Name: the application of open searching-based approaches for the identification of acinetobacter baumannii o-linked glycopeptides
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides at JoVE.com

N.E.S. एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य फैलोशिप (FT200100270) और एक ARC डिस्कवरी परियोजना अनुदान (DP210100362) द्वारा समर्थित है। हम एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन तक पहुंच के लिए Bio21 आणविक विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी संस्थान की मेलबोर्न मास स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटिओमिक्स सुविधा को धन्यवाद देते हैं।

नोट: बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड नमूनों की तैयारी और विश्लेषण को चार वर्गों में विभाजित किया जा सकता है (चित्रा 1)। इस अध्ययन के लिए, तीन अनुक्रमित ए. बौमनी उपभेदों के ग्लाइकोसिलेशन का मू?...

खुला खोज अज्ञात संशोधनों की पहचान के लिए एक प्रभावी और व्यवस्थित विधि है। जबकि बैक्टीरियल प्रोटिओम नमूनों के भीतर अज्ञात ग्लाइकन की पहचान पारंपरिक रूप से एक समय लेने वाली और तकनीकी रूप से विशिष्ट उपक?...

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन, प्रोटीन अणुओं के लिए कार्बोहाइड्रेट संलग्न करने की प्रक्रिया, प्रकृति में सबसे आम पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) में से एक है 1,2। जीवन के सभी डोमेन में, जटिल मशीनरी की एक श्रृंखला ग्लाइकोप्रोटीन की पीढ़ी के लिए समर्पित विकसित हुई है जो सेलुलर कार्यों के असंख्य को प्रभावित करतीहै 1,3,4,5। जबकि प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन अमीनो एसिड 6,7 की एक श्रृंखला पर होता है, एन-लिंक्ड और ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन घटनाएं प्रकृति में देखे जाने वाले दो प्रमुख रूप हैं। एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन में शतावरी (एएसएन) अवशेषों के नाइट्रोजन परमाणु के लिए ग्लाइकन का लगाव शामिल है, जबकि ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन में, ग्लाइकन सेरीन (सेर), थ्रेओनिन (थ्र), या टायरोसिन (टायर) अवशेषोंके ऑक्सीजन परमाणु से जुड़े होते हैं। ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम द्वारा लक्षित अवशेषों में समानता के बावजूद, प्रोटीन से जुड़े ग्लाइकन के भीतर के अंतर के परिणामस्वरूप ग्लाइकोसिलेशन प्रकृति में पाए जाने वाले पीटीएम का सबसे रासायनिक रूप से विविध वर्ग है।
जबकि यूकेरियोटिक ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम में ग्लाइकन विविधता होती है, ये प्रणालियां आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अद्वितीय कार्बोहाइड्रेट की संख्या में प्रतिबंधित होती हैं। परिणामी विविधता इस बात से उपजी है कि इन कार्बोहाइड्रेट को ग्लाइकन 8,9,10,11,12 में कैसे व्यवस्थित किया जाता है। इसके विपरीत, बैक्टीरियल और आर्कियल प्रजातियों में इन प्रणालियों के भीतर उत्पन्न अद्वितीय शर्करा की सरासर सरणी के कारण लगभग असीमित ग्लाइकन विविधता होती है 2,10,13,14,15,16,17। जीवन के डोमेन में देखे गए ग्लाइकन विविधता में ये अंतर ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं के लक्षण वर्णन और पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण विश्लेषणात्मक चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। यूकेरियोटिक ग्लाइकोसिलेशन के लिए, ग्लाइकन रचनाओं का अनुमान लगाने की क्षमता ने ग्लाइकोबायोलॉजी में बढ़ती रुचि को सुविधाजनक बनाया है; फिर भी, बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन के लिए भी यही सच नहीं है, जो अभी भी विशेष प्रयोगशालाओं द्वारा अध्ययन करने के लिए काफी हद तक प्रतिबंधित है। जैसा कि बायोसाइंसेज में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) इंस्ट्रूमेंटेशन की पहुंच में वृद्धि हुई है, एमएस-आधारित दृष्टिकोण अब ग्लाइकोप्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्राथमिक विधि हैं।
एमएस ग्लाइकोसिलेशन के लक्षण वर्णन के लिए उत्कृष्ट उपकरण के रूप में उभरा है, जिसमें ऊपर-नीचे और नीचे-ऊपर दोनों दृष्टिकोण अब आमतौर पर ग्लाइकोप्रोटीन 6 को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जातेहैं। जबकि टॉप-डाउन प्रोटिओमिक्स का उपयोग विशिष्ट प्रोटीन18,19 के वैश्विक ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न का आकलन करने के लिए किया जाता है, बॉटम-अप दृष्टिकोण का उपयोग ग्लाइकोपेप्टाइड्स के ग्लाइकन-विशिष्ट लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए किया जाता है, यहां तक कि जटिल मिश्रण 6,20,21,22,23 से भी। ग्लाइकोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए, सूचनात्मक विखंडन जानकारी की पीढ़ी ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं24,25 के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है। विखंडन दृष्टिकोण की एक श्रृंखला अब उपकरणों पर नियमित रूप से सुलभ है, जिसमें अनुनाद आयन ट्रैप-आधारित टक्कर-प्रेरित पृथक्करण (आईटी-सीआईडी), बीम-प्रकार के टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी), और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण पृथक्करण (ईटीडी) शामिल हैं। प्रत्येक दृष्टिकोण में ग्लाइकोपेप्टाइड विश्लेषण25,26 के लिए अलग-अलग ताकत और कमजोरियां हैं, पिछले दशक में ग्लाइकोसिलेशन 6,20 का विश्लेषण करने के लिए इन विखंडन दृष्टिकोणों को लागू करने में महत्वपूर्ण प्रगति के साथ। हालांकि, बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन विश्लेषण के लिए, महत्वपूर्ण सीमा ग्लाइकोपेप्टाइड्स को टुकड़े करने की क्षमता नहीं है, बल्कि नमूनों के भीतर संभावित ग्लाइकन रचनाओं की भविष्यवाणी करने में असमर्थता है। इन प्रणालियों के भीतर, विविध बैक्टीरियल ग्लाइकन की अज्ञात प्रकृति ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान को सीमित करती है, यहां तक कि ग्लाइकोसिलेशन-केंद्रित खोज उपकरणों के साथ भी अब यूकेरियोटिक ग्लाइकोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए आम है, जैसे कि ओ-पेयर27, ग्लाइकोपेप्टाइडग्राफएमएस28, और ग्लाइक्रेसॉफ्ट29। