Name: act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00
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Vielen Dank an Aaron Hoskins und die Hoskins-Labormitglieder an der University of Wisconsin-Madison für die Verwendung von Hefestämmen und Geräten bei der Generierung der Abbildungen 3-5. Vielen Dank an Harpreet Kaur und Xingyang Fu für ihre aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Vielen Dank an die unterstützenden Studenten, Mitarbeiter und Dozenten der Northwest University beim Schreiben, Bearbeiten und Filmen dieses Papiers. Vielen Dank an Isabelle Marasigan für die Hilfe beim Filmen dieser Methode.

1. Hefestammkonstruktion
<ol><li>Erzeugen oder erhalten Sie einen S. cerevisiae-Stamm , dessen Hintergrund leu2 und cup1Δ umfasst. Um diesen Hintergrund zu erzeugen, verwenden Sie die etablierte Hefemethode, die Lithiumacetat und einzelsträngige DNA39 verwendet. HINWEIS: Haploide Hefestämme können eine, zwei oder mehr Kopien von CUP1 6,38 enthalten. Beziehen Sie sich auf genomis...

ACT1-CUP1 ist ein Wachstumstest, und es muss darauf geachtet werden, dass beobachtete Wachstumsunterschiede nur auf Spleißfehler zurückzuführen sind. Alle Stämme sollten vor der Beschichtung auf ähnliche Weise gehandhabt werden, einschließlich einer ähnlichen Länge und Art von Wachstums- und Lagerbedingungen. Bei Verwendung temperaturempfindlicher Stämme sollten ACT1-CUP1-Assays nur unter Bedingungen durchgeführt werden, unter denen diese Stämme vergleichbar mit Wildtypen wachsen. In diesem Zusammenhang wird f...

