıca, bazı C. jejuni suşlarında, flagella glikanının şeker bileşimindeki değişiklikler bakteriyel-konakçı etkileşimini etkiler ve bazı bağışıklık tepkilerinden kaçınmada rol oynayabilir16. Otoaglütinasyon, flagellinlerle ilişkili glikanların bileşimindeki modifikasyonlardan etkilenen başka bir fenotipik özelliktir. Daha düşük bir otoaglütinasyon, mikrokoloniler ve biyofilm22 oluşturma yeteneğinde bir azalmaya yol açar. Bazı bakterilerde, flagella'nın pro-inflamatuar bir yanıtı tetikleme yeteneği, flagellin glikozilasyonu ile bağlantılıydı. Bu nedenle, P. aeruginosa'da, glikozile flagellin, glikozillenmiş olmayan23'ten daha yüksek bir pro-inflamatuar yanıtı indükler.
Aeromonas, çevrede her yerde bulunan Gram-negatif bakterilerdir, bu da tüm One Health bileşenlerinin arayüzünde olmalarını sağlar24. Mezofilik Aeromonas, yapısal olarak üretilen tek bir polar flagellum'a sahiptir. Klinik izolatların yarısından fazlası, yüksek viskoziteli ortamlarda veya plakalarda indüklenebilen lateral flagellin eksprese eder. Farklı çalışmalar her iki flagella tipini de bakteriyel patogenezin erken evreleri ile ilişkilendirmiştir25. Bugüne kadar bildirilen polar flagellinler, merkezi immünojenik alanlarının 5-8 Ser veya Thr kalıntılarında O-glikozile edilirken, lateral flagellinler tüm suşlarda O-glikozile edilmemiştir. Farklı suşlardan polar flagella glikanları, karbonhidrat bileşimlerinde ve zincir uzunluklarında20 çeşitlilik göstermesine rağmen, bağlantı şekerinin bir pseudaminik asit türevi olduğu gösterilmiştir.
Bu makalenin amacı, ilgili polisakkaritlerin biyosentezine ve bakteriyel patojeniteye katılımlarını ve glikan'ın kendisinin rolünü analiz etmek için belirli GT'lerde veya GT'leri içeren kromozomal bölgelerde boş mutantlar elde etmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Örnek olarak, polar flagellin glikozilasyonuna katılımını belirlemek ve flagellin glikanının rolünü analiz etmek için Aeromonas'ın GT'lerini içeren kromozomal bir bölgeyi tanımlar ve sileriz. Bu glikan'ın biyosentezindeki işlevini ve modifiye glikan'ın rolünü belirlemek için belirli bir GT'nin nasıl silineceğini gösteriyoruz. Örnek olarak Aeromonas kullanılmasına rağmen, prensip diğer Gram-negatif bakterilerin flagella glikozilasyon adalarını tanımlamak ve incelemek ve O-antijen lipopolisakkarit gibi diğer glikanların biyosentezinde yer alan GT'lerin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td>Used for sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12346-086</td>
			<td>Used for amplification of AB, CD and AD fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda-Pronadise</td>
			<td>8008</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1821</td>
			<td>Used to remove phosphate at the 5&#8217; end</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6021</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BglII</td>
			<td>Promega</td>
			<td>R6081</td>
			<td>Used for endonuclease restriction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioDoc-It Imagin System</td>
			<td>UVP</td>
			<td></td>
			<td>Bio-imaging station used for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotaq polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21040</td>
			<td>Used for colony screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cesium chloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1126,0100</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1806,0025</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit</td>
			<td>Cytivia</td>
			<td>28-9034-71</td>
			<td>Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>131026.1211</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes 2 mm gap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-1133</td>
			<td>Used for transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>Use for DNA visualization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperLadder 1 Kb marker</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33053</td>
			<td>DNA marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10750204</td>
			<td>Used for bacterial chromosomal DNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>996</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) Miller broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1551</td>