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, एक वैकल्पिक खोज विधि की आवश्यकता होती है, जिसमें खुले खोज उपकरणों का उपयोग बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन30 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभरता है।
खुली खोज, जिसे अंधा या वाइल्डकार्ड खोज के रूप में भी जाना जाता है, अज्ञात या अप्रत्याशित पीटीएम21,30,31,32 के साथ पेप्टाइड्स की पहचान की अनुमति देता है। खुली खोजें विभिन्न प्रकार की कम्प्यूटेशनल तकनीकों का उपयोग करती हैं, जिनमें क्यूरेटेड संशोधन खोजें, मल्टीस्टेप डेटाबेस खोजें, या व्यापक-द्रव्यमान सहिष्णु खोज 33,34,35,36,37 शामिल हैं। यद्यपि खुली खोज में बड़ी क्षमता है, इसके उपयोग को आमतौर पर विश्लेषण के समय में महत्वपूर्ण वृद्धि और प्रतिबंधितखोजों 31,32 की तुलना में असंशोधित पेप्टाइड्स का पता लगाने की संवेदनशीलता में नुकसान से बाधित किया गया है। असंशोधित पेप्टाइड-स्पेक्ट्रल मैचों (PSMs) का पता लगाने में कमी इन तकनीकों से जुड़ी झूठी-सकारात्मक PSM दरों में वृद्धि का एक परिणाम है, जिसके लिए वांछित झूठी खोज दरों (FDRs) को बनाए रखने के लिए कड़े फ़िल्टरिंग में वृद्धि की आवश्यकता होती है 33,34,35,36,37 . हाल ही में, कई उपकरण उपलब्ध हो गए हैं जो ओपन सर्चिंग की पहुंच में काफी सुधार करते हैं, जिनमें बायोनिक31,38, ओपन-पीफाइंड39, एएनएन-सोलो40 और एमएसफ्रेगर21,41 शामिल हैं। ये उपकरण विश्लेषण समय को काफी कम करके और विषम ग्लाइकन रचनाओं को संभालने के लिए दृष्टिकोण को लागू करके ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं की मजबूत पहचान को सक्षम करते हैं।
यह लेख एक मॉडल के रूप में ग्राम-नकारात्मक nosocomial रोगज़नक़, Acinetobacter baumannii का उपयोग करके खुली खोज द्वारा बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान के लिए एक सुव्यवस्थित विधि प्रस्तुत करता है। A. baumannii के पास एक संरक्षित O-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम है जो कई प्रोटीन सब्सट्रेट्स के संशोधन के लिए जिम्मेदार है, जिसे PglL प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम 42,43,44 के रूप में जाना जाता है। जबकि इसी तरह के प्रोटीन उपभेदों के बीच ग्लाइकोसिलेशन के लिए लक्षित हैं, पीजीएल ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण के कारण अत्यधिक परिवर्तनशील है, जो कैप्सूल लोकस (के-लोकस के रूप में जाना जाता है) 44,45,46 से व्युत्पन्न किया जा रहा है। इसके परिणामस्वरूप विविध ग्लाइकन (जिसे के-यूनिट के रूप में भी जाना जाता है), एकल या सीमित पॉलिमराइज्ड के-इकाइयों से व्युत्पन्न होता है, जिसे प्रोटीन सब्सट्रेट्स 30,44,46 में जोड़ा जाता है। इस काम के भीतर, खुले खोज उपकरण का उपयोग, MSfragger, सॉफ्टवेयर FragPipe के भीतर, A. baumannii उपभेदों भर में glycans की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। खुली खोज और मैनुअल क्यूरेशन के संयोजन से, "ग्लाइकन-केंद्रित खोजों" को बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान में और सुधार करने के लिए किया जा सकता है। साथ में, यह मल्टीस्टेप पहचान दृष्टिकोण उपन्यास ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं के लक्षण वर्णन में व्यापक अनुभव के बिना ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान को सक्षम बनाता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 G Kel-F Hub point style 3</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>hanc90514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>C0267-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (28%)</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>338818-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Reagent A</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Reagent B</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C8 Empore SPE</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>66882-U</td>
			<td>An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>5.33002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>650447-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/4058/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>66886-U</td>
			<td>An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2232000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>252859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C protease mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7810040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIC-HILIC material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1504580001</td>
			<td>Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the application of open searching-based approaches for the identification of acinetobacter baumannii o-linked glycopeptides

