Name: act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast at JoVE.com

شكرا لآرون هوسكينز وأعضاء مختبر هوسكينز في جامعة ويسكونسن ماديسون لاستخدام سلالات الخميرة والمعدات في توليد الأشكال 3-5. شكرا لهاربريت كور وشينغيانغ فو على تعليقاتهما الثاقبة على المخطوطة. شكرا للطلاب والموظفين وأعضاء هيئة التدريس الداعمين في جامعة نورث ويست أثناء كتابة هذه الورقة وتحريرها وتصويرها. شكرا لإيزابيل ماراسيغان للمساعدة في تصوير هذه الطريقة.

1. بناء سلالة الخميرة
<ol><li>توليد أو الحصول على سلالة S. cerevisiae التي تشمل خلفيتها leu2 و cup1Δ. لتوليد هذه الخلفية ، استخدم طريقة الخميرة الراسخة التي تستخدم أسيتات الليثيوم والحمض النووي39 الذي تقطعت به السبل. ملاحظة: قد تحتوي سلالات الخميرة أحادية الصيغة ال...

ACT1-CUP1 هو اختبار نمو ، ويجب توخي الحذر للتأكد من أن اختلافات النمو الملحوظة لا يمكن أن تعزى إلا إلى عيوب الربط. يجب التعامل مع جميع السلالات بطريقة مماثلة قبل الطلاء ، بما في ذلك وجود نفس الطول والنوع من ظروف النمو والتخزين. في حالة استخدام سلالات حساسة لدرجة الحرارة ، يجب إجراء فحوصات ACT1-CUP1 ?...