			<td>Used for Escherichia coli culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop ND-1000</td>
			<td>NanoDrop Techonologies Inc</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer used for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rifampicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2220,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15544034</td>
			<td>Used for electroporation recovery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectinomycin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3834,0005</td>
			<td>Used for triparental mating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>331362</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224017</td>
			<td>Used for ligation reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy agar</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1068</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticasein soy broth</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1224</td>
			<td>Used for Aeromonas grown</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Condalab</td>
			<td>1612</td>
			<td>Use for motility analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264,0500</td>
			<td>Used for DNA electrophoresis and flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A4975,0100</td>
			<td>Used for bacterial lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344059</td>
			<td>Used for flagella purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Used for PCR reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td>
			<td>Zymmo research</td>
			<td>D4020</td>
			<td>Used for isolation of plasmid DNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of null mutants to elucidate the role of bacterial glycosyltransferases in bacterial motility

Prokaryotlarda glikozilasyon çalışması hızla büyüyen bir alandır. Bakteriler, yüzeylerinde glikanları suşa özgü bir barkod oluşturan farklı glikozile yapılar barındırır. İlişkili glikanlar, şeker bileşiminde ve yapısında ökaryotlarınkinden daha yüksek çeşitlilik gösterir ve bakteriyel-konakçı tanıma süreçlerinde ve çevre ile etkileşimde önemlidir. Patojenik bakterilerde, glikoproteinler enfeksiyöz sürecin farklı aşamalarında yer almıştır ve glikan modifikasyonları glikoproteinlerin spesifik fonksiyonlarına müdahale edebilir. Bununla birlikte, glikan bileşiminin, yapısının ve biyosentez yolaklarının anlaşılmasında kaydedilen ilerlemelere rağmen, glikoproteinlerin patojenite veya çevre ile etkileşimdeki rolünün anlaşılması çok sınırlı kalmaktadır. Ayrıca, bazı bakterilerde, protein glikozilasyonu için gerekli enzimler, lipopolisakkarit ve kapsül biyosentetik yollar gibi diğer polisakkarit biyosentetik yollarla paylaşılır. Glikozilasyonun fonksiyonel önemi, glikozilasyon sürecine dahil olduğu düşünülen spesifik genlerin mutasyonu ve hedef glikoprotein ve modifiye edici glikan'ın ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi yoluyla birçok bakteride açıklığa kavuşturulmuştur. Mezofilik Aeromonas tek ve O-glikozile polar flagelluma sahiptir. Flagellar glikanlar, karbonhidrat bileşiminde ve Aeromonas suşları arasındaki zincir uzunluğunda çeşitlilik gösterir. Bununla birlikte, bugüne kadar analiz edilen tüm suşlar, serin veya treonin kalıntılarını değiştiren bağlantı şekeri olarak bir pseudaminik asit türevi göstermektedir. Pseudaminik asit türevi polar flagella montajı için gereklidir ve kaybının yapışma, biyofilm oluşumu ve kolonizasyon üzerinde etkisi vardır. Bu makalede ayrıntılı olarak açıklanan protokol, null mutantların yapımının, bir flagellar glikan'ın biyosentezinde varsayılan glikoziltransferazlar içeren genlerin veya genom bölgelerinin katılımını anlamak için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Bu, ilgili glikoziltransferazların işlevini ve glikan'ın rolünü anlama potansiyelini içerir. Bu, glikan eksikliği olan mutantı vahşi tip suşla karşılaştırarak elde edilecektir.

Bu metodoloji, Aeromonas'ın genlerinde veya kromozomal bölgelerinde flagella glikozilasyonunu ve flagella filamentinin rolünü etkileyebilecek null mutantlar üretmek için etkili bir sistem sağlar (Şekil 1).
Protokol, varsayılan FGI'ların ve GT'leri kodlayan genlerin bu bölgede bulunan biyoinformatik tanımlanması ile başlar. Aeromonas'ta, FGI'ların kromozomal yerleşimi üç tip genin tespitine dayanır: pseudaminik asidin (pseI ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility at JoVE.com

