Name: act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast at JoVE.com

ウィスコンシン大学マディソン校のアーロン・ホスキンスとホスキンス研究室のメンバーに、図3〜5の生成に酵母株と機器を使用していただきありがとうございます。Harpreet KaurとXingyang Fuさん、原稿に対する洞察に満ちたコメントに感謝します。この論文の執筆、編集、撮影中にノースウェスト大学の支援的な学生、スタッフ、および教員に感謝します。この方法の撮影を手伝ってくれたイザベルマラシガンに感謝します。

1.酵母株の構築
<ol><li>leu2およびcup1Δを含むバックグラウンドを持つS.cerevisiae株を生成または取得します。このバックグラウンドを生成するには、酢酸リチウムと一本鎖DNA39を使用する確立された酵母法を使用します。 注:一倍体酵母株には、CUP1 6,38の1つ、2つ、またはそれ以上のコピーが?...

ACT1-CUP1は増殖アッセイであり、観察された増殖差がスプライシング欠陥にのみ起因するように注意する必要があります。すべての菌株は、同様の長さとタイプの成長および保管条件を有することを含め、めっき前に同様の方法で取り扱うべきである。温度感受性株を使用する場合、ACT1-CUP1アッセイは、それらの株が野生型と同等に増殖する条件下でのみ実施する必要があります。関連して、Q...