ال spliceosome هو آلة بيولوجية كبيرة تحفز إزالة الإنترونات ، المناطق غير المشفرة في الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA)1,2. غالبا ما يكون توصيف تأثير طفرة نقطة واحدة في 1 من ما يقرب من 100 بروتين و 5 RNAs غير مشفرة غامضا عند دراسة البروتين أو الحمض النووي الريبي بمعزل عن غيره. يمكن تقييم التغيير في وظيفة المكون المتحور بشكل أفضل في الجسم الحي في سياق spliceosome الكامل والفعال.
مقايسة نمو النحاس الموصوفة هنا هي مقياس سريع لكفاءة الربط في Saccharomyces cerevisiae أو الخميرة الناشئة. تم تطوير هذا الفحص بواسطة C.F. Lesser و C. Guthrie ونشر في عام 1993 ، ويجمع بين سهولة العمل مع كائن نموذجي بسيط والقراءة المباشرة لصلاحية الخلية3. ترتبط الجدوى بمدى قدرة spliceosomes في هذه الخلايا على التعرف على نص المراسل ولصقه.
يطلق على مقايسة نمو النحاس هذه بشكل أكثر شيوعا مقايسة ACT1-CUP1. ينشأ اسم ACT1-CUP1 من الجينين المندمجين لإنشاء مراسل لكفاءة الربط. ACT1 هو جين الأكتين في الخميرة ، والذي يتم التعبير عنه بشكل كبير ويحتوي على إنترونمقسم بكفاءة 4,5. Cup1p هو مخلب نحاسي يعزل النحاس في الخلية لمنع التداخل مع الوظائف الخلوية العادية6،7،8. يحتوي مراسل ACT1-CUP1 على هذه الجينات بالتسلسل بحيث يكون CUP1 في إطار القراءة المناسب فقط في حالة حدوث الربط قبل mRNA لإنترون ACT1 (الشكل 1). يحتوي بروتين الاندماج الناتج على أول 21 حمضا أمينيا من الأكتين وبروتين Cup1p كامل الطول ، مما يزيد من صلاحية الخميرة في بيئة غنية بالنحاس3. وبالتالي ، فإن الزيادة في كمية الربط للمراسل تؤدي إلى تركيز أعلى من Cup1p ومقاومة أعلى للنحاس (الشكل 1). بالمقارنة مع جينات المراسل الأخرى ، يؤثر CUP1 على بقاء الخلية حتى عند المستويات المنخفضة ، وله نطاق حساسية واسع ، ويمكن استخدامه للاختيار المباشر لطفرات الربط3،6،7. بالإضافة إلى ذلك ، CUP1 غير ضروري لنمو الخميرة القياسي ، وبالتالي لا يتأثر التوازن الخلوي أثناء الإعداد لهذا الفحص. مكملا لمقايسات الحذف أو نمو درجة الحرارة ، يوفر ACT1-CUP1 معلومات حول التأثيرات على الربط في ظل ظروف نمو الخميرة المثلى.
يتعرف spliceosome على ركيزته من خلال ثلاثة تسلسلات intronic ، وهي موقع لصق 5 '(5' SS) ، وموقع الفرع (BS) ، وموقع لصق 3 '(3' SS). تم إنشاء العديد من مراسلي ACT1-CUP1 الذين يحتويون على تسلسلات غير توافقية في هذه المواقع. يتم عرض مجموعة مختارة من مراسلي ACT1-CUP1 الأكثر شيوعا في الشكل 1 والجدول 1. نظرا لأن spliceosome يتفاعل مع كل موقع لصق بشكل فريد في نقاط مختلفة في دورة الربط ، يمكن اختبار متانة spliceosome في خطوات مختلفة بناء على استخدام المراسل غير الإجماعي. يتم تسمية المراسلين غير التوافقيين على الموقع المتحور داخل intron والقاعدة التي تم تحويرها إليها. على سبيل المثال ، A3c هو مراسل لديه طفرة في 5 'SS ، وتحديدا الموضع 3 من الأدينوزين بالإجماع إلى السيتوزين. سيتفاعل هذا المراسل بقوة مع طفرات spliceosome التي تؤثر على اختيار واستخدام SS 5 '. في دراستهم الأولية ، حدد Lesser و Guthrie أي طفرات SS 5 'تمنع الربط3. في وقت لاحق من نفس العام ، تم نشر مراسلين غير متفقين عليهم في جميع مواقع لصق الثلاثة بواسطة Burgess و Guthrie في شاشة مثبطة للطفرات في ATPase Prp16p9. بمقارنة الإجماع مع المراسلين غير التوافقيين ، كان اختبار ACT1-CUP1 مفتاحا مهما لفهم متانة وانتقائية spliceosome الخميرة واستنتاج وظيفة spliceosomes حقيقيات النوى الأخرى.
نظرا لأن مراسلي ACT1-CUP1 غير المتفق عليهم يقومون بتوعية الجسيم لمزيد من الاضطراب ، يمكن وصف تأثير طفرة عامل الربط الفردي من خلال المراسلين الذين يؤثر عليهم بشكل إيجابي أو سلبي. تم تطبيق هذا على ربط أسئلة البحث بعدة طرق. أولا ، يمكن استخدام اختبار ACT1-CUP1 كفحص جيني للطفرات في عوامل الربط. على سبيل المثال ، يعمل Prp8p ، أكبر بروتين ربط ، كمنصة يحفز عليها قلب الحمض النووي الريبي ل spliceosome تفاعل الربط. تم استنتاج ذلك ، جزئيا ، من خلال كيفية تحسين أو تقليل طفرات Prp8p من الربط بين مراسلي ACT1-CUP1 المختلفين10،11،12،13،14،15،16،17. كما تم فحص مكونات البروتين الأخرى من spliceosome باستخدام ACT1-CUP1 ، بما في ذلك Hsh155p و Cwc2p و Cef1p و Ecm2p18،19،20،21،22،23،24،25. كما تمت دراسة العتبات النشطة ل Prp16p وأربعة ATPases أخرى تشارك في الانتقال spliceosomal مع هذا الفحص9،26،27،28،29،30. كما تمت دراسة الحمض النووي الريبي الصغير (snRNAs) على نطاق واسع باستخدام ACT1-CUP1 لتحديد تسلسلات ما قبل mRNA التي تنسقها والتغيرات في البنية الثانوية التي تمر بها snRNAs أثناء الربط3،31،32،33،34،35،36،37.
