Name: the application of open searching-based approaches for the identification of acinetobacter baumannii o-linked glycopeptides
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides at JoVE.com

N.E.S נתמך על ידי מלגת עתיד של מועצת המחקר האוסטרלית (FT200100270) ומענק פרויקט ARC Discovery (DP210100362). אנו מודים לספקטרומטריית המסה של מלבורן ולמתקן הפרוטאומיקה של המכון למדע וביוטכנולוגיה Biotechnology Bio21 על הגישה למכשור טרשת נפוצה.

הערה: ניתן לחלק את ההכנה והניתוח של דגימות גליקופפטיד חיידקיות לארבעה חלקים (איור 1). עבור מחקר זה, הגליקוזילציה של שלושה זני A. baumannii רצף הוערך (טבלה 1). מסדי נתונים של Proteome FASTA של כל אחד מהזנים האלה נגישים באמצעות Uniprot. עיין בטבלה 2 עבור הרכב המאגרים המשמ?...

חיפוש פתוח הוא שיטה יעילה ושיטתית לזיהוי שינויים לא ידועים. בעוד זיהוי של גליקנים לא ידועים בתוך דגימות פרוטאום חיידקי היה באופן מסורתי התחייבות גוזלת זמן ומתמחה מבחינה טכנית, ההתפתחויות האחרונות של כלים כגון MSfragger21,41 ו Byonic31,38</s...