スプライソソームは、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)のイントロン、非コード領域の除去を触媒する大型の生物学的機械です1,2。約100のタンパク質と5つのノンコーディングRNAのうちの1つにおけるシングルポイント変異体の効果を特徴付けることは、タンパク質またはRNAを単独で研究する場合、しばしば曖昧です。変異した成分の機能の変化は、完全に機能するスプライソソームとの関連でin vivoで最もよく評価できます。
ここで説明する銅成長アッセイは、 サッカロミセス・セレビシエ または出芽酵母におけるスプライシング効率の迅速な測定です。C.F. LesserとC. Guthrieによって開発され、1993年に発表されたこのアッセイは、単純なモデル生物での作業の容易さと細胞生存率の簡単な読み出しを兼ね備えています3。生存率は、これらの細胞のスプライソソームがレポーター転写物をどれだけうまく認識して接合できるかと相関しています。
この銅成長アッセイは、より一般的にはACT1-CUP1アッセイと呼ばれます。ACT1-CUP1という名前は、スプライシング効率のレポーターを作成するために融合された2つの遺伝子に由来しています。ACT1は酵母のアクチン遺伝子であり、高発現し、効率的にスプライスされたイントロン4,5を有する。Cup1pは、細胞内の銅を隔離して通常の細胞機能との干渉を防ぐ銅キレート剤です6,7,8。ACT1-CUP1レポーターには、ACT1のイントロンのプレmRNAスプライシングが発生した場合にのみ、CUP1が適切な読み取りフレームに入るように、これらの遺伝子が順番に含まれています(図1)。得られた融合タンパク質には、アクチンの最初の21アミノ酸と全長Cup1pタンパク質が含まれており、銅が豊富な環境で酵母の生存率を高めます3。したがって、レポーターのスプライシング量の増加は、Cup1pの濃度が高くなり、銅抵抗が高くなります(図1)。他のレポーター遺伝子と比較して、CUP1は低レベルでも細胞生存率に影響を与え、感度範囲が広く、スプライシング変異を直接選択するために使用できます3,6,7。さらに、CUP1は標準的な酵母の増殖に必須ではないため、このアッセイのセットアップ中に細胞の恒常性は影響を受けません。ACT1-CUP1は、欠失または温度増殖アッセイを補完するもので、最適な酵母増殖条件下でのスプライシングへの影響に関する情報を提供します。
スプライソソームは、5'スプライス部位(5' SS)、分岐部位(BS)、および3'スプライス部位(3' SS)の3つのイントロン配列を介してその基質を認識します。これらの部位では、非コンセンサス配列を含む多数のACT1-CUP1レポーターが生成されています。最も一般的なACT1-CUP1レポーターの選択を 図 1と 表1に示します。スプライソソームはスプライシングサイクルの異なる時点で各スプライス部位と一意に相互作用するため、スプライソソームの堅牢性は、どの非コンセンサスレポーターを使用するかに基づいて、異なるステップでテストできます。非コンセンサスレポーターは、イントロン内の突然変異した位置とそれが突然変異した塩基にちなんで名付けられます。例えば、A3cは、5'SS、具体的にはコンセンサスアデノシンからシトシンまでの3位に変異を有するレポーターである。このレポーターは、5' SSの選択と使用に影響を与えるスプライソソーム変異と強く相互作用します。彼らの最初の研究で、レッサーとガスリーはどの5'SS変異がスプライシングを阻害するかを決定しました3。同じ年の後半、3つのスプライスサイトすべての非コンセンサスレポーターが、ATPase Prp16p9の突然変異のサプレッサースクリーニングでバージェスとガスリーによって発表されました。コンセンサスを非コンセンサス報告者と比較すると、ACT1-CUP1アッセイは、酵母スプライソソームの堅牢性と選択性を理解し、他の真核生物のスプライソソームの機能を推測するための重要な鍵となっています。
非コンセンサスACT1-CUP1レポーターはスプライソソームをさらに摂動させるために感作するため、単一のスプライシング因子変異の影響は、それがプラスまたはマイナスの影響を与えるレポーターを通して特徴付けることができます。これは、さまざまな方法で研究課題のスプライシングに適用されています。まず、ACT1-CUP1アッセイは、スプライシング因子の変異の遺伝子スクリーニングとして使用でき、使用されています。例えば、最大のスプライシングタンパク質であるPrp8pは、スプライソソームのRNAコアがスプライシング反応を触媒するプラットフォームとして機能します。これは、Prp8p変異体が異なるACT1-CUP1レポーター10、11、12、13、14、15、16、17のスプライシングをどのように改善または減少させたかによって部分的に推測されました。スプライソソームの他のタンパク質成分も、Hsh155p、Cwc2p、Cef1p、およびEcm2p18、19、20、21、22、23、24、25を含むACT1-CUP1を使用して調べられています。スプライソソーム移行に関与するPrp16pおよび他の4つのATPアーゼのエネルギー閾値も、このアッセイ9、26、27、28、29、30で研究されています。低分子核RNA(snRNA)は、ACT1-CUP1を利用して、それらが配位するプレmRNA配列と、スプライシング中にsnRNAが受ける二次構造の変化を特定するために広く研究されています3,31,32,33,34,35,36,37。
ACT1-CUP1アッセイには、CUP1遺伝子のすべてのコピーがノックアウトされた酵母株が必要です。CUP1は高いコピー数6,38を有する可能性があるため、フルノックアウト株の調製には、複数回のラウンドまたは広範なスクリーニングが必要になる場合があります。その結果、cup1Δ酵母株は、報告者と同様に、ラボ間で共有されることがよくあります。
スプライシング因子の変異がプラスミドコピーから評価されている場合、この因子の野生型遺伝子をノックアウトする必要があります。さらに、酵母のバックグラウンドでは、ACT1-CUP1レポーターを含むプラスミド、歴史的にロイシン栄養選択プラスミドを含むプラスミド、および研究されるスプライシング機構の突然変異または摂動を含むプラスミドの少なくとも2つのプラスミドの選択を可能にする必要があります(図2)。通常、1回のアッセイで、それぞれがクエリスプライシング摂動(QSP)と異なるレポーターを運ぶ複数の酵母株が、スプライシングに対するクエリの影響をテストします。
ACT1-CUP1アッセイの独立変数により、研究者はQSPの重症度を評価することができます。これらの独立変数は、銅の濃度と複数の非コンセンサスプライシングレポーターの選択です。まず、酵母株が銅濃度の範囲を含むプレート上で増殖するため(図2)、アッセイの設定には、使用する濃度の勾配の選択が含まれます。研究では、コース銅濃度勾配を利用して生存率の初期測定値を取得し、次により細かい勾配でアッセイを繰り返して、微妙な生存率の違いを特定できます。2番目の変数は、テスト可能な広範囲のACT1-CUP1レポーターです(図 1および 表1)。QSPが非コンセンサスレポーターの存在下で野生型とで酵母の生存率に異なる影響を与える場合、QSPはスプライシングのステップまたはイントロンのその領域の認識または処理中に重要なスプライソソームの領域に影響を与えるという結論を下すことができます。
酵母ツールボックスは広範であり、ACT1-CUP1アッセイはスプライシング研究の不可欠な部分です。ACT1-CUP1アッセイは、QSPの影響に関するより詳細な遺伝的、構造的、および/または生化学的分析と並行して実行されることがよくあります。これらのより詳細な研究は一般的により長い手順および/またはより高い値札を持っているので、頻繁なアプローチは最初にACT1-CUP1を持つ興味深い変異体をスクリーニングすることです。
ここで提供されるのは、銅板調製を含むACT1-CUP1アッセイプロトコルです。このアッセイは、スプライシングに対するQSPの影響と、摂動の影響を最も受けるイントロニック領域に対する最初の答えを研究者に提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-332</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-760</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filter System (0.22 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229707</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Any molecular grade agar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870EA</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>PN6200.1</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490005-906</td>
			<td>Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate Pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LC134051</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29399481</td>
			<td>ImageQuant 4000 (used for Figure 3),&#160; Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropout mix (-Leu)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>D9525</td>
			<td>Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1682836</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band quantifying software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0006-05</td>
			<td>ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D3500</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infra-red gel imaging device</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29238583</td>
			<td>Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-7Q</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-101</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-51</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin replicator</td>
			<td>VP Scientific</td>
			<td>VP 407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro disposable cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-590</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IST-3075</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biowave</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-156</td>
			<td>Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-520-16S</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>Y2025</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast

スプライソソームまたはその基質に導入された変異は、スプライソソーム機能の複雑さの理解に大きく貢献しています。疾患関連であろうと機能的に選択されたものであろうと、これらの変異の多くは、モデル生物 Saccharomyces cerevisiae (酵母)の成長アッセイを使用して研究されています。スプライシング特異的銅成長アッセイ(ACT1-CUP1アッセイ)は、表現型レベルでの変異の包括的な分析を提供します。ACT1-CUP1アッセイは、正しくスプライスされた場合に銅耐性を付与するレポーターを利用します。したがって、銅の存在下では、酵母の生存率の変化はスプライシングによるmRNA産生の変化と相関しています。典型的な実験では、酵母スプライソソームは、スプライシングに対する相乗的または反対の影響を検出するために、さまざまな非コンセンサスプライシングレポーターと目的のスプライシング因子変異に挑戦されます。ここでは、銅板の調製、酵母細胞のめっき、およびデータ評価の完全な説明が与えられます。ACT1-CUP1レポーターの多様性を強調する補完的な実験の選択が説明されています。ACT1-CUP1アッセイは、突然変異効果を直接読み出し、現場での継続的な使用による比較の可能性により、スプライシングツールボックスの便利なツールです。

ACT1-CUP1のような増殖アッセイでは、複数のコロニーの視覚的比較評価が必要です。ここでは、各菌株を一晩飽和状態まで増殖させ、OD600 を0.5に希釈し、0 mMから1.1 mMCuSO4 の範囲の銅濃度を含む20枚のプレートに播種しました(図3)。この範囲は、以下で使用および説明するQSPおよびACT1-CUP1レポーターの影響を完全に評価できるため、プロトコルにリストされ...

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ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

銅成長アッセイであるACT1-CUP1アッセイは、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)スプライシングと、変異体スプライシング因子がスプライソソーム機能に与える影響を迅速に読み取ることができます。この研究はプロトコルを提供し、関心のあるスプライシングの問題に対処するために可能なカスタマイズを強調しています。