يتطلب اختبار ACT1-CUP1 سلالة خميرة حيث تم التخلص من جميع نسخ جين CUP1. نظرا لأن CUP1 يمكن أن يكون له رقم نسخة مرتفع 6,38 ، فإن التحضير لسلالة خروج المغلوب الكاملة يمكن أن يتطلب جولات متعددة أو فحصا مكثفا. نتيجة لذلك ، غالبا ما يتم مشاركة سلالات خميرة cup1Δ بين المختبرات ، كما فعل الصحفيون.
إذا تم تقييم الطفرة (الطفرات) في عامل الربط من نسخة بلازميد ، فيجب التخلص من الجين من النوع البري لهذا العامل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تسمح خلفية الخميرة باختيار اثنين على الأقل من البلازميدات ، أحدهما يحتوي على مراسل ACT1-CUP1 ، تاريخيا على بلازميد اختيار المغذيات الليوسين ، والآخر يحتوي على طفرة أو اضطراب في آلية الربط التي ستتم دراستها (الشكل 2). عادة ، في فحص واحد ، ستختبر سلالات الخميرة المتعددة ، كل منها يحمل اضطراب ربط الاستعلام (QSP) ومراسل مختلف ، تأثير الاستعلام على الربط.
تسمح المتغيرات المستقلة في اختبار ACT1-CUP1 للباحث بتقييم شدة QSP. هذه المتغيرات المستقلة هي تركيز النحاس واختيار العديد من مراسلي الربط غير المتفق عليهم. أولا ، نظرا لأن سلالات الخميرة تزرع على ألواح تحتوي على مجموعة من تركيزات النحاس (الشكل 2) ، فإن إعداد الفحص يتضمن اختيار تدرج التركيزات المستخدمة. يمكن للدراسات استخدام تدرج تركيز النحاس للدورة للحصول على قراءة أولية للجدوى ثم تكرار الفحص بتدرج أدق لتحديد الاختلافات الدقيقة في الجدوى. المتغير الثاني هو النطاق الواسع لمراسلي ACT1-CUP1 الذين يمكن اختبارهم (الشكل 1 والجدول 1). إذا كان QSP يؤثر على صلاحية الخميرة بشكل مختلف في وجود مراسل غير توافقي مقابل النوع البري ، فيمكن التوصل إلى استنتاج مفاده أن QSP يؤثر على خطوة في الربط أو منطقة من spliceosome مهمة أثناء التعرف على أو معالجة تلك المنطقة من الإنترون.
صندوق أدوات الخميرة واسع النطاق ، واختبار ACT1-CUP1 هو جزء لا يتجزأ من أبحاث الربط. غالبا ما يتم إجراء اختبار ACT1-CUP1 جنبا إلى جنب مع تحليل جيني وهيكلي و / أو كيميائي حيوي أكثر تعمقا حول تأثير QSP. نظرا لأن هذه الدراسات الأكثر تفصيلا لها عموما إجراء أطول و / أو سعر أعلى ، فإن النهج المتكرر هو فحص المسوخ المثيرة للاهتمام باستخدام ACT1-CUP1 أولا.
يتم توفيره هنا بروتوكول فحص ACT1-CUP1 ، بما في ذلك تحضير الألواح النحاسية. يوفر هذا الفحص للباحثين إجابة أولية لتأثير QSP على الربط والمناطق الداخلية الأكثر تأثرا بالاضطراب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-332</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-760</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filter System (0.22 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229707</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Any molecular grade agar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870EA</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>PN6200.1</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490005-906</td>
			<td>Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate Pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LC134051</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29399481</td>
			<td>ImageQuant 4000 (used for Figure 3),&#160; Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropout mix (-Leu)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>D9525</td>
			<td>Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1682836</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band quantifying software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0006-05</td>
			<td>ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D3500</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infra-red gel imaging device</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29238583</td>
			<td>Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-7Q</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-101</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-51</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin replicator</td>
			<td>VP Scientific</td>
			<td>VP 407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro disposable cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-590</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IST-3075</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biowave</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-156</td>
			<td>Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-520-16S</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>Y2025</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast