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन को तेजी से जीवाणु जीवों के भीतर एक सामान्य संशोधन के रूप में पहचाना जाता है, जो प्रोकैरियोटिक फिजियोलॉजी और रोगजनक प्रजातियों की इष्टतम संक्रामकता में योगदान देता है। इस वजह से, बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन की विशेषता में रुचि बढ़ रही है और इन घटनाओं की पहचान करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विश्लेषणात्मक उपकरणों की आवश्यकता है। हालांकि बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स आसानी से समृद्ध ग्लाइकोपेप्टाइड डेटा की पीढ़ी को सक्षम बनाता है, प्रोकैरियोटिक प्रजातियों में देखे गए ग्लाइकन की चौड़ाई और विविधता बैक्टीरिया ग्लाइकोसिलेशन की घटनाओं की पहचान को बेहद चुनौतीपूर्ण बनाती है।
परंपरागत रूप से, बैक्टीरियल प्रोटिओमिक डेटासेट के भीतर ग्लाइकन रचनाओं के मैनुअल निर्धारण ने इसे क्षेत्र-विशिष्ट विशेषज्ञों तक सीमित एक बड़े पैमाने पर बेस्पोक विश्लेषण बना दिया। हाल ही में, खुले खोज-आधारित दृष्टिकोण अज्ञात संशोधनों की पहचान के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में उभरे हैं। पेप्टाइड अनुक्रमों पर देखे गए अद्वितीय संशोधनों की आवृत्ति का विश्लेषण करके, खुली खोज तकनीकें जटिल नमूनों के भीतर पेप्टाइड्स से जुड़े सामान्य ग्लाइकन की पहचान की अनुमति देती हैं। यह लेख ग्लाइकोप्रोटिओमिक डेटा की व्याख्या और विश्लेषण के लिए एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है, यह दर्शाता है कि ग्लाइकन रचनाओं के पूर्व ज्ञान के बिना जीवाणु ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए खुली खोज तकनीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है।
इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, नमूनों के भीतर ग्लाइकोपेप्टाइड्स को ग्लाइकोसिलेशन मतभेदों को समझने के लिए तेजी से पहचाना जा सकता है। एक मॉडल के रूप में Acinetobacter baumannii का उपयोग करते हुए, ये दृष्टिकोण उपभेदों और उपन्यास ग्लाइकोप्रोटीन की पहचान के बीच ग्लाइकन रचनाओं की तुलना को सक्षम करते हैं। एक साथ लिया गया, यह काम बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन की पहचान के लिए खुले डेटाबेस-खोज तकनीकों की बहुमुखी प्रतिभा को दर्शाता है, जिससे इन अत्यधिक विविध ग्लाइकोप्रोटियोम के लक्षण वर्णन पहले से कहीं अधिक आसान हो जाते हैं।

बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड विश्लेषण के लिए खुली खोज की उपयोगिता को स्पष्ट करने के लिए, A. baumannii-AB307-AB307-0294, ACICU, और D1279779 के तीन उपभेदों के भीतर O-linked glycans की रासायनिक विविधता का आकलन किया गया था। O-linked glycoproteomes A. ...