Das Spleißosom ist eine große, biologische Maschine, die die Entfernung von Introns, nicht-kodierenden Regionen in der Vorläufer-Boten-RNA (pre-mRNA)1,2, katalysiert. Die Charakterisierung der Wirkung einer Einzelpunktmutante in 1 der fast 100 Proteine und 5 nicht-kodierenden RNAs ist oft mehrdeutig, wenn das Protein oder die RNA isoliert untersucht wird. Die Veränderung der Funktion der mutierten Komponente kann am besten in vivo im Kontext des vollen, funktionierenden Spleißosoms beurteilt werden.
Der hier beschriebene Kupferwachstumstest ist ein schnelles Maß für die Spleißeffizienz in Saccharomyces cerevisiae oder Knospungshefe. Dieser von C.F. Lesser und C. Guthrie entwickelte und 1993 veröffentlichte Assay kombiniert die einfache Arbeit mit einem einfachen Modellorganismus und dem einfachen Auslesen der Zelllebensfähigkeit3. Die Lebensfähigkeit korreliert damit, wie gut die Spleißosomen in diesen Zellen das Reportertranskript erkennen und spleißen können.
Dieser Kupferwachstumstest wird häufiger als ACT1-CUP1-Assay bezeichnet. Der Name ACT1-CUP1 stammt von den beiden Genen, die fusioniert wurden, um einen Reporter der Spleißeffizienz zu schaffen. ACT1 ist das Aktin-Gen der Hefe, das stark exprimiert wird und ein effizient gespleißtes Intron 4,5 aufweist. Cup1p ist ein Kupferchelator, der Kupfer in der Zelle sequestriert, um Störungen mit regulären Zellfunktionenzu verhindern 6,7,8. Der ACT1-CUP1-Reporter enthält diese Gene sequenziell, so dass CUP1 nur dann im richtigen Leserahmen ist, wenn das Intron von ACT1 vor der mRNA gespleißt wird (Abbildung 1). Das resultierende Fusionsprotein enthält die ersten 21 Aminosäuren des Aktins und das Cup1p-Protein in voller Länge, was die Lebensfähigkeit der Hefe in einer kupferreichen Umgebung erhöht3. So führt eine Erhöhung der Spleißmenge des Reporters zu einer höheren Konzentration von Cup1p und einer höheren Kupferbeständigkeit (Abbildung 1). Im Vergleich zu anderen Reportergenen beeinflusst CUP1 die Zelllebensfähigkeit bereits bei niedrigen Konzentrationen, hat einen großen Sensitivitätsbereich und kann verwendet werden, um Mutationen 3,6,7 direkt für das Spleißenauszuwählen. Darüber hinaus ist CUP1 für das Standard-Hefewachstum nicht essentiell, so dass die zelluläre Homöostase während des Aufbaus für diesen Assay nicht beeinflusst wird. Ergänzend zu Deletions- oder Temperaturwachstumsassays liefert ACT1-CUP1 Informationen über die Auswirkungen auf das Spleißen unter ansonsten optimalen Hefewachstumsbedingungen.
Das Spleißosom erkennt sein Substrat durch drei intronische Sequenzen, nämlich die 5'-Spleißstelle (5' SS), die Zweigstelle (BS) und die 3'-Spleißstelle (3' SS). Zahlreiche ACT1-CUP1-Reporter wurden an diesen Standorten generiert, die Nicht-Konsens-Sequenzen enthalten. Eine Auswahl der häufigsten ACT1-CUP1-Reporter ist in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt. Da das Spleißosom mit jeder Spleißstelle an verschiedenen Punkten des Spleißzyklus einzigartig interagiert, kann die Robustheit des Spleißosoms in verschiedenen Schritten getestet werden, je nachdem, welcher Nicht-Konsens-Reporter verwendet wird. Nicht-Konsens-Reporter werden nach der mutierten Position innerhalb des Introns und der Basis, zu der es mutiert wurde, benannt. Zum Beispiel ist A3c ein Reporter mit einer Mutation am 5' SS, insbesondere Position 3 vom Konsensadenosin zu einem Cytosin. Dieser Reporter wird stark mit Spleißosomenmutationen interagieren, die die 5'-SS-Selektion und -Verwendung beeinflussen. In ihrer ersten Studie bestimmten Lesser und Guthrie, welche 5'-SS-Mutationen das Spleißen hemmten3. Später im selben Jahr wurden Nicht-Konsens-Reporter an allen drei Spleißstellen von Burgess und Guthrie in einem Suppressor-Screening von Mutationen in der ATPase Prp16p9 veröffentlicht. Der ACT1-CUP1-Assay war ein wichtiger Schlüssel zum Verständnis der Robustheit und Selektivität des Hefespleißosoms und zur Ableitung der Funktion der Spleißosomen anderer Eukaryoten.
Da ACT1-CUP1-Reporter ohne Konsens das Spleißosom für weitere Störungen sensibilisieren, kann der Einfluss einer einzelnen Spleißfaktormutation durch die Reporter charakterisiert werden, die sie positiv oder negativ beeinflusst. Dies wurde auf vielfältige Weise auf das Spleißen von Forschungsfragen angewendet. Erstens kann und wurde der ACT1-CUP1-Assay als genetischer Screen für Mutationen in Spleißfaktoren verwendet. So dient beispielsweise Prp8p, das größte Spleißprotein, als Plattform, auf der der RNA-Kern des Spleißosoms die Spleißreaktion katalysiert. Dies wurde zum Teil dadurch abgeleitet, wie Prp8p-Mutanten das Spleißen verschiedener ACT1-CUP1-Reporter verbesserten oder reduzierten 10,11,12,13,14,15,16,17. Andere Proteinkomponenten des Spleißosoms wurden ebenfalls mit ACT1-CUP1 untersucht, darunter Hsh155p, Cwc2p, Cef1p und Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Die energetischen Schwellenwerte für Prp16p und vier weitere ATPasen, die am spleißeosomalen Übergang beteiligt sind, wurden ebenfalls mit diesem Assay 9,26,27,28,29,30 untersucht. Die kleinen nukleären RNAs (snRNAs) wurden ebenfalls umfassend unter Verwendung von ACT1-CUP1 untersucht, um die von ihnen koordinierten prä-mRNA-Sequenzen und die Veränderungen in der Sekundärstruktur der snRNAs während des Spleißens zu identifizieren 3,31,32,33,34,35,36,37.
