Name: act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00
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Gracias a Aaron Hoskins y a los miembros del laboratorio Hoskins de la Universidad de Wisconsin-Madison por el uso de cepas y equipos de levadura en la generación de las figuras 3-5. Gracias a Harpreet Kaur y Xingyang Fu por sus perspicaces comentarios sobre el manuscrito. Gracias a los estudiantes, el personal y la facultad de apoyo de la Universidad del Noroeste durante la escritura, edición y filmación de este documento. Gracias a Isabelle Marasigan por su ayuda en la filmación de este método.

1. Construcción de la cepa de levadura
<ol><li>Generar u obtener una cepa de S. cerevisiae cuyo fondo incluya leu2 y cup1Δ. Para generar este fondo, utilice el método de levadura bien establecido que emplea acetato de litio y ADN monocatenario39. NOTA: Las cepas de levadura haploide pueden contener una, dos o más copias de CUP1 6,38. Consulte la información genómica de la cepa...

ACT1-CUP1 es un ensayo de crecimiento, y se debe tener cuidado para garantizar que las diferencias de crecimiento observadas solo puedan atribuirse a defectos de empalme. Todas las cepas deben manipularse de manera similar antes del enchapado, incluyendo tener una longitud y un tipo similares de crecimiento y condiciones de almacenamiento. Si se utilizan cepas sensibles a la temperatura, los ensayos ACT1-CUP1 solo deben realizarse en condiciones en las que esas cepas crezcan de manera comparable al tipo silvestre. Relaci...