Watch this Scientific Journal Video about The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides at JoVE.com

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

खुली खोज पहले से अज्ञात ग्लाइकन रचनाओं के साथ सजाए गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान को सक्षम बनाती है। इस लेख के भीतर, खुले खोज और बाद में ग्लाइकन-केंद्रित ग्लाइकोपेप्टाइड खोजों के उपक्रम के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण एक मॉडल के रूप में एसिनेटोबैक्टर बौमनी का उपयोग करके बैक्टीरिया के नमूनों के लिए प्रस्तुत किया गया है।

Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides की पहचान के लिए ओपन सर्च-आधारित दृष्टिकोण का अनुप्रयोग

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियल ग्लाइकोप% इप्टाइड्स की पहचान को सुव्यवस्थित करता है, जिससे शोधकर्ताओं को उपन्यास ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं की पहचान करने में सक्षम बनाता है, साथ ही उपभेदों के बीच ग्लाइकोसिलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकन में अंतर भी होता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह गैर-ग्लाइकोसिलेशन विशेषज्ञों को बैक्टीरिया के प्रोटिओम नमूनों में संभावित ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं की पहचान करने में सक्षम बनाता है। ओपन सर्चिंग एक आम तौर पर लागू होने वाला दृष्टिकोण है जिसका उपयोग संशोधनों की एक श्रृंखला की पहचान के लिए किया जा सकता है, न केवल ग्लाइकोसिलेशन, और इसे किसी भी प्रोटिओम नमूने पर लागू किया जा सकता है।एसटीबी-आरपीएस स्टॉप-एंड-गो निष्कर्षण युक्तियों को तैयार करने के लिए, पेप्टाइड के 50 माइक्रोग्राम को बाध्य करने के लिए 47-वर्ग-मिलीमीटर एसटीबी-आरपीएस झिल्ली से तीन एसटीबी-आरपीएस डिस्क को एक्साइज करने के लिए 14-गेज कुंद सुई का उपयोग करें। बड़ी पेप्टाइड मात्रा के लिए, तदनुसार डिस्क की संख्या बढ़ाएं। एसडीबी-आरपीएस चरण युक्तियों का उपयोग करने से पहले, 100% एसिटोनिट्रिल के 150 माइक्रोलीटर जोड़कर और सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बफर को कताई करके या धीरे-धीरे सिरिंज का उपयोग करके दबाव लागू करके युक्तियों को धोएं।इसके बाद, 1% टीएफए युक्त 30% मेथनॉल के 150 माइक्रोलीटर के साथ युक्तियों को धोएं, फिर 1% टीएफए युक्त 90% आइसोप्रोपेनॉल के 150 माइक्रोलीटर के साथ युक्तियों को संतुलित करें। संतुलन के बाद, सेंट्रीफ्यूजेशन या सिरिंज का उपयोग करके एसटीबी-आरपीएस चरण युक्तियों पर प्रोटिओम नमूनों को लोड करें। फिर, 90% आइसोप्रोपेनॉल के 150 माइक्रोलीटर के साथ युक्तियों को धोएं, जिसमें 1% टीएफए होता है, जिसके बाद 1% टीएफए के 150 माइक्रोलीटर होते हैं।एसटीबी-आरपीएस चरण युक्तियों से पेप्टाइड्स को दूर करने के लिए, 5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 150 माइक्रोलीटर और 80% एसिटोनिट्रिल का उपयोग करें, जिसे एक ही टिप में जोड़ा गया है और एक सिरिंज का उपयोग करके धीरे-धीरे दबाव लागू करके व्यक्तिगत ट्यूबों में एल्यूट किए गए नमूनों को इकट्ठा करें। वैकल्पिक रूप से, यदि सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से एल्यूटिंग करते हैं, तो 80% एसिटोनिट्राइल में 5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड पर 150 माइक्रोलीटर का उपयोग करें, जो सभी चरण युक्तियों में जोड़ा जाता है और एक साफ प्लेट में एकत्र होता है। 25 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एल्यूटेड पेप्टाइड्स को सुखाएं।इसके बाद, ग्लाइकोपेप्टाइड नमूनों को समृद्ध करने के लिए, एक zwitterionic हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन तरल क्रोमैटोग्राफी, या ZIC-HILIC, चरण युक्तियाँ तैयार करें। एक 470-वर्ग-मिलीमीटर C8 झिल्ली से एक C8 डिस्क को 14-गेज कुंद सुई का उपयोग करके एक्साइज करें और एक फ्रिट बनाने के लिए डिस्क को पी -200 टिप में पैक करें। फिर, लगभग पांच मिलीमीटर ZIC-HILIC सामग्री जोड़ें जो 50% एसिटोनिट्रिल में एक सिरिंज का उपयोग करके धीरे-धीरे दबाव लागू करके फ्रिट पर फिर से निलंबित हो जाती है।युक्तियों का उपयोग करने से पहले, ZIC-HILIC क्षालन बफर के 20 बिस्तर वॉल्यूम के साथ राल को संतुलित करें, यह सुनिश्चित करने के लिए राल के ऊपर मात्रा के 10 माइक्रोलीटर छोड़ दें कि राल सूखा नहीं जाता है। फिर, क्रमिक रूप से ZIC-HILIC तैयारी बफर के 20 बिस्तर की मात्रा के साथ राल को धोएं, जिसके बाद ZIC-HILIC लोडिंग या वॉश बफर के 20 बेड वॉल्यूम होते हैं। अगला, ZIC-HILIC लोडिंग बफर में पचे हुए और सूखे पेप्टाइड्स को प्रति माइक्रोलीटर चार माइक्रोग्राम की अंतिम एकाग्रता के लिए पुन: निलंबित करें।