גליקוסילציה של חלבון, תהליך הצמדת פחמימות למולקולות חלבון, הוא אחד השינויים הנפוצים ביותר לאחר התרגום (PTMs) בטבע 1,2. בכל תחומי החיים התפתח מגוון של מכונות מורכבות המוקדשות לדור הגליקופרוטאינים המשפיעים על מספר עצום של פונקציות תאיות 1,3,4,5. בעוד גליקוסילציה חלבון מתרחשת על מגוון של חומצות אמינו 6,7, N מקושר ו O הקשורים Glycosylation אירועים הם שתי צורות דומיננטיות שנצפו בטבע. גליקוסילציה הקשורה ל- N כרוכה בחיבור של גליקנים לאטום חנקן של שאריות אספרגין (Asn), ואילו בגליקוזילציה המקושרת ל- O, הגליקנים מחוברים לאטום חמצן של סרין (Ser), תרונין (Thr) או טירוזין (Tyr) שאריות7. למרות הדמיון בשאריות הממוקדות על ידי מערכות גליקוסילציה, ההבדלים בתוך הגליקנים המחוברים לחלבונים גורמים לגליקוזילציה להיות המעמד המגוון ביותר מבחינה כימית של PTMs שנמצא בטבע.
בעוד שלמערכות הגליקוסילציה האוקריוטית יש מגוון גליקן, מערכות אלה מוגבלות בדרך כלל במספר הפחמימות הייחודיות המנוצלות. המגוון המתקבל נובע מהאופן שבו פחמימות אלה מסודרות בגליקנים 8,9,10,10,11,12. לעומת זאת, מינים חיידקיים וארכאיים בעלי מגוון גליקנים כמעט בלתי מוגבל בשל המערך העצום של סוכרים ייחודיים הנוצרים בתוך מערכות אלה 2,10,13,14,15,16,17. הבדלים אלה במגוון הגליקנים שנצפו בתחומי החיים מייצגים אתגר אנליטי משמעותי לאפיון ולזיהוי של אירועי גליקוזילציה. עבור גליקוסילציה אאוקריוטית, היכולת לצפות קומפוזיציות גליקן הקל על העניין הגובר בגליקוביולוגיה; עם זאת, אותו הדבר אינו נכון לגבי גליקוזיליה חיידקית, אשר עדיין מוגבלת במידה רבה למחקר על ידי מעבדות מיוחדות. ככל שהנגישות של מכשור ספקטרומטריית המסה (MS) גדלה במדעי הביולוגיה, גישות מבוססות טרשת נפוצה הן כעת השיטה העיקרית לניתוח גליקופרוטומי.
טרשת נפוצה התגלתה ככלי המובהק לאפיון הגליקוזילציה, עם גישות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה המשמשות כיום לאפיון גליקופרוטאינים6. בעוד פרוטאומיקה מלמעלה למטה משמשת להערכת דפוסי גליקוסילציה גלובליים של חלבונים ספציפיים18,19, גישות מלמטה למעלה משמשות כדי לאפשר אפיון ספציפי לגליקן של גליקופפטידים, אפילו מתערובות מורכבות 6,20,21,22,23. לניתוח של גליקופפטידים, הדור של מידע פיצול אינפורמטיבי חיוני לאפיון אירועי גליקוסילציה24,25. מגוון גישות פיצול נגישות כעת באופן שגרתי במכשירים, כולל דיסוציאציה מבוססת התנגשות מבוססת התנגשות מבוססת תהודה יון (IT-CID), דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מסוג קרן (CID) ודיסוציאציה של העברת אלקטרונים (ETD). לכל גישה יש עוצמות וחולשות שונות לניתוח גליקופפטידים25,26, עם התקדמות משמעותית בעשור האחרון ביישום גישות פיצול אלה לניתוח גליקוסילציה 6,20. עם זאת, עבור ניתוח גליקוסילציה חיידקי, המגבלה הקריטית לא הייתה היכולת לפצל גליקופפטידים אלא חוסר היכולת לחזות את הרכבי הגליקאן הפוטנציאליים בתוך דגימות. בתוך מערכות אלה, הטבע הלא ידוע של גלייקנים חיידקיים מגוונים מגביל את הזיהוי של גליקופפטידים, אפילו עם כלי חיפוש ממוקדי גליקוסילציה כיום נפוץ לניתוח של גליקופפטידים אוקריוטיים, כגון O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28, ו GlycReSoft29. כדי להתגבר על בעיה זו, נדרשת שיטת חיפוש חלופית, עם שימוש בכלי חיפוש פתוחים המתעוררים כגישה רבת עוצמה לחקר הגליקוזילציה החיידקית30.
חיפוש פתוח, הידוע גם בשם חיפוש עיוור או כללי, מאפשר זיהוי של פפטידים עם PTMs לא ידועים או בלתי צפויים 21,30,31,32. חיפושים פתוחים משתמשים במגוון טכניקות חישוביות, כולל חיפושי שינויים שאצרו, חיפושים במסדי נתונים מרובי שלבים או חיפוש סובלני בעל מסה רחבה 33,34,35,35,36,37. למרות שלחיפוש פתוח יש פוטנציאל גדול, השימוש בו בדרך כלל הופרע על ידי העלייה המשמעותית בזמני הניתוח ואובדן הרגישות לגילוי פפטידים שלא השתנו בהשוואה לחיפושים מוגבלים31,32. הירידה בזיהוי התאמות פפטיד-ספקטרלי (PSMs) שלא השתנו היא תוצאה של שיעורי PSM חיוביים כוזבים הקשורים לטכניקות אלה, הדורשים סינון קפדני מוגבר כדי לשמור על שיעורי הגילוי השגויים הרצויים (FDRs)33,34,35,35,36,37 . לאחרונה, מספר כלים הפכו זמינים המשפרים באופן משמעותי את הנגישות של חיפוש פתוח, כולל Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40, ו- MSFragger 21,41. כלים אלה מאפשרים זיהוי חזק של אירועי גליקוסילציה על ידי צמצום משמעותי של זמני הניתוח ויישום גישות לטיפול בהרכבי גליקן הטרוגניים.
מאמר זה מציג שיטה יעילה לזיהוי גליקופפטידים חיידקיים על ידי חיפוש פתוח, באמצעות פתוגן נוסוקומי שלילי גרם, Acinetobacter baumannii, כמודל. A. baumannii בעל מערכת גליקוזילטציה מקושרת O משומרת האחראית לשינוי של מצע חלבונים מרובים, המכונה מערכת גליקוזילציה חלבון PglL 42,43,44. בעוד חלבונים דומים מיועדים לגליקוזילציה בין זנים, מערכת הגליקוזילציה PglL משתנה מאוד בשל הביוסינתזה של הגליקן המשמש לגליקוזילציה של חלבון המופקת מהלוקוס של הקפסולה (המכונה K-locus)44,45,46. התוצאה היא גליקנים מגוונים (הידוע גם בשם K-יחידה), נגזר יחיד או מוגבל K-יחידות פולימריות, מתווסף מצע חלבון 30,44,46. במסגרת עבודה זו, השימוש בכלי החיפוש הפתוח, MSfragger, בתוך התוכנה FragPipe, משמש לזיהוי גליקנים על פני זני A. baumannii. על ידי שילוב של חיפוש פתוח ואוצרות ידנית, ניתן לבצע "חיפושים ממוקדי גליקנים" כדי לשפר עוד יותר את הזיהוי של גליקופפטידים חיידקיים. יחד, גישה זו לזיהוי רב-שלבי מאפשרת זיהוי של גליקופפטידים ללא ניסיון רב באפיון אירועי גליקוסילציה חדשניים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 G Kel-F Hub point style 3</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>hanc90514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>C0267-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (28%)</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>338818-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Reagent A</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Reagent B</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C8 Empore SPE</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>66882-U</td>
			<td>An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>5.33002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>650447-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/4058/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>66886-U</td>
			<td>An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2232000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>252859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C protease mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7810040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIC-HILIC material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1504580001</td>
			<td>Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the application of open searching-based approaches for the identification of acinetobacter baumannii o-linked glycopeptides

