Name: the application of open searching-based approaches for the identification of acinetobacter baumannii o-linked glycopeptides
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00
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N.E.S è supportato da una Future Fellowship dell'Australian Research Council (FT200100270) e da una ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Ringraziamo la Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility del Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute per l'accesso alla strumentazione MS.

NOTA: La preparazione e l'analisi di campioni di glicopeptide batterico possono essere suddivise in quattro sezioni (Figura 1). Per questo studio, è stata valutata la glicosilazione di tre ceppi di A. baumannii sequenziati (Tabella 1). I database Proteome FASTA di ciascuno di questi ceppi sono accessibili tramite Uniprot. Fare riferimento alla Tabella 2 per la composizione dei buffer utilizzati in questo protocollo.
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La ricerca aperta è un metodo efficace e sistematico per l'identificazione di modifiche sconosciute. Mentre l'identificazione di glicani sconosciuti all'interno di campioni di proteoma batterico è stata tradizionalmente un'impresa dispendiosa in termini di tempo e tecnicamente specializzata, i recenti sviluppi di strumenti come MSfragger21,41 e Byonic 31,38 ora consentono l'identificazione rapida ed eff...

La glicosilazione proteica, il processo di attaccamento dei carboidrati alle molecole proteiche, è una delle modificazioni post-traduzionali (PTM) più comuni in natura 1,2. In tutti i domini della vita, si è evoluta una gamma di macchinari complessi dedicati alla generazione di glicoproteine che influenzano una miriade di funzioni cellulari 1,3,4,5. Mentre la glicosilazione proteica si verifica su una gamma di amminoacidi 6,7, gli eventi di glicosilazione legata all'N e all'O sono due forme dominanti osservate in natura. La glicosilazione legata all'N comporta l'attaccamento dei glicani a un atomo di azoto di residui di asparagina (Asn), mentre nella glicosilazione legata all'O, i glicani sono attaccati a un atomo di ossigeno di serina (Ser), treonina (Thr) o tirosina (Tyr) residui7. Nonostante le somiglianze nei residui presi di mira dai sistemi di glicosilazione, le differenze all'interno dei glicani attaccati alle proteine fanno sì che la glicosilazione sia la classe chimicamente più diversificata di PTM presenti in natura.
Mentre i sistemi di glicosilazione eucariotica possiedono la diversità dei glicani, questi sistemi sono in genere limitati nel numero di carboidrati unici utilizzati. La diversità risultante deriva da come questi carboidrati sono disposti in glicani 8,9,10,11,12. Al contrario, le specie batteriche e arcaiche possiedono una diversità glicana praticamente illimitata a causa della vasta gamma di zuccheri unici generati all'interno di questi sistemi 2,10,13,14,15,16,17. Queste differenze nella diversità glicanica osservata tra i domini della vita rappresentano una sfida analitica significativa per la caratterizzazione e l'identificazione degli eventi di glicosilazione. Per la glicosilazione eucariotica, la capacità di anticipare le composizioni glicaniche ha facilitato il crescente interesse per la glicobiologia; tuttavia, lo stesso non è vero per la glicosilazione batterica, che è ancora in gran parte limitata allo studio da parte di laboratori specializzati. Poiché l'accessibilità della strumentazione di spettrometria di massa (MS) è aumentata nelle bioscienze, gli approcci basati sulla SM sono ora il metodo principale per l'analisi glicoproteomica.
La SM è emersa come lo strumento per eccellenza per la caratterizzazione della glicosilazione, con approcci sia top-down che bottom-up ora comunemente usati per caratterizzare le glicoproteine6. Mentre la proteomica top-down viene utilizzata per valutare i modelli di glicosilazione globale di proteine specifiche18,19, vengono utilizzati approcci bottom-up per consentire la caratterizzazione glicano-specifica dei glicopeptidi, anche da miscele complesse 6,20,21,22,23. Per l'analisi dei glicopeptidi, la generazione di informazioni informative sulla frammentazione è essenziale per la caratterizzazione degli eventi di glicosilazione24,25. Una serie di approcci di frammentazione è ora abitualmente accessibile sugli strumenti, tra cui la dissociazione indotta da collisioni basata sulla trappola ionica di risonanza (IT-CID), la dissociazione indotta da collisioni di tipo fascio (CID) e la dissociazione a trasferimento di elettroni (ETD). Ogni approccio possiede diversi punti di forza e di debolezza per l'analisi dei glicopeptidi25,26, con progressi significativi nell'ultimo decennio nell'applicazione di questi approcci di frammentazione per analizzare la glicosilazione 6,20. Tuttavia, per l'analisi della glicosilazione batterica, la limitazione critica non è stata la capacità di frammentare i glicopeptidi, ma piuttosto l'incapacità di prevedere le potenziali composizioni di glicani all'interno dei campioni. All'interno di questi sistemi, la natura sconosciuta di diversi glicani batterici limita l'identificazione dei glicopeptidi, anche con strumenti di ricerca focalizzati sulla glicosilazione ormai comuni per l'analisi dei glicopeptidi eucariotici, come O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 e GlycReSoft29. Per superare questo problema, è necessario un metodo di ricerca alternativo, con l'uso di strumenti di ricerca aperti che emergono come un potente approccio per lo studio della glicosilazione batterica30.