El espliceosoma es una gran máquina biológica que cataliza la eliminación de intrones, regiones no codificantes en el ARN mensajero precursor (pre-ARNm)1,2. La caracterización del efecto de un mutante de un solo punto en 1 de las casi 100 proteínas y 5 ARN no codificantes es a menudo ambigua cuando se estudia la proteína o el ARN de forma aislada. El cambio en la función del componente mutado se puede evaluar mejor in vivo en el contexto del espliceosoma completo y funcional.
El ensayo de crecimiento de cobre descrito aquí es un indicador rápido de la eficiencia de empalme en Saccharomyces cerevisiae o levadura en ciernes. Desarrollado por C.F. Lesser y C. Guthrie y publicado en 1993, este ensayo combina la facilidad de trabajar con un organismo modelo simple y la lectura directa de la viabilidad celular3. La viabilidad se correlaciona con qué tan bien los espliceosomas en estas células pueden reconocer y empalmar la transcripción del reportero.
Este ensayo de crecimiento de cobre se denomina más comúnmente ensayo ACT1-CUP1. El nombre ACT1-CUP1 se origina a partir de los dos genes fusionados para crear un reportero de eficiencia de empalme. ACT1 es el gen de la actina de la levadura, que está altamente expresado y tiene un intrón empalmado eficientemente 4,5. Cup1p es un quelante de cobre que secuestra cobre en la célula para evitar la interferencia con las funciones celulares regulares 6,7,8. El reportero ACT1-CUP1 contiene estos genes en secuencia tal que CUP1 está en el marco de lectura adecuado solo si se produce un empalme previo al ARNm del intrón de ACT1 (Figura 1). La proteína de fusión resultante contiene los primeros 21 aminoácidos de actina y la proteína Cup1p de longitud completa, lo que aumenta la viabilidad de la levadura en un ambiente rico en cobre3. Por lo tanto, un aumento en la cantidad de empalme del reportero da como resultado una mayor concentración de Cup1p y una mayor resistencia al cobre (Figura 1). En comparación con otros genes reporteros, CUP1 afecta la viabilidad celular incluso a niveles bajos, tiene un amplio rango de sensibilidad y puede usarse para seleccionar directamente mutaciones de empalme 3,6,7. Además, CUP1 no es esencial para el crecimiento estándar de la levadura y, por lo tanto, la homeostasis celular no se ve afectada durante la configuración de este ensayo. Complementario a los ensayos de deleción o crecimiento de temperatura, ACT1-CUP1 proporciona información sobre los efectos sobre el empalme en condiciones óptimas de crecimiento de levadura.
El espliceosoma reconoce su sustrato a través de tres secuencias intrónicas, a saber, el sitio de empalme de 5' (5' SS), el sitio de ramificación (BS) y el sitio de empalme de 3' (3' SS). Se han generado numerosos reporteros ACT1-CUP1 que contienen secuencias no consensuadas en estos sitios. Una selección de los reporteros ACT1-CUP1 más comunes se muestra en la Figura 1 y la Tabla 1. Como el espliceosoma interactúa con cada sitio de empalme de forma única en diferentes puntos del ciclo de empalme, la robustez del espliceosoma se puede probar en diferentes pasos en función de qué informador sin consenso se utiliza. Los reporteros sin consenso se nombran por la posición mutada dentro del intrón y la base a la que fue mutado. Por ejemplo, A3c es un reportero con una mutación en el SS 5', específicamente la posición 3 de la adenosina de consenso a una citosina. Este reportero interactuará fuertemente con las mutaciones del espliceosoma que afectan la selección y el uso de 5' SS. En su estudio inicial, Lesser y Guthrie determinaron qué mutaciones 5' SS inhibían el empalme3. Más tarde, el mismo año, Burgess y Guthrie publicaron reporteros sin consenso en los tres sitios de empalme en una pantalla supresora de mutaciones en la ATPasa Prp16p9. Comparando el consenso con los reporteros sin consenso, el ensayo ACT1-CUP1 ha sido una clave importante para comprender la robustez y selectividad del espliceosoma de levadura e inferir la función de los espliceosomas de otros eucariotas.
A medida que los reporteros ACT1-CUP1 sin consenso sensibilizan al espliceosoma a una mayor perturbación, el impacto de una sola mutación del factor de empalme puede caracterizarse a través de los reporteros que impacta positiva o negativamente. Esto se ha aplicado al empalme de preguntas de investigación de varias maneras. En primer lugar, el ensayo ACT1-CUP1 puede y ha sido utilizado como una pantalla genética para mutaciones en los factores de empalme. Por ejemplo, Prp8p, la proteína de empalme más grande, sirve como una plataforma sobre la cual el núcleo de ARN del espliceosoma cataliza la reacción de empalme. Esto se dedujo, en parte, a través de cómo los mutantes Prp8p mejoraron o redujeron el empalme de diferentes reporteros ACT1-CUP1 10,11,12,13,14,15,16,17. Otros componentes proteicos del espliceosoma también se han investigado utilizando ACT1-CUP1, incluyendo Hsh155p, Cwc2p, Cef1p y Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Los umbrales energéticos para Prp16p y otras cuatro ATPasas involucradas en la transición espliceosomal también se han estudiado con este ensayo 9,26,27,28,29,30. Los ARN nucleares pequeños (snRNAs) también se han estudiado ampliamente utilizando ACT1-CUP1 para identificar las secuencias de pre-ARNm que coordinan y los cambios en la estructura secundaria que sufren los snRNAs durante el empalme 3,31,32,33,34,35,36,37.
El ensayo ACT1-CUP1 requiere una cepa de levadura donde todas las copias del gen CUP1 han sido eliminadas. Como CUP1 puede tener un alto número de copias 6,38, la preparación de una cepa knock-out completa puede requerir múltiples rondas o un cribado extenso. Como resultado, las cepas de levadura cup1Δ a menudo se han compartido entre laboratorios, al igual que los reporteros.
Si se evalúan mutaciones en un factor de empalme a partir de una copia plásmida, el gen de tipo salvaje para este factor debe ser eliminado. Además, el fondo de levadura debe permitir la selección de al menos dos plásmidos, uno que contenga un reportero ACT1-CUP1, históricamente en un plásmido de selección de nutrientes de leucina, y otro que contenga una mutación o perturbación en la maquinaria de empalme que se estudiará (Figura 2). Por lo general, en un solo ensayo, varias cepas de levadura, cada una con la perturbación de empalme de consulta (QSP) y un reportero diferente, probarán el impacto de la consulta en el empalme.
Las variables independientes en el ensayo ACT1-CUP1 permiten al investigador evaluar la gravedad de un QSP. Estas variables independientes son la concentración de cobre y la selección de múltiples reporteros de empalme sin consenso. En primer lugar, como las cepas de levadura se cultivan en placas que contienen un rango de concentraciones de cobre (Figura 2), la configuración del ensayo incluye la selección del gradiente de concentraciones utilizadas. Los estudios pueden utilizar un gradiente de concentración de cobre de curso para obtener una lectura inicial de la viabilidad y luego repetir el ensayo con un gradiente más fino para identificar diferencias sutiles de viabilidad. La segunda variable es la amplia gama de reporteros ACT1-CUP1 posibles de probar (Figura 1 y Tabla 1). Si el QSP afecta la viabilidad de la levadura de manera diferente en presencia de un informador sin consenso versus de tipo salvaje, se puede concluir que el QSP afecta un paso en el empalme o una región del espliceosoma importante durante el reconocimiento o procesamiento de esa región del intrón.
La caja de herramientas de levadura es extensa, y el ensayo ACT1-CUP1 es una parte integral de la investigación de empalme. El ensayo ACT1-CUP1 a menudo se realiza junto con un análisis genético, estructural y / o bioquímico más profundo sobre el impacto de un QSP. Como estos estudios más detallados generalmente tienen un procedimiento más largo y / o un precio más alto, un enfoque frecuente es la detección de mutantes interesantes con ACT1-CUP1 primero.
Aquí se proporciona un protocolo de ensayo ACT1-CUP1, incluida la preparación de la placa de cobre. Este ensayo proporciona a los investigadores una respuesta inicial al efecto de un QSP en el empalme y qué regiones intrónicas se ven más afectadas por la perturbación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-332</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-760</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filter System (0.22 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229707</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Any molecular grade agar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870EA</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>PN6200.1</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490005-906</td>
			<td>Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate Pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LC134051</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29399481</td>
			<td>ImageQuant 4000 (used for Figure 3),&#160; Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropout mix (-Leu)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>D9525</td>
			<td>Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1682836</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band quantifying software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0006-05</td>
			<td>ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D3500</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infra-red gel imaging device</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29238583</td>
			<td>Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-7Q</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-101</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-51</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin replicator</td>
			<td>VP Scientific</td>
			<td>VP 407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro disposable cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-590</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IST-3075</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biowave</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-156</td>
			<td>Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-520-16S</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>Y2025</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast