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

ACT1-CUP1アッセイは、変異がプレメッセンジャーRNAスプライシングに影響を与えるかどうかを識別し、どのスプライシングステップが最も影響を受けるかを示すことができます。ACT1-CUP1アッセイは、スプライシング因子の変異をスプライシングの複雑なプロセスへの影響に関連付けます。成長表現型の単純な読み出しを利用し、広い感度範囲を有する。ACT1-CUP1アッセイを実施する際には、時間の効率的な使用が重要です。ストレスによる成長異常を最小限に抑えるために、5〜10株のアッセイから始めます。このプロセスを実演するのは、私と私の研究室の学部生研究者であるイザベル・マラシガンです。はじめに、各ボトルに790ミリグラムの寒天と攪拌子を加えます。大きなビーカーで、注ぐすべての銅板用のロイシンドロップアウト成長培地を準備します。これには、注ぐ各プレートに265ミリグラムの酵母窒素ベース、64ミリグラムのドロップアウトミックス、ロイシンを差し引いたもの、および34ミリリットルの脱イオン水が含まれます。攪拌して溶解し、次に、34ミリリットルのロイシンドロップアウト増殖培地溶液を各調製した100ミリリットルのボトルに加え、アルミホイルでキャップする。次に、オートクレーブを滅菌し、寒天を溶解し、オートクレーブに推奨される液体サイクルを使用する。オートクレーブ後できるだけ早く、各ボトルに4ミリリットルの20%グルコースを加えます。次に、チューブラベルをボトルラベルに合わせ、2ミリリットルの硫酸銅希釈液をそれぞれ目的のボトルに追加します。攪拌プレートを使用して、約30秒間混合し、気泡を避けて、ラベル付けされたプレートに35ミリリットルを注ぐかピペットで入れます。酵母株あたり、9ミリリットルのロイシンドロップアウト増殖培地と1ミリリットルの20%グルコースを滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に加えます。滅菌スティックまたはピペットチップを使用して、酵母の小さな見本を集め、培地に接種します。次に、すべての一晩培養物を180 RPMと摂氏30度で振ってください。次に、1株あたり900マイクロリットルの水を含む100マイクロリットルの培養物をキュベットに加えます。その後、分光光度計で光学密度を測定し、最終容量2ミリリットルで光学密度0.5になるために必要な希釈率を計算します。その後、各菌株を10%グリセロールで光学濃度0.5に希釈し、光学濃度を再測定して、細胞密度が所望の範囲内にあることを確認する。無菌の作業場所を設定した後、ブンゼンバーナーに火をつけます。48ピンレプリケーターの場合、希釈した各株200マイクロリットルを96ウェルプレートの別々のウェルにピペットで入れ、6×8グリッドの空きスペースに200マイクロリットルの10%グリセロールを入れます。次に、レプリケーターを95%エタノールと炎の浅い皿に浸して滅菌します。細胞に熱衝撃を与えないように、炎が消えた後、少なくとも2分間冷まします。バーナーの近くに4枚のプレートを置き、蓋を外します。リプリケーターを96ウェルプレートに浸し、1回の素早い動きで持ち上げます。次に、プレートにそっと置き、前後に軽く揺り動かして、うまく移動できるようにします。1回の素早い動きで持ち上げ、96ウェルプレート内でまったく同じ向きに置きます。プレートがメッキされた後、滑らかな動きで横に移動しますが、それでも炎の滅菌傘内にあります。蓋をする前に、プレートを完全に乾かしてください(通常は3〜5分)。次に、プレートを摂氏30度で3日間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出した後、それらを目視検査する。成長アッセイは、銅濃度が増加するにつれて、スプライシングの低い株がコンフルエント性を低下させ、銅濃度が致命的になることを示しました。酵母の背景には破壊されたADE2遺伝子が含まれており、その結果、コロニーはさまざまな赤の色合いになります。そして成熟したコロニーは濃い赤でした。プレーティング中に、レプリケーターを左右に動かしながら持ち上げたり、斜めに持ってきたり、プレート上で振ったりすれば、細胞溶液の小さな液滴から楕円形のコロニーやマイクロコロニーを作ることができる。A3cレポーターを含む酵母は0.15ミリモルの銅まで生存しましたが、野生型レポーター細胞はテストされた銅濃度の範囲の終わりまで生存率を維持しました。アッセイ結果は、U6 snRNA位置57の異なる塩基が、5プライムまたは分岐部位変異と組み合わせてスプライソソームに独特の影響を与えることを示しました。U57cは加加突然変異ですが、A3cおよびブランチサイトGレポーターと組み合わせて銅耐性を低下させます。対照的に、U57aは第2段階への進行を促進するため、銅耐性を高めます。ACT1-CUP1によってスプライシング摂動が同定された後、研究はプライマー伸長やEMSAや酵素プロービングによる破壊された分子相互作用の同定など、より定量的な方法に移行できます。ACT1-CUP1は、酵母スプライソソームの堅牢性と選択性に関する理解を深めるための基礎となるアッセイです。そして、それはスプライソソーム機能の理解を拡大し続けています。

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