एक मिनट के लिए भंवर संक्षेप में यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूनों को फिर से निलंबित कर दिया गया है, फिर उन्हें 2000 बार जी और 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मिनट के लिए स्पिन करें। कताई के बाद, वातानुकूलित ZIC-HILIC स्तंभ पर पुन: निलंबित पेप्टाइड नमूना लोड करें, फिर एक सिरिंज का उपयोग करके धीरे से दबाव लागू करके ZIC-HILIC लोडिंग बफर के 20 बिस्तर वॉल्यूम के साथ स्तंभ को तीन बार धोएं। अंत में, एक सिरिंज का उपयोग करके धीरे-धीरे दबाव लागू करके 1.5-मिलीलीटर ट्यूब में ZIC-HILIC elution बफर के 20 बिस्तर की मात्रा के साथ ग्लाइकोपेप्टाइड्स को अलग करें, फिर 25 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एल्यूएंट को सुखाएं।एलसी-एमएस विश्लेषण के लिए, बफर ए * में नमूनों को एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित करें, फिर ग्लाइकोपेप्टाइड्स के पृथक्करण और पहचान को सक्षम करने के लिए एक एमएस के लिए युग्मित एचपीएलसी-यूपीएलसी पर नमूनों को लोड करें। परिणामी एमएस डेटा संग्रह की निगरानी करें, यह सुनिश्चित करें कि डेटा वांछित पैरामीटर के साथ एकत्र किया जा रहा है। proteome और ग्लाइकोपेप्टाइड-समृद्ध नमूनों का विश्लेषण करने के लिए, FragPipe खोलें और वर्कफ़्लो टैब पर क्लिक करें।वर्कफ़्लो पुल-डाउन मेनू से, खोज खोलें विकल्प का चयन करें और FragPipe में खोजी जाने वाली डेटा फ़ाइलों को आयात करने के लिए फ़ाइलें जोड़ें क्लिक करें. उसके बाद, एक UniProt परिग्रहण संख्या का उपयोग कर UniProt से proteome डेटाबेस डाउनलोड करने के लिए डाउनलोड प्रबंधक को लॉन्च करने के लिए डाउनलोड करने के बाद डेटाबेस टैब क्लिक करें। डाउनलोड प्रबंधक के भीतर, इस डेटाबेस में डिकॉय और संदूषक प्रोटीन को शामिल करने के लिए डिकॉय और संदूषक जोड़ें विकल्प पर क्लिक करें।अगला, MSFragger टैब पर क्लिक करें, फिर पीक मिलान बॉक्स के भीतर, बड़े संशोधनों की पहचान करने के लिए डिफ़ॉल्ट 500 डाल्टन से 2, 000 डाल्टन के लिए अग्रदूत द्रव्यमान सहिष्णुता को बढ़ाएं। FragPipe के आउटपुट का स्थान निर्धारित करने के लिए चलाएँ टैब क्लिक करें, फिर खोज प्रारंभ करने के लिए चलाएँ बटन क्लिक करें. असाइन किए गए उच्च आत्मविश्वास वाले ग्लाइकोपेप्टाइड्स के साथ, ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान में सुधार करने के लिए आमतौर पर देखे जाने वाले ग्लाइकन-संबद्ध आयनों की पहचान करें।अगला, MSFragger टैब पर क्लिक करें और चर संशोधनों में मनाया ग्लाइकन के निर्धारित डेल्टा द्रव्यमान जोड़ें और एक स्लैश के साथ अलग-अलग द्रव्यमान के साथ अलग-अलग द्रव्यमान के साथ मास ऑफसेट अनुभागों। फिर, इन ग्लाइकन के ग्लाइकन से जुड़े टुकड़े द्रव्यमान को MSFragger के ग्लाइको / लेबिल मॉड्स अनुभाग में जोड़ें। अंत में, प्रोटिओमिक अध्ययन से जुड़े सभी एमएस डेटा को केंद्रीकृत प्रोटिओमिक रिपॉजिटरीज़ में अपलोड करें, जैसे कि प्राइड या मैसिव रिपॉजिटरीज़।Acinetobacter baumannii तनाव AB307-0294 की खुली खोज ने 648.25 और 692.28 डाल्टन के अनुरूप दो प्रमुख डेल्टा द्रव्यमान का खुलासा किया। एसीआईसीयू कैप्सूल को 843.31 डाल्टन के अनुमानित द्रव्यमान के अनुरूप टेट्रासेकेराइड के यूनिट से बना माना जाता है। यह कैप्सूल संरचना एसीआईसीयू के भीतर सबसे अधिक बार देखे जाने वाले डेल्टा द्रव्यमान के अनुरूप है।स्ट्रेन D1279779 के खुले खोज विश्लेषण से 203.08, 794.31 और 1588.62 डाल्टन के अनुरूप कई डेल्टा द्रव्यमानों की उपस्थिति का पता चला। इंटरैक्टिव पेप्टाइड स्पेक्ट्रल एनोटेटर का उपयोग करते हुए, तीन ए.बाउमनी उपभेदों में पहचाने गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स का मूल्यांकन संभावित ग्लाइकन से जुड़े आयनों का खुलासा करने के लिए किया गया था। ग्लाइकन-केंद्रित खोजों ने सभी तीन ए.बाउमनी उपभेदों में पहचाने गए ग्लाइकोपेप्टाइड / पेप्टाइड स्पेक्ट्रल मैचों की कुल संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि का नेतृत्व किया, जो एसीआईसीयू में 37% की वृद्धि, एबी 307-0294 में 117% की वृद्धि और D1279779 में 363% की वृद्धि के अनुरूप था।व्यक्तिगत एमएस घटनाओं के लिए, ग्लाइकन-विशिष्ट जानकारी को शामिल करने से आमतौर पर मनाया गया हाइपरस्कोर बढ़ जाता है, हालांकि यह वृद्धि अत्यधिक ग्लाइकन-निर्भर है। ZIC-HILIC संवर्धन करते समय, सुनिश्चित करें कि राल हमेशा गीला रहता है, क्योंकि विलायक का नुकसान ग्लाइकोपेप्टाइड्स के अलगाव से समझौता कर सकता है। ग्लाइकोसिलेशन में अंतर पर डेटा का उपयोग म्यूटाजेनेसिस अध्ययनों को सूचित करने या ग्लाइकन जैवसंश्लेषण के लिए जिम्मेदार जीन वर्गों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।खुले डेटाबेस खोज का उपयोग करते हुए, हमने बैक्टीरियल जेनेरा में ग्लाइकन विविधता को चिह्नित करना शुरू कर दिया है। इससे पता चला है कि बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन दोनों अधिक सामान्य और कहीं अधिक विविध है जितना हमने एक बार सोचा था।