ساهمت الطفرات التي أدخلت في spliceosome أو ركيزته بشكل كبير في فهمنا لتعقيدات وظيفة spliceosomal. سواء كانت مرتبطة بالمرض أو مختارة وظيفيا ، فقد تمت دراسة العديد من هذه الطفرات باستخدام مقايسات النمو في الكائن الحي النموذجي Saccharomyces cerevisiae (الخميرة). يوفر مقايسة نمو النحاس الخاصة بالربط ، أو مقايسة ACT1-CUP1 ، تحليلا شاملا للطفرة على مستوى النمط الظاهري. يستخدم اختبار ACT1-CUP1 المراسلين الذين يمنحون تحمل النحاس عند تقطيعه بشكل صحيح. وهكذا ، في وجود النحاس ، ترتبط التغيرات في صلاحية الخميرة بالتغيرات في إنتاج mRNA من خلال الربط. في تجربة نموذجية ، يتم تحدي spliceosome الخميرة مع مراسلي الربط غير التوافقيين المختلفين وطفرة عامل الربط ذات الأهمية للكشف عن أي تأثير تآزري أو مضاد على الربط. هنا يتم تقديم وصف كامل لإعداد الألواح النحاسية ، وطلاء خلايا الخميرة ، وتقييم البيانات. يتم وصف مجموعة مختارة من التجارب المجانية ، مع تسليط الضوء على تنوع مراسلي ACT1-CUP1. يعد اختبار ACT1-CUP1 أداة مفيدة في صندوق أدوات الربط بفضل القراءة المباشرة للتأثير (التأثيرات) الطفرية والإمكانيات النسبية من الاستخدام المستمر في هذا المجال.