Der ACT1-CUP1-Assay erfordert einen Hefestamm, bei dem alle Kopien des CUP1-Gens ausgeschaltet wurden. Da CUP1 eine hohe Exemplarzahl 6,38 haben kann, kann die Vorbereitung eines vollständigen Knock-out-Stammes mehrere Runden oder ein umfangreiches Screening erfordern. Infolgedessen wurden Cup1Δ-Hefestämme oft zwischen Laboren geteilt, ebenso wie die Reporter.
Wenn Mutation(en) in einem Spleißfaktor anhand einer Plasmidkopie beurteilt werden, sollte das Wildtyp-Gen für diesen Faktor ausgeschaltet werden. Darüber hinaus sollte der Hefehintergrund die Auswahl von mindestens zwei Plasmiden ermöglichen, von denen eines einen ACT1-CUP1-Reporter enthält, das historisch auf einem Leucin-Nährstoffselektionsplasmid basiert, und eines, das eine Mutation oder Störung in der zu untersuchenden Spleißmaschinerie enthält (Abbildung 2). In der Regel testen in einem einzigen Assay mehrere Hefestämme, von denen jeder die QSP (Query Splicing Perturbation) trägt, und ein anderer Reporter die Auswirkungen der Abfrage auf das Spleißen.
Die unabhängigen Variablen im ACT1-CUP1-Assay ermöglichen es einem Forscher, den Schweregrad eines QSP zu beurteilen. Diese unabhängigen Variablen sind die Konzentration von Kupfer und die Auswahl mehrerer Nicht-Konsens-Spleißreporter. Erstens, da die Hefestämme auf Platten gezüchtet werden, die eine Reihe von Kupferkonzentrationen enthalten (Abbildung 2), beinhaltet die Erstellung des Assays die Auswahl des verwendeten Konzentrationsgradienten. Studien können einen Kupferkonzentrationsgradienten verwenden, um eine erste Anzeige der Lebensfähigkeit zu erhalten, und dann den Assay mit einem feineren Gradienten wiederholen, um subtile Rentabilitätsunterschiede zu identifizieren. Die zweite Variable ist die große Auswahl an ACT1-CUP1-Reportern, die getestet werden können (Abbildung 1 und Tabelle 1). Wenn der QSP die Lebensfähigkeit der Hefe in Gegenwart eines Nicht-Konsens-Reporters anders beeinflusst als der Wildtyp, kann der Schluss gezogen werden, dass der QSP einen Schritt beim Spleißen oder einen Bereich des Spleißosoms beeinflusst, der während der Erkennung oder Verarbeitung dieser Region des Introns wichtig ist.
Die Hefe-Toolbox ist umfangreich und der ACT1-CUP1-Assay ist ein integraler Bestandteil der Spleißforschung. Der ACT1-CUP1-Assay wird häufig zusammen mit einer eingehenderen genetischen, strukturellen und/oder biochemischen Analyse auf die Auswirkungen eines QSP durchgeführt. Da diese detaillierteren Studien in der Regel ein längeres Verfahren und/oder einen höheren Preis haben, ist ein häufiger Ansatz, zuerst mit ACT1-CUP1 nach interessanten Mutanten zu suchen.
Hier wird ein ACT1-CUP1-Assay-Protokoll einschließlich Kupferplattenvorbereitung bereitgestellt. Dieser Assay liefert den Forschern eine erste Antwort auf die Wirkung eines QSP auf das Spleißen und welche intronischen Regionen am stärksten von der Störung betroffen sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-332</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-760</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filter System (0.22 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229707</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Any molecular grade agar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870EA</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>PN6200.1</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490005-906</td>
			<td>Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate Pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LC134051</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29399481</td>
			<td>ImageQuant 4000 (used for Figure 3),&#160; Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropout mix (-Leu)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>D9525</td>
			<td>Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1682836</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band quantifying software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0006-05</td>
			<td>ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D3500</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infra-red gel imaging device</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29238583</td>
			<td>Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-7Q</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-101</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-51</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin replicator</td>
			<td>VP Scientific</td>
			<td>VP 407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro disposable cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-590</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IST-3075</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biowave</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-156</td>
			<td>Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-520-16S</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>Y2025</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast

Mutationen, die in das Spleißosom oder sein Substrat eingebracht wurden, haben wesentlich zum Verständnis der Feinheiten der spleißeosomalen Funktion beigetragen. Ob krankheitsbedingt oder funktionell selektiert, viele dieser Mutationen wurden mit Wachstumstests im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Hefe) untersucht. Der spleißspezifische Kupferwachstumsassay oder ACT1-CUP1-Assay bietet eine umfassende Analyse der Mutation auf phänotypischer Ebene. Der ACT1-CUP1-Assay verwendet Reporter, die bei korrektem Spleißen Kupfertoleranz verleihen. In Gegenwart von Kupfer korrelieren also Veränderungen der Hefelebensfähigkeit mit Veränderungen der mRNA-Produktion durch Spleißen. In einem typischen Experiment wird das Hefespleißosom mit verschiedenen Nicht-Konsens-Spleißreportern und der interessierenden Spleißfaktor-Mutation herausgefordert, um synergetische oder antithetische Auswirkungen auf das Spleißen nachzuweisen. Hier wird eine vollständige Beschreibung der Kupferplattenherstellung, der Beschichtung von Hefezellen und der Datenauswertung gegeben. Eine Auswahl ergänzender Experimente wird beschrieben, die die Vielseitigkeit der ACT1-CUP1-Reporter hervorheben. Der ACT1-CUP1-Assay ist dank des direkten Auslesens von Mutationseffekten und der Vergleichsmöglichkeiten aus der fortgesetzten Verwendung im Feld ein praktisches Werkzeug in der Spleiß-Toolbox.