גליקוסילציה של חלבון מוכרת יותר ויותר כשינוי נפוץ בתוך אורגניזמים חיידקיים, התורמת לפיזיולוגיה פרוקריוטית ולזיהום אופטימלי של מינים פתוגניים. בשל כך, יש עניין גובר באפיון גליקוסילציה חיידקית וצורך בכלים אנליטיים בעלי תפוקה גבוהה כדי לזהות אירועים אלה. למרות פרוטאומיקה מלמטה למעלה בקלות מאפשרת את הדור של נתוני גליקופפטיד עשירים, הרוחב והמגוון של הגליקנים שנצפו במינים פרוקריוטים הופכים את הזיהוי של אירועי גליקוזילציה חיידקית למאתגר ביותר.
באופן מסורתי, הקביעה הידנית של הרכבי הגליקנים בערכות נתונים פרוטאומיות חיידקיות הפכה את זה לניתוח מותאם אישית במידה רבה המוגבל למומחים ספציפיים לשטח. לאחרונה, גישות פתוחות המבוססות על חיפוש התגלו כחלופה רבת עוצמה לזיהוי שינויים לא ידועים. על ידי ניתוח התדירות של שינויים ייחודיים שנצפו על רצפי פפטיד, טכניקות חיפוש פתוחות מאפשרות זיהוי של גליקנים נפוצים המחוברים לפפטידים בתוך דגימות מורכבות. מאמר זה מציג זרימת עבודה יעילה לפרשנות וניתוח של נתונים גליקופרוטומיים, המדגים כיצד ניתן להשתמש בטכניקות חיפוש פתוחות לזיהוי גליקופפטידים חיידקיים ללא ידע מוקדם על הרכבי הגליקנים.
באמצעות גישה זו, גליקופפטידים בתוך דגימות ניתן לזהות במהירות כדי להבין הבדלי גליקוסילציה. באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל, גישות אלה מאפשרות השוואה של קומפוזיציות גליקאניות בין זנים וזיהוי של גליקופרוטאין חדשניים. יחד, עבודה זו מדגימה את הרבגוניות של טכניקות חיפוש מסד נתונים פתוחות לזיהוי גליקוסילציה חיידקית, מה שהופך את האפיון של גליקופרוטומים מגוונים אלה קל יותר מאי פעם.

כדי להמחיש את התועלת של חיפוש פתוח עבור ניתוח גליקופפטיד חיידקי, המגוון הכימי של glycans מקושר O בתוך שלושה זנים של A. baumannii-AB307-0294, ACICU, ו D1279779-הוערך. הגליקופרוטאומים המקושרים O משתנים מאוד בין זני A. baumannii כמו הגליקנים המשמשים לגליקוזילציה נגזרים מן loci כמוסה משתנה מאוד 44,45,46.<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides at JoVE.com

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.

היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

פרוטוקול זה מייעל את הזיהוי של גליקופ% eptides חיידקי, ומאפשר לחוקרים לזהות אירועי גליקוזילציה חדשניים, כמו גם את ההבדלים בגליקנים המשמשים לגליקוזילציה בין זנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למומחים שאינם גליקוזיליה לזהות אירועי גליקוסילציה פוטנציאליים בדגימות פרוטאום חיידקי. חיפוש פתוח הוא גישה ישימה בדרך כלל שניתן להשתמש בה לזיהוי מגוון של שינויים, לא רק גליקוזיליה, וניתן ליישם אותה על כל דגימת פרוטאום.להכנת טיפים לחילוץ STB-RPS stop and-go, השתמש במחט קהה של 14 מד כדי לסלק שלושה דיסקי STB-RPS מקרום STB-RPS בגודל 47 מ"ר לכריכת 50 מיקרוגרם של פפטיד. עבור כמויות פפטיד גדולות יותר, להגדיל את מספר הדיסקים בהתאם. לפני השימוש בעצות השלב SDB-RPS, לשטוף את הטיפים על ידי הוספת 150 microliters של 100% acetonitrile ספינינג המאגר על ידי צנטריפוגה או בעדינות הפעלת לחץ באמצעות מזרק.לאחר מכן, לשטוף את הטיפים עם 150 microliters של 30% מתנול המכיל 1%TFA, ולאחר מכן שיווי משקל את הטיפים עם 150 microliters של 90% isopropanol המכיל 1%TFA. לאחר שיווי משקל, לטעון את דגימות פרוטאום על טיפים שלב STB-RPS על ידי צנטריפוגה או באמצעות מזרק. לאחר מכן, לשטוף את הטיפים עם 150 microliters של 90% איזופרופנול המכיל 1%TFA ואחריו 150 microliters של 1%TFA.כדי לחמוק מהפטידים מטיפי השלב STB-RPS, השתמש ב-150 מיקרוליטרים של 5% אמוניום הידרוקסיד ו-80% אצטוניטריל שנוספו לקצה אחד ואספו את הדגימות המחולקות בצינורות בודדים על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק. לחלופין, אם אתם בורחים באמצעות צנטריפוגה, השתמשו ב-150 מיקרוליטרים ב-5% אמוניום הידרוקסיד ב-80% אצטטוניטריל שנוסף לכל טיפי הבמה ואספו בצלחת נקייה. ייבשו את הפפטידים המנופחים על ידי צנטריפוגת ואקום ב-25 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, כדי להעשיר את דגימות הגליקופטיד, להכין כרומטוגרפיה נוזלית אינטראקציה הידרופילית zwitterionic, או ZIC-HILIC, טיפים לשלב. יש לחתוך דיסק C8 אחד מקרום C8 בגודל 470 מ"ר באמצעות מחט קהה בגודל 14 מ"מ ולארוז את הדיסק לתוך קצה P-200 כדי ליצור פריט. לאחר מכן, להוסיף כחמישה מילימטרים של חומר ZIC-HILIC resuspended ב 50% acetonitrile על פריט על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק.לפני השימוש בעצות, השתוות את השרף עם 20 נפחי מיטה של חיץ ההמלטה ZIC-HILIC, משאירים 10 מיקרוליטרים של נפח מעל השרף כדי להבטיח כי השרף לא יתייבש. לאחר מכן, לשטוף ברצף את השרף עם 20 נפחי מיטה של חיץ הכנה ZIC-HILIC ואחריו 20 נפחי מיטה של ZIC-HILIC טעינה או חיץ לשטוף. לאחר מכן, הגדילו מחדש את הפפטידים המעוכלים והמיובשים במאגר הטעינה ZIC-HILIC לריכוז סופי של ארבעה מיקרוגרם למיקרוליטר.מערבולת בקצרה במשך דקה אחת כדי להבטיח את הדגימות resuspended ואז לסובב אותם במשך דקה אחת ב 2000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, טען את דגימת הפפטיד המחודשת לעמודת ZIC-HILIC המותנית, ולאחר מכן שטף את העמודה שלוש פעמים עם 20 נפחי מיטה של מאגר הטעינה ZIC-HILIC על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק. לבסוף, לברוח גליקופפטידים עם 20 נפחי המיטה של חיץ ההמלטה ZIC-HILIC לתוך צינור 1.5 מיליליטר על ידי החלת בעדינות לחץ באמצעות מזרק, ולאחר מכן לייבש את המלט על ידי צנטריפוגת ואקום ב 25 מעלות צלזיוס.לניתוח LC-MS, הגדילו מחדש את הדגימות ב-Buffer A*לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר, ולאחר מכן טענו את הדגימות על HPLC-UPLC המחובר לטרשת נפוצה כדי לאפשר הפרדה וזיהוי של גליקופפטידים. נטר את איסוף נתוני MS המתקבל, והבטח שהנתונים נאספים עם הפרמטרים הרצויים. כדי לנתח את הדגימות המועשרות בפרוטיאום ובגליקופפטיד, פתח את FragPipe ולחץ על הכרטיסיה זרימת עבודה.מהתפריט הנפתח זרימת עבודה, בחר באפשרות פתח חיפוש ולחץ על הוסף קבצים כדי לייבא את קבצי הנתונים לחיפוש לתוך FragPipe. לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה מסד נתונים ואחריו הורד כדי להפעיל את מנהל ההורדות להורדת מסדי נתונים של פרוטאום מ- UniProt באמצעות מספר גישה של UniProt. בתוך מנהל ההורדות, לחץ על האפשרות הוסף פתיונות ומזהמים כדי לשלב חלבונים דמה ומזהמים במסד נתונים זה.לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה MSFragger ולאחר מכן בתוך התיבה התאמת שיא, הגדל את עמידות המסה של מבשר מ- 500 dalton המוגדר כברירת מחדל ל- 2, 000 dalton כדי לזהות שינויים גדולים. לחץ על הכרטיסיה הפעלה כדי להגדיר את מיקום היציאות של FragPipe ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל בחיפוש. עם גליקופטידים בעלי ביטחון גבוה שהוקצו, זהה יונים הקשורים לגליקנים שנצפו בדרך כלל כדי לשפר את הזיהוי של גליקופפטידים.לאחר מכן, לחץ על הכרטיסיה MSFragger והוסף את מסות הדלתא הנחושות של הגליקנים שנצפו למקטעים שינויים משתנים והיסט מסה עם מסות בודדות המופרדות באמצעות קו נטוי. לאחר מכן, הוסף את גושי השברים הקשורים לגליקן של הגליקנים האלה למקטע Glyco / Labile Mods של MSFragger. לבסוף, העלה את כל נתוני הטרשת הנפוצה הקשורים למחקרים פרוטאומיים למאגרים פרוטאומיים מרכזיים, כגון מאגרי PRIDE או MassIVE.חיפוש פתוח של זן Acinetobacter baumannii AB307-0294 גילה שתי מסות דלתא דומיננטיות המקבילות 648.25 ו 692.28 דלטון. קפסולת ACICU ידועה להיות מורכב של יחידת K tetrasaccharide המתאים למסה חזויה של 843.31 דלתון. מבנה קפסולה זה עולה בקנה אחד עם מסת הדלתא הנצפית ביותר בתוך ACICU.ניתוח חיפוש פתוח של הזן D1279779 גילה את נוכחותם של מסות דלתא מרובות בקנה אחד עם 203.08, 794.31, ו 1588.62 דלתונים. באמצעות ביאור ספקטרלי פפטיד אינטראקטיבי, גליקופפטידים שזוהו על פני שלושה זני A.baumannii הוערכו חושף יונים פוטנציאליים הקשורים גליקן. חיפושים ממוקדי גליקן הובילו לעלייה ניכרת במספר הכולל של התאמות ספקטרליות של גליקופפטיד/פפטיד שזוהו בכל שלושת זני A.baumannii, המקבילים לעלייה של 37% ב- ACICU, עלייה של 117% ב- AB307-0294, ועלייה של 363% ב- D1279779.עבור אירועי טרשת נפוצה בודדים, הכללת מידע ספציפי לגליקן מגדילה בדרך כלל את Hyperscore שנצפה, אם כי עלייה זו תלויה מאוד גליקן. בעת ביצוע העשרת ZIC-HILIC, ודא כי השרף תמיד נשאר רטוב, כמו אובדן של ממס עלול לסכן את הבידוד של גליקופפטידים. נתונים על הבדלים בגליקוזילציה יכולים לשמש כדי ליידע מחקרים mutagenesis או לזהות שיעורי גנים אחראים על biosynthesis גליקן.באמצעות חיפוש מסד נתונים פתוח, התחלנו לאפיין מגוון גליקן על פני סוגים חיידקיים. זה הראה כי גליקוסילציה חיידקית היא גם נפוצה יותר וגם הרבה יותר מגוונת ממה שחשבנו פעם.