La ricerca aperta, nota anche come ricerca cieca o jolly, consente l'identificazione di peptidi con PTMsconosciuti o inaspettati 21,30,31,32. Le ricerche aperte utilizzano una varietà di tecniche computazionali, tra cui ricerche di modifica curate, ricerche di database in più passaggi o ricerche tolleranti ad ampia massa 33,34,35,36,37. Sebbene la ricerca aperta abbia un grande potenziale, il suo uso è stato tipicamente ostacolato dal significativo aumento dei tempi di analisi e dalla perdita di sensibilità del rilevamento di peptidi non modificati rispetto alle ricerche limitate31,32. La diminuzione del rilevamento di corrispondenze peptidico-spettrali non modificate (PSM) è il risultato dell'aumento dei tassi di PSM falsi positivi associati a queste tecniche, che richiede un maggiore filtraggio rigoroso per mantenere i tassi di falsa scoperta (FDR) desiderati)33,34,35,36,37 . Recentemente, sono stati resi disponibili diversi strumenti che migliorano significativamente l'accessibilità della ricerca aperta, tra cui Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 e MSFragger21,41. Questi strumenti consentono la robusta identificazione degli eventi di glicosilazione riducendo significativamente i tempi di analisi e implementando approcci per gestire composizioni glicane eterogenee.
Questo articolo presenta un metodo semplificato per l'identificazione dei glicopeptidi batterici mediante ricerca aperta, utilizzando come modello il patogeno nosocomiale Gram-negativo, Acinetobacter baumannii. A. baumannii possiede un sistema di glicosilazione legato all'O conservato responsabile della modifica di più substrati proteici, noto come sistema di glicosilazione della proteina PglL 42,43,44. Mentre proteine simili sono mirate per la glicosilazione tra ceppi, il sistema di glicosilazione PglL è altamente variabile a causa della biosintesi del glicano utilizzato per la glicosilazione proteica derivata dal locus della capsula (noto come K-locus)44,45,46. Ciò si traduce in diversi glicani (noti anche come unità K), derivati da unità K polimerizzate singole o limitate, aggiunti ai substrati proteici 30,44,46. All'interno di questo lavoro, l'uso dello strumento di ricerca aperto, MSfragger, all'interno del software FragPipe, viene utilizzato per identificare i glicani attraverso i ceppi di A. baumannii. Combinando la ricerca aperta e la cura manuale, è possibile intraprendere "ricerche focalizzate sui glicani" per migliorare ulteriormente l'identificazione dei glicopeptidi batterici. Insieme, questo approccio di identificazione in più fasi consente l'identificazione di glicopeptidi senza una vasta esperienza nella caratterizzazione di nuovi eventi di glicosilazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>14 G Kel-F Hub point style 3</td>
			<td>Hamilton company</td>
			<td>hanc90514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Chloroacetamide</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>C0267-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide (28%)</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>338818-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Reagent A</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Reagent B</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C8 Empore SPE</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>66882-U</td>
			<td>An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>5.33002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>650447-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/4058/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate)</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>66886-U</td>
			<td>An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2232000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>
			<td>252859-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C protease mixture</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum concentrator</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7810040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZIC-HILIC material</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1504580001</td>
			<td>Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the application of open searching-based approaches for the identification of acinetobacter baumannii o-linked glycopeptides