Wachstumsassays wie ACT1-CUP1 erfordern die visuelle, vergleichende Beurteilung mehrerer Kolonien. Hier wurde jeder Stamm über Nacht bis zur Sättigung gezüchtet, auf einen OD600 von 0,5 verdünnt und auf 20 Platten mit einem Bereich von Kupferkonzentrationen von 0 mM bis 1,1 mM CuSO4 plattiert (Abbildung 3). Dieser Bereich ist kleiner als der im Protokoll aufgeführte, da er eine vollständige Bewertung der Auswirkungen der verwendeten und unten beschriebenen QSPs un...

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ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

Der ACT1-CUP1-Assay, ein Kupferwachstumsassay, ermöglicht eine schnelle Ablesung des Precursor-Messenger-RNA-Spleißens (pre-mRNA) und des Einflusses mutierter Spleißfaktoren auf die spleißöosomale Funktion. Diese Studie bietet ein Protokoll und hebt die Anpassungsmöglichkeiten hervor, um die interessierende Spleißfrage zu beantworten.

ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

Der ACT1-CUP1-Assay kann feststellen, ob eine Mutation das Pre-Messenger-RNA-Spleißen beeinflusst, und einen Hinweis darauf geben, welcher Spleißschritt am stärksten betroffen ist. Der ACT1-CUP1 Assay verbindet die Spleißfaktormutation mit ihrem Einfluss auf den komplexen Prozess des Spleißens. Es nutzt das einfache Auslesen des Wachstumsphänotyps und hat einen breiten Empfindlichkeitsbereich.Bei der Durchführung eines ACT1-CUP1-Assays ist eine effiziente Zeitnutzung wichtig. Beginnen Sie mit einem Assay von fünf bis 10 Stämmen, um stressbedingte Wachstumsanomalien zu minimieren. Ich und Isabelle Marasigan, eine Forscherin aus meinem Labor, demonstrieren den Prozess.Fügen Sie zunächst 790 Milligramm Agar und einen Rührriegel zu jeder Flasche hinzu. Bereiten Sie in einem großen Becherglas das Leucin-Dropout-Wachstumsmedium für alle zu gießenden Kupferplatten vor. Dazu gehören 265 Milligramm Hefestickstoffbasis, 64 Milligramm Dropout-Mischung minus Leucin und 34 Milliliter entionisiertes Wasser für jede zu gießende Platte.Zum Auflösen umrühren Geben Sie dann 34 Milliliter der Leucin-Dropout-Wachstumsmedienlösung zu jeder vorbereiteten 100-Milliliter-Flasche hinzu und verschließen Sie sie mit Aluminiumfolie. Als nächstes Autoklaven, um den Agar zu sterilisieren und aufzulösen, unter Verwendung des empfohlenen Flüssigkeitszyklus für den Autoklaven. Fügen Sie so schnell wie möglich nach dem Autoklavieren vier Milliliter 20% Glukose zu jeder Flasche hinzu.Passen Sie dann das Tubenetikett an das Flaschenetikett an, um die jeweils zwei Milliliter Kupfersulfatverdünnungen in die beabsichtigte Flasche zu geben. Verwenden Sie eine Rührplatte, mischen Sie für ca. 30 Sekunden und gießen oder pipettieren Sie 35 Milliliter in die beschriftete Platte, um Blasen zu vermeiden. Fügen Sie pro Hefestamm neun Milliliter Leucin-Dropout-Wachstumsmedien und einen Milliliter 20% Glukose in ein steriles, 50-Milliliter-konisches Röhrchen hinzu.Sammeln Sie mit einem sterilen Stab oder einer Pipettenspitze ein kleines Stück Hefe und impfen Sie die Medien. Dann schütteln Sie alle Nachtkulturen bei 180 U / min und 30 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Kultur zu einer Küvette hinzu, die 900 Mikroliter Wasser pro Stamm enthält.Anschließend messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer und berechnen die erforderliche Verdünnung bei einer optischen Dichte von 0,5 in einem Endvolumen von zwei Millilitern. Verdünnen Sie dann jeden Stamm auf die optische Dichte 0,5 in 10% Glycerin und messen Sie die optische Dichte erneut, um zu bestätigen, dass die Zelldichte im gewünschten Bereich liegt. Nachdem Sie einen sterilen Arbeitsort eingerichtet haben, zünden Sie einen Bunsenbrenner an.Für einen 48-poligen Replikator pipetten Sie 200 Mikroliter jedes verdünnten Stammes in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte und füllen die leeren Räume im Sechs-mal-Acht-Raster mit 200 Mikrolitern 10% Glycerin. Dann tauchen Sie den Replikator in eine flache Schale mit 95% Ethanol und flammen Sie zur Sterilisation. Lassen Sie es mindestens zwei Minuten abkühlen, nachdem die Flamme erloschen ist, um einen Hitzeschock für die Zellen zu vermeiden.Stellen Sie vier Teller in die Nähe des Brenners und entfernen Sie die Deckel. Tauchen Sie den Replikator in die 96-Well-Platte und heben Sie ihn in einer schnellen Bewegung an. Dann vorsichtig auf den Teller legen und leicht hin und her schaukeln, um einen guten Transfer zu erleichtern.Mit einer schnellen Bewegung anheben und in genau der gleichen Ausrichtung in die 96-Well-Platte legen. Nachdem eine Platte plattiert wurde, bewegen Sie sich mit einer sanften Bewegung zur Seite, aber immer noch innerhalb des Sterilisationsschirms der Flamme. Lassen Sie die Teller vollständig trocknen, bevor Sie die Deckel aufsetzen, normalerweise drei bis fünf Minuten.Dann inkubieren Sie die Platten für drei Tage bei 30 Grad Celsius. Nachdem Sie die Platten aus dem Inkubator genommen haben, überprüfen Sie sie visuell. Der Wachstumstest zeigte, dass mit steigender Kupferkonzentration Stämme mit geringerem Spleißen eine verminderte Konfluenz zeigen, bis zu dem Punkt, an dem die Kupferkonzentration tödlich wird.Der Hefehintergrund enthält ein gestörtes ADE2-Gen, was dazu führt, dass die Kolonien unterschiedliche Rottöne haben. Und die reifen Kolonien waren tiefrot gefärbt. Wenn der Replikator während der Beschichtung angehoben wird, während er sich nach links oder rechts bewegt, schräg gebracht wird oder wenn er über der Platte geschüttelt wird, ist es möglich, ovale Kolonien oder Mikrokolonien aus kleinen Tröpfchen der Zelllösung zu erzeugen.Hefe mit dem A3c-Reporter überlebte bis 0,15 Millimolar Kupfer, während die Wildtyp-Reporterzellen bis zum Ende des getesteten Kupferkonzentrationsbereichs lebensfähig blieben. Die Assay-Ergebnisse zeigten, dass die verschiedenen Basen an der U6-snRNA-Position 57 einzigartige Auswirkungen auf das Spleißosom in Kombination mit einer 5-Prime- oder Zweigstellenmutation haben. Während U57c eine additive Mutation ist, die die Kupfertoleranz verringert, in Kombination mit A3c- und Zweigstellen-G-Reportern.Im Gegensatz dazu erhöht U57a die Kupfertoleranz, da es die Progression zur zweiten Stufe fördert. Nachdem die Spleißstörung durch ACT1-CUP1 identifiziert wurde, kann die Forschung zu quantitativeren Methoden übergehen, wie der Primerverlängerung und der Identifizierung gestörter molekularer Wechselwirkungen durch EMSAs und enzymatische Sondierung. ACT1-CUP1 war ein grundlegender Assay, der unser Verständnis der Robustheit und Selektivität des Hefespleißsoms vertiefte.Und es erweitert weiterhin unser Verständnis der spleißeosomalen Funktion.

Research

JoVE Journal

Genetics

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