the-application-open-searching-based-approaches-for-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the double bond. Changes in FA composition play a crucial role in the adaptation of bacteria to their environment. These modifications entail a change in the ratio of iso versus anteiso branched FAs, and in the proportion of unsaturated FAs relative to saturated FAs, with double bonds created at specific positions. Precise identification of the FA profile is necessary to understand the adaptation mechanisms of Bacillus species.
Many of the FAs from Bacillus are not commercially available. The strategy proposed herein identifies FAs by combining information on the retention time (by calculation of the equivalent chain length (ECL)) with the mass spectra of three types of FA derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). This method can identify the FAs without the need to purify the unknown FAs.
Comparing chromatographic profiles of FAME prepared from Bacillus cereus with a commercial mixture of standards allows for the identification of straight-chain saturated FAs, the calculation of the ECL, and hypotheses on the identity of the other FAs. FAMEs of branched saturated FAs, iso or anteiso, display a constant negative shift in the ECL, compared to linear saturated FAs with the same number of carbons. FAMEs of unsaturated FAs can be detected by the mass of their molecular ions, and result in a positive shift in the ECL compared to the corresponding saturated FAs.
The branching position of FAs and the double bond position of unsaturated FAs can be identified by the electron ionization mass spectra of picolinyl and DMOX derivatives, respectively. This approach identifies all the unknown saturated branched FAs, unsaturated straight-chain FAs and unsaturated branched FAs from the B. cereus extract.