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Bu nedenle nörminik asit türevi sadece patojenik bakterilerde bulunur, aminiglikozile flagella bu şekeri içerir. Genlerde bulunan bölgenin çerçeve delesyonu, flagella glikozilasyon kümelerinin bulunmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, aralarında yüksek homolojiye sahip olan ve farklı süreçlerde yer alan glikoziltransferazlar gibi en son spesifik bölge veya genleri ve flagella glikozilasyon sürecine katılımını analiz eder.Bu teknik aynı zamanda patojenik bakterilerde ilgili polisakkaritlerin biyosentezinde rol oynayan glikoziltransferazların rolünü ve ayrıca flagella oluşumunda rol oynayan gen kodlayan proteinlerin rolünü bulmaya yardımcı olabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımın teknisyeni Maite Polo olacak. DNA bölgelerini, silinecek seçilen gen veya bölgenin yukarı ve aşağı akışını yükselten iki çift primer tasarlayın.Primer A ve D'nin beş asal uçta, pDM4'te klonlamaya izin veren bir endonükleaz için bir kısıtlama bölgesi içermesi gerekir. B ve C primerlerinin silinecek genin içinde veya silinecek bölgenin ilk ve son geninin içinde olduğundan emin olun. Her iki primerin de çerçeve içinde olduğundan ve genin içinde beş ila altı kodon arasında bulunduğundan emin olun.Her iki primerin de DNA amplikonları AB ve CD'ye katılmak için beş asal uçta 21 baz çifti tamamlayıcı bir dizi içerdiğinden emin olun.AB ve CD primerleri olan iki asimetrik PCR setinde şablon olarak 100 nanogram saflaştırılmış kromozomal DNA kullanın, ardından elde edilen ürünlerin analizi% 1 agaroz jelinde analiz edin. Eksize edilen amplikonları elektroforetik jelden arındırın ve ölçün. Her amplikonun 100 nanogramını astarsız PCR reaktifleri ile karıştırın.Genişlettikten sonra, A ve D astarları ekleyin ve bunları tek bir parça olarak yükseltin. Daha sonra elde edilen ürünleri daha önce açıklandığı gibi analiz edin, saflaştırın ve ölçün. Bir mikrogram pDM4 ve 400 nanogram AD amplikonunu bir endonükleaz ile sindirin.Sindirilmiş pDM4'ü bir molar vektörde AD amplikon ile birleştirerek bir ila dört oranında ekleme yapın ve ligasyon reaksiyonunu hazırlayın. Gece boyunca 20 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, T4 ligazını 20 dakika boyunca 70 santigrat derecede etkisiz hale getirin.Escherichia coli suşunu Luria Bertani Miller suyuna aşılayın ve 0.4 ila 0.6 arasında bir optik yoğunluk gözlenene kadar 200 RPM'de sallanarak 30 santigrat derecede inkübe edin. Bakteri kültürünü 15 dakika boyunca 5.000 kez G ve dört santigrat derecede santrifüjleme ile toplayın. Peleti soğutulmuş damıtılmış suda askıya alın ve temizleme işlemini iki kez daha tekrarlayın.Bakteri süspansiyonunu mikrofüj tüplerine aktarın ve santrifüjlemeyi beş dakika boyunca 14.000 kez G ve dört santigrat derecede tekrarlayın. Pelet soğutulmuş suda yeniden askıya alındıktan sonra, yaklaşık 3.5 mikrolitre ligasyon karışımı ekleyin ve beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İçeriği soğutulmuş iki milimetre boşluklu elektroporasyon küvetine aktarın.Elektroporasyondan sonra SOC ortamını ekleyin ve içeriği bir kültür tüpüne aktarın. 200 RPM'de sallayarak 30 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. LB agar plakaları üzerindeki dönüştürülmüş hücreleri kloramfenikol ile desteklenmiş olarak plakalayın.PDM4 klonlama tarafını çevreleyen primerleri kullanarak silme yapısının PCR ile pDM4'e yerleştirilmesini kontrol edin. Gece kültürleri hazırlayın, böylece alıcı Aeromonas suşunun rifampisine dirençli ve iki farklı Escherichia coli suşu. Donör suşu pDM4 rekombinant plazmid ile ve yardımcı suş PRK 2073 plazmid ile 30 santigrat derecede.Donör, alıcı ve yardımcı suşların aynı sayıda kolonisini, 150 mikrolitre LB ile üç LB tüpünde askıya alın. Daha sonra antibiyotiksiz bir LB agar plakasında, üç bakteriyel süspansiyonu bir alıcıda iki damla halinde karıştırarak donöre beş ila bire bir oranında yardımcı olun ve plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. LB agar plakasına bir mililitre LB suyu ekleyerek bakterileri hasat edin. Bakteriyel süspansiyonu konik 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne ve kuvvetli bir şekilde girdaba aktarın.Bakteriyel süspansiyonun 100 mikrolitresini rifampisin ve kloramfenikol ile LB agar plakalarına yayın. 