the-application-open-searching-based-approaches-for-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the double bond. Changes in FA composition play a crucial role in the adaptation of bacteria to their environment. These modifications entail a change in the ratio of iso versus anteiso branched FAs, and in the proportion of unsaturated FAs relative to saturated FAs, with double bonds created at specific positions. Precise identification of the FA profile is necessary to understand the adaptation mechanisms of Bacillus species.
Many of the FAs from Bacillus are not commercially available. The strategy proposed herein identifies FAs by combining information on the retention time (by calculation of the equivalent chain length (ECL)) with the mass spectra of three types of FA derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). This method can identify the FAs without the need to purify the unknown FAs.
Comparing chromatographic profiles of FAME prepared from Bacillus cereus with a commercial mixture of standards allows for the identification of straight-chain saturated FAs, the calculation of the ECL, and hypotheses on the identity of the other FAs. FAMEs of branched saturated FAs, iso or anteiso, display a constant negative shift in the ECL, compared to linear saturated FAs with the same number of carbons. FAMEs of unsaturated FAs can be detected by the mass of their molecular ions, and result in a positive shift in the ECL compared to the corresponding saturated FAs.
The branching position of FAs and the double bond position of unsaturated FAs can be identified by the electron ionization mass spectra of picolinyl and DMOX derivatives, respectively. This approach identifies all the unknown saturated branched FAs, unsaturated straight-chain FAs and unsaturated branched FAs from the B. cereus extract.