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

में फैटी एसिड की पहचान<em&gt; बेसिलस cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

आंतरिक रूप से बेक़ायदा प्रोटीन के एकाधिक Phosphorylations की पहचान के लिए परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

एक प्रोटीन प्रोटीन की उच्च throughput पहचान नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण का प्रयोग एक परमाणु cofactor साथ बातचीत के लिए तैयारी विधि

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and identification of an active pheromone compound. This method has resulted in the successful characterization of the chemical signals that function as pheromones in a wide range of animal species. Sea lampreys rely on olfaction to detect pheromones that mediate behavioral or physiological responses. We use this knowledge of fish biology to posit functions of putative pheromones and to guide the isolation and identification of active pheromone components. Chromatography is used to extract, concentrate, and separate compounds from the conditioned water. Electro-olfactogram (EOG) recordings are conducted to determine which fractions elicit olfactory responses. Two-choice maze behavioral assays are then used to determine if any of the odorous fractions are also behaviorally active and induce a preference. Spectrometric and spectroscopic methods provide the molecular weight and structural information to assist with the structure elucidation. The bioactivity of the pure compounds is confirmed with EOG and behavioral assays. The behavioral responses observed in the maze should ultimately be validated in a field setting to confirm their function in a natural stream setting. These bioassays play a dual role to 1) guide the fractionation process and 2) confirm and further define the bioactivity of isolated components. Here, we report the representative results of a sea lamprey pheromone identification that exemplify the utility of the bioassay-guided fractionation approach. The identification of sea lamprey pheromones is particularly important because a modulation of its pheromone communication system is among the options considered to control the invasive sea lamprey in the Laurentian Great Lakes. This method can be readily adapted to characterize the chemical communication in a broad array of taxa and shed light on waterborne chemical ecology.

Here, we present a protocol to isolate and characterize the structure, olfactory potency, and behavioral response of putative pheromone compounds of sea lampreys.

समुद्र Lamprey Pheromones की पहचान परख का उपयोग-निर्देशित भिंन

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Measurement of Ion Concentration in the Unstirred Boundary Layer with Open Patch-Clamp Pipette: Implications in Control of Ion Channels by Fluid Flow

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. Although the molecular mechanisms for the biological responses to fluid flow/shear force are not fully understood, fluid flow-mediated regulation of ion channel gating may contribute critically. Therefore, fluid flow/shear force sensitivity of ion channels has been studied using the patch-clamp technique. However, depending on the experimental protocol, the outcomes and interpretation of data can be erroneous. Here, we present experimental and theoretical evidence for fluid flow-related errors and provide methods for estimating, preventing, and correcting these errors. Changes in junction potential between the Ag/AgCl reference electrode and bathing fluid were measured with an open pipette filled with 3 M KCl. Fluid flow could then shift the liquid/metal junction potential to approximately 7 mV. Conversely, by measuring the voltage shift induced by fluid flow, we estimated the ion concentration in the unstirred boundary layer. In the static condition, the real ion concentrations adjacent to the Ag/AgCl reference electrode or ion channel inlet at the cell-membrane surface can reach as low as approximately 30% of that in the flow condition. Placing an agarose 3 M KCl bridge between the bathing fluid and reference electrode may have prevented this problem of junction potential shifting. However, the unstirred layer effect adjacent to the cell membrane surface could not be fixed in this way. Here, we provide a method for measuring real ion concentrations in the unstirred boundary layer with an open patch-clamp pipette, emphasizing the importance of using an agarose salt-bridge while studying fluid flow-induced regulation of ion currents. Therefore, this novel approach, which takes into consideration the real concentrations of ions in the unstirred boundary layer, may provide useful insight on the experimental design and data interpretation related to fluid shear stress regulation of ion channels.