La glicosilazione proteica è sempre più riconosciuta come una modifica comune all'interno degli organismi batterici, contribuendo alla fisiologia procariotica e all'infettività ottimale delle specie patogene. A causa di ciò, vi è un crescente interesse per la caratterizzazione della glicosilazione batterica e la necessità di strumenti analitici ad alto rendimento per identificare questi eventi. Sebbene la proteomica bottom-up consenta prontamente la generazione di ricchi dati glicopeptidici, l'ampiezza e la diversità dei glicani osservati nelle specie procariotiche rendono estremamente difficile l'identificazione degli eventi di glicosilazione batterica.
Tradizionalmente, la determinazione manuale delle composizioni glicani all'interno di set di dati proteomici batterici ha reso questa analisi in gran parte su misura limitata agli esperti specifici del campo. Recentemente, gli approcci aperti basati sulla ricerca sono emersi come una potente alternativa per l'identificazione di modifiche sconosciute. Analizzando la frequenza delle modifiche uniche osservate sulle sequenze peptidiche, le tecniche di ricerca aperta consentono l'identificazione di glicani comuni attaccati ai peptidi all'interno di campioni complessi. Questo articolo presenta un flusso di lavoro semplificato per l'interpretazione e l'analisi dei dati glicoproteomici, dimostrando come le tecniche di ricerca aperta possono essere utilizzate per identificare i glicopeptidi batterici senza una precedente conoscenza delle composizioni glicaniche.
Utilizzando questo approccio, i glicopeptidi all'interno dei campioni possono essere rapidamente identificati per comprendere le differenze di glicosilazione. Utilizzando Acinetobacter baumannii come modello, questi approcci consentono il confronto delle composizioni glicaniche tra ceppi e l'identificazione di nuove glicoproteine. Nel complesso, questo lavoro dimostra la versatilità delle tecniche di ricerca di database aperti per l'identificazione della glicosilazione batterica, rendendo la caratterizzazione di questi glicoproteomi altamente diversi più facile che mai.

Per illustrare l'utilità della ricerca aperta per l'analisi dei glicopeptidi batterici, è stata valutata la diversità chimica dei glicani legati all'O all'interno di tre ceppi di A. baumannii-AB307-0294, ACICU e D1279779-. I glicoproteomi legati all'O sono altamente variabili tra i ceppi di A. baumannii poiché i glicani utilizzati per la glicosilazione derivano dai loci della capsula altamente variabili 44,45,46....

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The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

La ricerca aperta consente l'identificazione di glicopeptidi decorati con composizioni di glicani precedentemente sconosciute. All'interno di questo articolo, viene presentato un approccio semplificato per intraprendere la ricerca aperta e le successive ricerche di glicopeptidi focalizzate sul glicano per campioni batterici utilizzando Acinetobacter baumannii come modello.