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

זיהוי של חומצות שומן ב<em&gt; Cereus בצילוס</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and identification of an active pheromone compound. This method has resulted in the successful characterization of the chemical signals that function as pheromones in a wide range of animal species. Sea lampreys rely on olfaction to detect pheromones that mediate behavioral or physiological responses. We use this knowledge of fish biology to posit functions of putative pheromones and to guide the isolation and identification of active pheromone components. Chromatography is used to extract, concentrate, and separate compounds from the conditioned water. Electro-olfactogram (EOG) recordings are conducted to determine which fractions elicit olfactory responses. Two-choice maze behavioral assays are then used to determine if any of the odorous fractions are also behaviorally active and induce a preference. Spectrometric and spectroscopic methods provide the molecular weight and structural information to assist with the structure elucidation. The bioactivity of the pure compounds is confirmed with EOG and behavioral assays. The behavioral responses observed in the maze should ultimately be validated in a field setting to confirm their function in a natural stream setting. These bioassays play a dual role to 1) guide the fractionation process and 2) confirm and further define the bioactivity of isolated components. Here, we report the representative results of a sea lamprey pheromone identification that exemplify the utility of the bioassay-guided fractionation approach. The identification of sea lamprey pheromones is particularly important because a modulation of its pheromone communication system is among the options considered to control the invasive sea lamprey in the Laurentian Great Lakes. This method can be readily adapted to characterize the chemical communication in a broad array of taxa and shed light on waterborne chemical ecology.

Here, we present a protocol to isolate and characterize the structure, olfactory potency, and behavioral response of putative pheromone compounds of sea lampreys.

הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. Although the molecular mechanisms for the biological responses to fluid flow/shear force are not fully understood, fluid flow-mediated regulation of ion channel gating may contribute critically. Therefore, fluid flow/shear force sensitivity of ion channels has been studied using the patch-clamp technique. However, depending on the experimental protocol, the outcomes and interpretation of data can be erroneous. Here, we present experimental and theoretical evidence for fluid flow-related errors and provide methods for estimating, preventing, and correcting these errors. Changes in junction potential between the Ag/AgCl reference electrode and bathing fluid were measured with an open pipette filled with 3 M KCl. Fluid flow could then shift the liquid/metal junction potential to approximately 7 mV. Conversely, by measuring the voltage shift induced by fluid flow, we estimated the ion concentration in the unstirred boundary layer. In the static condition, the real ion concentrations adjacent to the Ag/AgCl reference electrode or ion channel inlet at the cell-membrane surface can reach as low as approximately 30% of that in the flow condition. Placing an agarose 3 M KCl bridge between the bathing fluid and reference electrode may have prevented this problem of junction potential shifting. However, the unstirred layer effect adjacent to the cell membrane surface could not be fixed in this way. Here, we provide a method for measuring real ion concentrations in the unstirred boundary layer with an open patch-clamp pipette, emphasizing the importance of using an agarose salt-bridge while studying fluid flow-induced regulation of ion currents. Therefore, this novel approach, which takes into consideration the real concentrations of ions in the unstirred boundary layer, may provide useful insight on the experimental design and data interpretation related to fluid shear stress regulation of ion channels.

Mechanosensitive ion channels are often studied in terms of fluid flow/shear force sensitivity with patch-clamp recording. However, depending on the experimental protocol, the outcome on fluid flow-regulations of ion channels can be erroneous. Here, we provide methods for preventing and correcting such errors with a theoretical basis.

מדידת ריכוז יון בשכבת הגבול Unstirred עם תיקון פתוח-קלאמפ פיפטה: השלכות בשליטה של תעלות יונים על ידי נוזל לזרום

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

ניצול שיפור פלואורסצנטיות הנגרמת על-ידי חלבון בזמן כדי לזהות קונפורמציות מקומיות יציבות אחת α-Synuclein Monomer בכל פעם

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...