Mechanosensitive ion channels are often studied in terms of fluid flow/shear force sensitivity with patch-clamp recording. However, depending on the experimental protocol, the outcome on fluid flow-regulations of ion channels can be erroneous. Here, we provide methods for preventing and correcting such errors with a theoretical basis.

खुला पैच के साथ unstirr सीमा परत में आयन एकाग्रता की माप-क्लैंप पिपेट: द्रव प्रवाह द्वारा आयन चैनलों के नियंत्रण में निहितार्थ

Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

माइक्रोबायल प्रोटीन और विशेष मेटाबोलाइट डेटा के विश्लेषण के लिए ओपन-स्रोत MALDI TOF-MS IDBac पाइपलाइन का उपयोग करना

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

एक नई Kinase प्रोटीन के मजबूत जैव रासायनिक दृष्टिकोण का उपयोग कर आणविक स्तर पर विशेषता

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

लीवर कैंसर में सूमो प्रोटेओम के संवर्धन, अलगाव, पहचान, और विशेषता के लिए उपकरण के रूप में SUMO-Binding संस्थाओं (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Making Precise and Accurate Single-Molecule FRET Measurements using the Open-Source smfBox

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes measurements on freely diffusing biomolecules more accessible. This overview includes a step-by-step protocol for using this instrument to make measurements of precise FRET efficiencies in duplex DNA samples, including details of the sample preparation, instrument setup and alignment, data acquisition, and complete analysis routines. The presented approach, which includes how to determine all the correction factors required for accurate FRET-derived distance measurements, builds on a large body of recent collaborative work across the FRET Community, which aims to establish standard protocols and analysis approaches. This protocol, which is easily adaptable to a range of biomolecular systems, adds to the growing efforts in democratising smFRET for the wider scientific community.

This article provides step-by-step instructions for making fully-corrected accurate FRET measurements on individual, freely diffusing biomolecules using the open-source, inexpensive smfBox, from switch on, through alignment and focusing, to data collection and analysis.

ओपन-सोर्स smfBox का उपयोग कर सटीक और सटीक एकल-अणु FRET माप बनाना

The smfBox is a recently developed cost-effective, open-source instrument for single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET), which makes ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural dynamics and its contributions to biology. While the FRET-based ruler reports on inter-dye distances in the 3-10 nm range, other spectroscopic techniques, such as protein-induced fluorescence enhancement (PIFE), report on the proximity between a dye and a protein surface in the shorter 0-3 nm range. Regardless of the method of choice, its use in measuring freely-diffusing biomolecules one at a time retrieves histograms of the experimental parameter yielding separate centrally-distributed sub-populations of biomolecules, where each sub-population represents either a single conformation that stayed unchanged within milliseconds, or multiple conformations that interconvert much faster than milliseconds, and hence an averaged-out sub-population. In single-molecule FRET, where the reported parameter in histograms is the inter-dye FRET efficiency, an intrinsically disordered protein, such as the &#945;-Synuclein monomer in buffer, was previously reported as exhibiting a single averaged-out sub-population of multiple conformations interconverting rapidly. While these past findings depend on the 3-10 nm range of the FRET-based ruler, we sought to put this protein to the test using single-molecule PIFE, where we track the fluorescence lifetime of site-specific sCy3-labeled &#945;-Synuclein proteins one at a time. Interestingly, using this shorter range spectroscopic proximity sensor, sCy3-labeled &#945;-Synuclein exhibits several lifetime sub-populations with distinctly different mean lifetimes that interconvert in 10-100 ms. These results show that while &#945;-Synuclein might be disordered globally, it nonetheless attains stable local structures. In summary, in this work we highlight the advantage of using different spectroscopic proximity sensors that track local or global structural changes one biomolecule at a time.

Time-resolved single-molecule protein-induced fluorescence enhancement is a useful fluorescence spectroscopic proximity sensor sensitive to local structural changes in proteins. Here we show it can be used to uncover stable local conformations in &#945;-Synuclein, which is otherwise known as globularly unstructured and unstable when measured using the longer range FRET ruler.

एक समय में स्थिर स्थानीय संरचना एक α-सिन्यूक्लिन मोनोमर की पहचान करने के लिए समय-संकल्पित प्रोटीन-प्रेरित फ्लोरेसेंस एन्हांसमेंट का उपयोग करना

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...