تتطلب فحوصات النمو ، مثل ACT1-CUP1 ، تقييما بصريا ومقارنا لمستعمرات متعددة. هنا ، نمت كل سلالة إلى التشبع بين عشية وضحاها ، وتم تخفيفها إلى OD600 من 0.5 ، ومطلية على 20 لوحة تحتوي على مجموعة من تركيزات النحاس من 0 mM إلى 1.1 mM CuSO4 (الشكل 3). هذا النطاق أصغر من النطاق المدرج في ال?...

Watch this Scientific Journal Video about ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast at JoVE.com

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

يوفر اختبار ACT1-CUP1 ، وهو فحص نمو النحاس ، قراءة سريعة لربط الحمض النووي الريبي رسول السلائف (pre-mRNA) وتأثير عوامل الربط الطافرة على وظيفة spliceosomal. توفر هذه الدراسة بروتوكولا وتسلط الضوء على التخصيص الممكن لمعالجة مسألة الربط ذات الأهمية.

تحدد فحوصات ACT1-CUP1 الحساسيات الخاصة بالركيزة للمتحولات spliceosomal في الخميرة الناشئة

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

يمكن لمقايسة ACT1-CUP1 تحديد ما إذا كانت الطفرة تؤثر على ربط الحمض النووي الريبي قبل الرسول ، وإعطاء إشارة إلى خطوة الربط الأكثر تأثرا. يربط اختبار ACT1-CUP1 طفرة عامل الربط بتأثيرها على عملية الربط المعقدة. يستخدم القراءة البسيطة للنمط الظاهري للنمو وله نطاق حساسية واسع.يعد الاستخدام الفعال للوقت أمرا مهما عند إجراء فحص ACT1-CUP1. ابدأ بفحص من خمس إلى 10 سلالات لتقليل انحرافات النمو الناجمة عن الإجهاد. سأكون أنا وإيزابيل ماراسيغان ، باحثة جامعية من مختبري.للبدء ، أضف 790 ملليغرام من أجار وشريط تحريك لكل زجاجة. في دورق كبير ، قم بإعداد وسائط نمو تسرب الليوسين لسكب جميع الألواح النحاسية. يتضمن ذلك 265 ملليجراما من قاعدة نيتروجين الخميرة ، و 64 ملليجراما من مزيج التسرب ، ناقص الليوسين ، و 34 ملليلترا من الماء منزوع الأيونات لكل طبق يتم سكبه.يقلب ليذوب ثم أضف 34 ملليلترا من محلول وسائط نمو الليوسين المتسرب إلى كل زجاجة محضرة سعة 100 ملليلتر ، وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم. بعد ذلك ، الأوتوكلاف لتعقيم وحل أجار ، وذلك باستخدام دورة السائل الموصى بها للأوتوكلاف. في أسرع وقت ممكن بعد التعقيم ، أضف أربعة ملليلتر من الجلوكوز بنسبة 20٪ إلى كل زجاجة.بعد ذلك ، قم بمطابقة ملصق الأنبوب مع ملصق الزجاجة لإضافة التخفيفين المليلتر من كبريتات النحاس إلى الزجاجة المقصودة. باستخدام طبق التحريك ، امزج لمدة 30 ثانية تقريبا واسكب أو ماصة 35 ملليلتر في اللوحة المصنفة ، وتجنب الفقاعات. لكل سلالة خميرة ، أضف تسعة ملليلتر من وسائط نمو التسرب من الليوسين ، وملليلتر واحد من الجلوكوز بنسبة 20٪ إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 ملليلتر.باستخدام عصا معقمة ، أو طرف ماصة ، اجمع عينة صغيرة من الخميرة وقم بتلقيح الوسائط. بعد ذلك ، هز جميع الثقافات الليلية عند 180 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الثقافة إلى كفيت ، تحتوي على 900 ميكرولتر من الماء لكل سلالة.بعد ذلك ، قم بقياس الكثافة الضوئية باستخدام مقياس الطيف الضوئي واحسب التخفيف المطلوب أن تكون بكثافة بصرية مقدارها 0.5 في الحجم النهائي البالغ ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف كل سلالة إلى الكثافة الضوئية 0.5 في 10٪ من الجلسرين وأعد قياس الكثافة الضوئية للتأكد من أن كثافة الخلية ضمن النطاق المطلوب. بعد إعداد موقع عمل معقم ، أشعل موقد بنسن.بالنسبة لجهاز النسخ المتماثل المكون من 48 سنا ، ماصة 200 ميكرولتر من كل سلالة مخففة في بئر منفصل من لوحة 96 بئرا ، واملأ المساحات الفارغة في شبكة ستة في ثمانية ب 200 ميكرولتر من 10٪ جلسرين. بعد ذلك ، اغمس جهاز النسخ المتماثل في طبق ضحل من الإيثانول بنسبة 95٪ واللهب لتعقيمه. اتركه يبرد لمدة دقيقتين على الأقل بعد إطفاء اللهب لتجنب صدمة الحرارة للخلايا.ضع أربع لوحات بالقرب من الموقد وأزل الأغطية. اغمس جهاز النسخ المتماثل في لوحة 96 بئرا وارفعه لأعلى بحركة واحدة سريعة. ثم ضعه برفق على الطبق وصخر برفق ذهابا وإيابا لتسهيل النقل الجيد.ارفع لأعلى بحركة سريعة واحدة وضعها في نفس الاتجاه بالضبط في لوحة 96 بئر. بعد طلاء الصفيحة ، تحرك بحركة سلسة إلى الجانب ، ولكن لا يزال داخل مظلة تعقيم اللهب. اترك الأطباق تجف تماما قبل وضع الأغطية ، عادة من ثلاث إلى خمس دقائق.ثم احتضان الألواح لمدة ثلاثة أيام عند 30 درجة مئوية. بعد إزالة الألواح من الحاضنة ، افحصها بصريا. أظهر فحص النمو أنه مع زيادة تركيز النحاس ، تظهر السلالات ذات الربط المنخفض انخفاضا في الالتقاء ، لدرجة أن تركيز النحاس يصبح قاتلا.تتضمن خلفية الخميرة جين ADE2 المعطل ، مما يؤدي إلى أن تكون المستعمرات درجات متفاوتة من اللون الأحمر. وكانت المستعمرات الناضجة حمراء داكنة اللون. أثناء الطلاء ، إذا تم رفع جهاز النسخ المتماثل أثناء التحرك يسارا أو يمينا ، أو تم إحضاره بزاوية ، أو إذا اهتز فوق اللوحة ، فمن الممكن إنشاء مستعمرات بيضاوية الشكل ، أو مستعمرات صغيرة من قطرات صغيرة من محلول الخلية.نجت الخميرة مع مراسل A3c إلى 0.15 مليمولار من النحاس بينما حافظت خلايا المراسل من النوع البري على صلاحيتها حتى نهاية نطاق تركيزات النحاس التي تم اختبارها. أظهرت نتائج الفحص أن القواعد المختلفة في موقع U6 snRNA 57 لها تأثيرات فريدة على spliceosome بالاشتراك مع طفرة 5 برايم ، أو طفرة موقع فرع. في حين أن U57c عبارة عن طفرة مضافة ، مما يقلل من تحمل النحاس ، بالاشتراك مع A3c ومراسلي موقع الفرع G.في المقابل ، يزيد U57a من تحمل النحاس لأنه يعزز التقدم إلى الخطوة الثانية. بعد تحديد اضطراب الربط من خلال ACT1-CUP1 ، يمكن أن ينتقل البحث إلى طرق أكثر كمية ، مثل تمديد التمهيدي وتحديد التفاعل الجزيئي المعطل من خلال EMSAs والتحقيق الأنزيمي. كان ACT1-CUP1 مقايسة تأسيسية ، حيث بناء فهمنا لمتانة وانتقائية سبيليسوسوم الخميرة.ويستمر في توسيع فهمنا للوظيفة spliceosomal.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

عالية الإنتاجية آليا عزل بمساعدة من درجة الحرارة التي تراعي القاتلة المسوخ في<em&gt; كلاميدوموناس reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

المستهدفة<em&gt; في الموقع</em&gt; الطفرات من هيستون الجينات في مهدها الخميرة

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

"جعل طفرات مشروطة طفيل الملاريا البشرية" المنجلية "تحرير الجينات" كريسبر/Cas9

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

التهجين في الموقع Fluorescence جزيء واحد (سمفيش) التحليل في مهدها الخميرة النمو الخضري والانقسام الاختزالي

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

فحص مكتبة Overexpression المستندة إلى التزاوج في الخميرة

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...