L'applicazione di approcci aperti basati sulla ricerca per l'identificazione di glicopeptidi legati all'O di Acinetobacter baumannii

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

Questo protocollo semplifica l'identificazione degli eptidi batterici, consentendo ai ricercatori di identificare nuovi eventi di glicosilazione, nonché le differenze nei glicani utilizzati per la glicosilazione tra i ceppi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli esperti non di glicosilazione di identificare potenziali eventi di glicosilazione in campioni di proteoma batterico. La ricerca aperta è un approccio generalmente applicabile che può essere utilizzato per l'identificazione di una serie di modifiche, non solo la glicosilazione, e può essere applicato a qualsiasi campione di proteoma.Per preparare le punte di estrazione stop-and-go STB-RPS, utilizzare un ago smussato calibro 14 per asportare tre dischi STB-RPS da una membrana STB-RPS da 47 millimetri quadrati per legare 50 microgrammi di peptide. Per quantità maggiori di peptidi, aumentare il numero di dischi di conseguenza. Prima di utilizzare le punte dello stadio SDB-RPS, lavare le punte aggiungendo 150 microlitri di acetonitrile al 100% e ruotando il tampone mediante centrifugazione o applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.Quindi, lavare le punte con 150 microlitri di metanolo al 30% contenenti l'1% di TFA, quindi equilibrare le punte con 150 microlitri di isopropanolo al 90% contenenti l'1% di TFA. Dopo l'equilibrio, caricare i campioni di proteoma sulle punte dello stadio STB-RPS mediante centrifugazione o utilizzando una siringa. Quindi, lavare le punte con 150 microlitri di isopropanolo al 90% contenenti 1% TFA seguiti da 150 microlitri dell'1% TFA.Per eluire i peptidi dalle punte dello stadio STB-RPS, utilizzare 150 microlitri di idrossido di ammonio al 5% e acetonitrile all'80% aggiunti a una singola punta e raccogliere i campioni eluiti in singoli tubi applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa. In alternativa, se eluting tramite centrifugazione, utilizzare 150 microlitri al 5% di idrossido di ammonio in acetonitrile all'80% aggiunti a tutte le punte dello stadio e raccogliere in una piastra pulita. Asciugare i peptidi eluiti mediante centrifugazione sotto vuoto a 25 gradi Celsius.Successivamente, per arricchire i campioni di glicopeptide, preparare una cromatografia liquida di interazione idrofila zwitterionica, o ZIC-HILIC, punte di scena. Asportare un disco C8 da una membrana C8 di 470 millimetri quadrati usando un ago smussato calibro 14 e imballare il disco in una punta P-200 per creare una fritta. Quindi, aggiungere circa cinque millimetri di materiale ZIC-HILIC risospeso al 50% in acetonitrile sulla fritta applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa.Prima di utilizzare le punte, equilibrare la resina con 20 volumi di letto di tampone di eluizione ZIC-HILIC, lasciando 10 microlitri di volume sopra la resina per garantire che la resina non si asciughi. Quindi, lavare sequenzialmente la resina con 20 volumi di letto di tampone di preparazione ZIC-HILIC seguiti da 20 volumi di letto di tampone di carico o di lavaggio ZIC-HILIC. Successivamente, risospesare i peptidi digeriti ed essiccati nel tampone di carico ZIC-HILIC a una concentrazione finale di quattro microgrammi per microlitro.Vortice brevemente per un minuto per garantire che i campioni siano risospesi, quindi girali per un minuto a 2000 volte G e 25 gradi Celsius. Dopo la rotazione, caricare il campione di peptide risospeso sulla colonna ZIC-HILIC condizionata, quindi lavare la colonna tre volte con 20 volumi di letto del tampone di carico ZIC-HILIC applicando delicatamente la pressione utilizzando una siringa. Infine, eluire i glicopeptidi con 20 volumi di letto del tampone di eluizione ZIC-HILIC in un tubo da 1,5 millilitri applicando delicatamente la pressione usando una siringa, quindi asciugare l'eluente mediante centrifugazione sotto vuoto a 25 gradi Celsius.Per l'analisi LC-MS, risospesare i campioni nel tampone A * a una concentrazione finale di un microgrammo per microlitro, quindi caricare i campioni su un HPLC-UPLC accoppiato a un MS per consentire la separazione e l'identificazione dei glicopeptidi. Monitorare la raccolta dei dati MS risultante, assicurandosi che i dati vengano raccolti con i parametri desiderati. Per analizzare i campioni arricchiti di