Las mutaciones introducidas en el espliceosoma o su sustrato han contribuido significativamente a nuestra comprensión de las complejidades de la función espliceosomal. Ya sea relacionada con la enfermedad o seleccionada funcionalmente, muchas de estas mutaciones se han estudiado utilizando ensayos de crecimiento en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae (levadura). El ensayo de crecimiento de cobre específico de empalme, o ensayo ACT1-CUP1, proporciona un análisis exhaustivo de la mutación a nivel fenotípico. El ensayo ACT1-CUP1 utiliza reporteros que confieren tolerancia al cobre cuando se empalma correctamente. Por lo tanto, en presencia de cobre, los cambios en la viabilidad de la levadura se correlacionan con los cambios en la producción de ARNm a través del empalme. En un experimento típico, el espliceosoma de levadura es desafiado con diferentes reporteros de empalme sin consenso y la mutación del factor de empalme de interés para detectar cualquier impacto sinérgico o antitético en el empalme. Aquí se da una descripción completa de la preparación de la placa de cobre, el recubrimiento de las células de levadura y la evaluación de los datos. Se describe una selección de experimentos complementarios, destacando la versatilidad de los reporteros ACT1-CUP1. El ensayo ACT1-CUP1 es una herramienta útil en la caja de herramientas de empalme gracias a la lectura directa de los efectos mutacionales y las posibilidades comparativas del uso continuo en el campo.

Los ensayos de crecimiento, como ACT1-CUP1, requieren la evaluación visual y comparativa de múltiples colonias. Aquí, cada cepa se cultivó hasta la saturación durante la noche, se diluyó a un OD600 de 0.5 y se chapó en 20 placas que contienen un rango de concentraciones de cobre de 0 mM a 1.1 mMCuSO4 (Figura 3). Este rango es menor que el enumerado en el protocolo, ya que permitió la evaluación completa del impacto de los QSP y los reporteros ACT1-CUP1 utilizad...

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ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

El ensayo ACT1-CUP1, un ensayo de crecimiento de cobre, proporciona una lectura rápida del empalme del ARN mensajero precursor (pre-ARNm) y el impacto que los factores de empalme mutante tienen en la función espliceosomal. Este estudio proporciona un protocolo y destaca la personalización posible para abordar la cuestión de empalme de interés.

Los ensayos ACT1-CUP1 determinan las sensibilidades específicas del sustrato de los mutantes espliceosomales en levaduras en ciernes