200 mikrolitre ve 600 mikrolitre numuneyi döndürün, peleti 100 mikrolitre LB et suyunda askıya alın ve LB agar üzerindeki plakayı rifampisin ve kloramfenikol ile inkübasyon ile takip edin. Kolonilerin Aeromonas olduğunu doğrulamak için bir oksidaz testi yapın.Ayrıca, pDM4 rekombinant plazmidinin E ve F primerlerini kullanarak PCR ile spesifik kromozomal bölgeye yerleştirildiğini onaylayın. Rekombinant kolonileri% 10 sakkaroz ile ve gece boyunca 30 santigrat derecede antibiyotik olmadan iki mililitre LB içinde büyütün. Farklı kültür seyreltmeleri hazırlandıktan sonra, bakteri kültürlerinin 100 mikrolitresini ve LB agar plakasındaki seyreltmeleri% 10 sakkaroz ile plakalayın ve gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin.Ertesi gün, kolonileri toplayın ve kloramfenikollü ve kloramfenikolsüz LB plakalarına aktarın. Onları gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, kloramfenikol duyarlı kolonileri seçin. EF primer çiftini kullanarak PCR ile hassas kolonileri analiz edin ve PCR ürünü silinen yapının boyutuyla ilişkili olan kolonileri seçin.Kapak slaytının dört köşesine küçük bir damla silikon koyun ve gece boyunca yetiştirilen Aeromonas kültürünü bir kapak kaydırağına monte edin. Kapak slaytına kazılmış bir slayt yerleştirin ve slaytı baş aşağı çevirin. Optik mikroskop kullanarak ışık mikroskobu ile yüzme hareketliliğini analiz edin, ardından kültürün üç mikrolitresini yumuşak bir agar plakasının merkezine aktarın.Plakayı gece boyunca 25 ila 30 santigrat derece arasında yüzüstü inkübe edin. Kuluçkanın sonunda bir cetvel kullanarak, plaka merkezinden agar boyunca çevreye doğru bakteri göçünü ölçün. Kültür Aeromonas gece boyunca 900 mililitre TSB'de 25 ila 30 santigrat derece arasında gerilir.Santrifüjlemeden sonra, peleti pH 7.8'in 100 milimolar Tris hidrojen klorür tamponunun 20 mililitresinde askıya alın. Ankrajlı flagellayı çıkarmak için, süspansiyonu üç ila dört dakika boyunca cam çubuklu bir girdapta tutun ve ardından 21 gauge şırıngadan tekrar tekrar geçirin. Bakterileri dört santigrat derecede iki ardışık santrifüjleme ile toplayın ve süpernatantı ayrı bir tüp halinde toplayın.Süper nantantı ultrasantrifüjledikten sonra, peleti iki milimolar EDTA tamponu içeren 150 mikrolitre 100 milimolar Tris hidrojen klorür içinde askıya alın. Flagella'nın zenginleştirilmiş fraksiyonunun 150 mikrolitresini ince duvarlı ultra berrak bir tüpe aktarın ve 12 mililitre sezyum klorür çözeltisi ile doldurun. Tüpü sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede 48 saat boyunca 60.000 kez G'de ultrasantrifüj yapın.Flagella bandını bir şırınga ile sezyum klorür gradyanına toplayın ve 100 milimolar Tris hidrojen klorür artı iki milimolar EDTA'ya karşı diyaliz, ardından elektroforez ve Coomassie mavi boyama veya kütle spektrometrisi ile analiz edin. Aşağıdaki şekilde, şerit WT Aeromonas piscicola AH3'tür. Bir ila sekiz şerit, ikinci rekombinasyonun kloramfenikol duyarlı kolonilerini gösterir.ST hiper mesane 1KB belirtecidir. Bir ila üç ve beş ila sekiz şerit, vahşi tip FGI4 genine sahip kolonileri şerit WT olarak gösterir. Dördüncü şerit, silinmiş FGI4 genine sahip bir koloni gösterir. Işık mikroskobu testleri, polar veya lateral flagella modifikasyonlarının sadece migrasyon çaplarında azalmaya yol açtığını, bu nedenle AH-3 FGI mutantı ve AH-3 FGI-4 mutantlarının vahşi tip suşuna göre sadece azalmış hareketlilik gösterdiğini göstermiştir.Şekil, birinci şeridin AH-3'ünden polar flagellum ve şerit iki'nin FGI bölgesindeki mutantların ve üçüncü şeridin FGI-4 genindeki mutantların olmadığını, burada her iki mutantın da vahşi tip suşundan daha düşük moleküler ağırlığa sahip polar flagellinlere sahip olduğunu göstermektedir. flagella glikanındaki değişiklikler. Mutasyonların aşağı akış genlerini etkilemediğinden ve flagella düzeneğinin yetersizliğine veya flagella filamentlerinin yetersizliğine yol açmasını sağlamak önemlidir. Flagelin proteinlerindeki değişim tespit edilemediğinde, glikan kütlesini bilmek için flagellin peptidlerinin toplam proteinini kullanarak kütle spektrometresi analizi gereklidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

Bioluminescent Bakteriyel Görüntüleme<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em&gt; PilG</em&gt; &#39;de<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...