proteoma e glicopeptide, aprire FragPipe e fare clic sulla scheda Flusso di lavoro.Dal menu a discesa Flusso di lavoro, selezionare l'opzione Apri ricerca e fare clic su Aggiungi file per importare i file di dati da cercare in FragPipe. Quindi, fare clic sulla scheda Database seguita da Download per avviare il download manager per il download di database proteome da UniProt utilizzando un numero di adesione UniProt. All'interno del download manager, fare clic sull'opzione Aggiungi esche e contaminanti per incorporare proteine esca e contaminanti in questo database.Quindi, fare clic sulla scheda MSFragger, quindi nella casella Corrispondenza picco aumentare la tolleranza di massa del precursore dalton predefinito 500 a 2.000 dalton per identificare le modifiche di grandi dimensioni. Fare clic sulla scheda Esegui per definire la posizione degli output di FragPipe, quindi fare clic sul pulsante Esegui per iniziare la ricerca. Con i glicopeptidi ad alta confidenza assegnati, identificare gli ioni comunemente osservati associati ai glicani per migliorare l'identificazione dei glicopeptidi.Quindi, fare clic sulla scheda MSFragger e aggiungere le masse delta determinate dei glicani osservati nelle sezioni Modifiche variabili e Offset di massa con singole masse separate da una barra. Quindi, aggiungere le masse di frammenti associati al glicano di questi glicani nella sezione Glyco/Labile Mods di MSFragger. Infine, carica tutti i dati MS associati agli studi proteomici in repository proteomici centralizzati, come i repository PRIDE o MassIVE.La ricerca aperta del ceppo Acinetobacter baumannii AB307-0294 ha rivelato due masse delta dominanti corrispondenti a 648,25 e 692,28 dalton. La capsula ACICU è nota per essere composta da un'unità tetrasaccaridica K corrispondente a una massa prevista di 843,31 dalton. Questa struttura della capsula è coerente con la massa delta più frequentemente osservata all'interno dell'ACICU.L'analisi a ricerca aperta del ceppo D1279779 ha rivelato la presenza di masse delta multiple coerenti con i dalton 203.08, 794.31 e 1588.62. Utilizzando l'annotatore spettrale peptidico interattivo, i glicopeptidi identificati in tre ceppi di A.baumannii sono stati valutati rivelando potenziali ioni associati al glicano. Le ricerche focalizzate sul glicano hanno portato a un notevole aumento del numero totale di corrispondenze spettrali glicopeptidiche / peptidiche identificate in tutti e tre i ceppi di A.baumannii, corrispondente a un aumento del 37% di ACICU, un aumento del 117% in AB307-0294 e un aumento del 363% in D1279779.Per i singoli eventi di SM, l'inclusione di informazioni specifiche del glicano in genere aumenta l'Hyperscore osservato, sebbene questo aumento sia altamente glicano-dipendente. Quando si esegue l'arricchimento ZIC-HILIC, assicurarsi che la resina rimanga sempre bagnata, poiché la perdita di solvente può compromettere l'isolamento dei glicopeptidi. I dati sulle differenze nella glicosilazione possono essere utilizzati per informare gli studi di mutagenesi o identificare le classi geniche responsabili della biosintesi dei glicani.Utilizzando la ricerca in database aperto, abbiamo iniziato a caratterizzare la diversità dei glicani tra i generi batterici. Ciò ha dimostrato che la glicosilazione batterica è sia più comune che molto più diversificata di quanto pensassimo una volta.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

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Identificazione di acidi grassi a<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Ricerca

Biochimica

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

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Una proteina metodo di preparazione per l&#39;high-throughput identificazione di proteine ​​che interagiscono con un cofattore nucleare Utilizzando LC-MS / MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

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Fluid flow is an important environmental stimulus that controls many physiological and pathological processes, such as fluid flow-induced vasodilation. ...

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Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

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Effettuare misurazioni FRET a singola molecola precise e accurate utilizzando l'smfBox open source

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