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

El ensayo ACT1-CUP1 puede identificar si una mutación afecta el empalme de ARN premensajero y dar una indicación de qué paso de empalme se ve más afectado. El ensayo ACT1-CUP1 vincula la mutación del factor de empalme con su impacto en el complejo proceso de empalme. Utiliza la lectura simple del fenotipo de crecimiento y tiene un amplio rango de sensibilidad.El uso eficiente del tiempo es importante cuando se lleva a cabo un ensayo ACT1-CUP1. Comience con un ensayo de cinco a 10 cepas para minimizar las aberraciones de crecimiento inducidas por el estrés. Demostrando el proceso seremos yo e Isabelle Marasigan, una investigadora de pregrado de mi laboratorio.Para comenzar, agregue 790 miligramos de agar y una barra de agitación a cada botella. En un vaso de precipitados grande, prepare los medios de crecimiento de leucina para que se viertan todas las placas de cobre. Esto incluye 265 miligramos de base de nitrógeno de levadura, 64 miligramos de mezcla de gota, menos leucina y 34 mililitros de agua desionizada para cada plato que se verterá.Revuelva para disolver Luego, agregue 34 mililitros de la solución de medios de crecimiento de leucina a cada botella preparada de 100 mililitros y cubra con papel de aluminio. A continuación, autoclave para esterilizar y disolver el agar, utilizando el ciclo líquido recomendado para el autoclave. Tan pronto como sea posible después del autoclave, agregue cuatro mililitros de glucosa al 20% a cada botella.Luego, haga coincidir la etiqueta del tubo con la etiqueta de la botella para agregar las dos diluciones de mililitros de sulfato de cobre cada una a su botella prevista. Usando un plato de agitación, mezcle durante aproximadamente 30 segundos y vierta o pipete 35 mililitros en el plato etiquetado, evitando burbujas. Por cepa de levadura, agregue nueve mililitros de medios de crecimiento de leucina y un mililitro de 20% de glucosa a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.Usando un palillo estéril, o punta de pipeta, reúna una pequeña muestra de levadura e inocule el medio. Luego, agite todos los cultivos durante la noche a 180 RPM y 30 grados centígrados. A continuación, agregue 100 microlitros de cultivo a una cubeta, que contenga 900 microlitros de agua por cepa.Después, mida la densidad óptica con un espectrofotómetro y calcule la dilución requerida para estar a una densidad óptica de 0.5 en un volumen final de dos mililitros. Luego, diluya cada cepa a una densidad óptica de 0.5 en 10% de glicerol y vuelva a medir la densidad óptica para confirmar que la densidad celular está dentro del rango deseado. Después de configurar un lugar de trabajo estéril, encienda un quemador Bunsen.Para un replicador de 48 pines, pipetea 200 microlitros de cada cepa diluida en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos y llena los espacios vacíos en la rejilla de seis por ocho con 200 microlitros de 10% de glicerol. Luego, sumerja el replicador en un plato poco profundo de 95% de etanol y llama para esterilizar. Deje que se enfríe durante al menos dos minutos después de que la llama se extinga para evitar que el calor choque las células.Coloque cuatro placas cerca del quemador y retire las tapas. Sumerja el replicador en la placa de 96 pocillos y levántelo en un movimiento rápido. Luego, coloque suavemente sobre el plato y balancee ligeramente hacia adelante y hacia atrás para facilitar una buena transferencia.Levante en un movimiento rápido y colóquelo exactamente en la misma orientación en la placa de 96 pocillos. Después de que se haya plateado una placa, muévase con un movimiento suave hacia un lado, pero aún dentro del paraguas de esterilización de la llama. Deje que las placas se sequen completamente antes de colocar las tapas, generalmente de tres a cinco minutos.Luego, incubar las placas durante tres días a 30 grados centígrados. Después de retirar las placas de la incubadora, inspecciónelas visualmente. El ensayo de crecimiento demostró que a medida que aumenta la concentración de cobre, las cepas con menor empalme muestran una disminución de la confluencia, hasta el punto en que la concentración de cobre se vuelve letal.El fondo de levadura incluye un gen ADE2 alterado, lo que hace que las colonias sean de diferentes tonos de rojo. Y las colonias maduras eran de color rojo intenso. Durante el recubrimiento, si el replicador se levanta mientras se mueve hacia la izquierda o hacia la derecha, se lleva en ángulo o si se agita por encima de la placa, es posible crear colonias de forma ovalada o microcolonias a partir de pequeñas gotas de solución celular.La levadura con el reportero A3c sobrevivió a 0,15 milimolares de cobre, mientras que las células reporteras de tipo salvaje mantuvieron la viabilidad hasta el final del rango de concentraciones de cobre probadas. Los resultados del ensayo mostraron que las diferentes bases en la posición 57 del snRNA U6 tienen impactos únicos en el espliceosoma en combinación con una mutación de 5 primos o rama. Mientras que U57c es una mutación aditiva, disminuyendo la tolerancia al cobre, en combinación con A3c y reporteros de sitio G de rama.En contraste, U57a aumenta la tolerancia al cobre porque promueve la progresión al segundo paso. Después de identificar la perturbación del empalme a través de ACT1-CUP1, la investigación puede pasar a métodos más cuantitativos, como la extensión del cebador y la identificación de la interacción molecular interrumpida a través de EMSA y sondeo enzimático. ACT1-CUP1 ha sido un ensayo fundamental, construyendo nuestra comprensión de la robustez y selectividad del espliceosoma de levadura.Y continúa expandiendo nuestra comprensión de la función espliceosomal.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Sola molécula fluorescencia In Situ hibridación (smFISH) análisis de florecimiento levadura crecimiento vegetativo y la Meiosis

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