Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier Hort Pome, Hort Stone et le programme Technologie et ressources humaines pour l’industrie (THRIP: TP14062571871) pour le financement du projet.
ORCID: Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Source des souches fongiques
<ol><li>Utiliser des souches fongiques isolées sud-africaines de M. pinghaense 5 HEID (numéro d’acquisition GenBank : MT367414/MT895630) et M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), collectées dans des vergers de pommiers de la province du Cap-Occidental, en Afrique du Sud.</li>
	<li>Cultiver des cultures de chaque isolat d’EPF sur 60 g de milieu de gélose au dextrose Sabouraud, complété par 1 g d’extrait de levure (SDAY) et 10 μL d...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. 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G., Rajalakshmi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+media+for+mass+multiplication+of+entomopathogenic+fungi.">Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi.</a> Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).</li><li>Roberts, D. W., Humber, R. A., Cole, G. T., Kendrick, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomogenous+fungi.">Entomogenous fungi.</a> Biology of Conidial Fungi. , 201-236 (1981).</li><li>Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. 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Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+mycoinsecticides.">Formulation of mycoinsecticides.</a> Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).</li></ol>

L’intégration réussie d’agents microbiens pour la lutte biologique contre d’importants insectes nuisibles agricoles dans un agroécosystème dépend à la fois du succès et de la facilité de production de masse des entomopathogènes comme première étape dans des conditions de laboratoire. La production en série d’EPF est importante pour l’application à grande échelle et la disponibilité des produits EPF pour les programmes de lutte intégrée utilisant la lutte biologique<...

Les champignons entomopathogènes (FPE) ont gagné en importance en tant qu’agents de protection des cultures dans la lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles importants 1,2. Les entomopathogènes, qui se produisent naturellement dans le sol, provoquent des épizooties dans les populations de diverses espèces de ravageurs3. Les espèces de FPE sont spécifiques à l’hôte et présentent relativement peu de risques en termes d’attaque d’espèces non ciblées, et elles ne sont pas toxiques pour l’environnement4. Les FPE ont un mécanisme unique pour envahir leur hôte, ainsi que pour se propager et persister dans leur environnement immédiat1. Ils attaquent l’hôte principalement par le biais de spores asexuées qui s’attachent et pénètrent dans la cuticule de l’hôte pour envahir et proliférer dans l’hémocène hôte. L’hôte finit par mourir en raison de l’épuisement des nutriments de l’hémolymphe ou à la suite de la toxémie causée par les métabolites toxiques libérés par le champignon. Après la mort, dans des conditions environnementales idéales, le champignon émerge sur la surface externe (mycose manifeste) du cadavre hôte 5,6.
Les préoccupations croissantes concernant les effets négatifs des résidus chimiques sur la santé humaine, la pollution de l’environnement et le développement de la résistance aux ravageurs ont conduit à la campagne mondiale visant à réduire les apports d’insecticides à base de produits chimiques et à trouver des stratégies alternatives, nouvelles et durables pour la protection des cultures et la lutte antiparasitaire 6,7,8 . Cela a permis de mettre au point des insecticides à base de microbes à utiliser dans les programmes de lutte intégrée contre les ravageurs (LAI), qui sont des stratégies plus favorables sur le plan écologique que la lutte chimique conventionnelle 3,8.
Pour mettre au point un agent de lutte microbienne efficace pour un ravageur agricole, un organisme approprié doit d’abord être isolé, caractérisé, identifié et sa pathogénicité pour l’organisme nuisible cible confirmée. Cependant, une méthode simple et rentable pour la production à grande échelle de l’agent microbien est nécessaire pour produire un produit viable destiné à être utilisé dans les programmes de lutte biologique 9,10,11,12,13. La production en masse de quantités substantielles d’entomopathogènes de bonne qualité dépend de la souche microbienne, de l’environnement, du ravageur cible, de la formulation, du marché, de la stratégie d’application et du produit final souhaité 14,15,16. L’EPF peut être produit en série en utilisant la fermentation de substrat liquide pour produire des blastospores ou le processus de fermentation de substrat solide pour produire des conidiesaériennes 6,17,18. Cependant, le processus de production et de formulation en masse des entomopathogènes influence directement la virulence, le coût, la durée de conservation et l’efficacité sur le terrain du produit final. Pour une utilisation réussie dans la lutte intégrée, le processus de production des entomopathogènes doit être facile à exécuter, nécessiter un minimum de travail, produire une concentration à haut rendement de propagules virulentes, viables et persistantes et être peu coûteux 4,13,14,16.
Comprendre les besoins nutritionnels des entomopathogènes est important pour la culture de masse avec toutes les méthodes de culture 4,12. Les composants nutritionnels du milieu de production ont un impact significatif sur les attributs des propagules résultantes, y compris l’efficacité du biocontrôle, le rendement, la tolérance à la dessiccation et la persistance 8,19,20,21. L’optimisation des procédures de production est conçue pour répondre à ces facteurs22. Pour l’EPF, les principales exigences pour une bonne croissance, une sporulation et une production de masse de conidies fongiques sont une humidité adéquate, une température de croissance optimale, un pH, un échange gazeux de CO2 et d’O2 et une nutrition, y compris de bonnes sources de phosphore, de glucides, de carbone et d’azote18.
Jaronski et Jackson18 décrivent la méthode de fermentation du substrat solide comme la méthode d’approximation la plus efficace et la plus proche du processus naturel de production d’EPF par rapport à la méthode de fermentation du substrat liquide car, dans des conditions naturelles, le conidium fongique est porté sur des structures érigées solides, comme la surface des cadavres d’insectes. Les produits agricoles et les sous-produits contenant de l’amidon sont principalement utilisés pour la production de masse de champignons hypocréagènes, car les champignons décomposent facilement l’amidon par la sécrétion d’enzymes hydrolytiques hautement concentrées à partir de leurs extrémités hyphales, pour pénétrer dans la substance solide et pour accéder aux nutriments présents dans la substance 11,17,18,23 . Les produits céréaliers répondent également aux besoins d’une production saine de biomasse car, lorsqu’ils sont hydratés et stérilisés, les substrats peuvent absorber d’autres nutriments de tout milieu liquide 16,18,24.
Auparavant, plusieurs études ont tenté de cultiver en masse des espèces d’EPF comme Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas et une partie du Metarhizium anisopliae (Metschn.) Isolats complexes d’espèces de sorokine sur divers substrats 16,23,24. Ces isolats produits en série et développés commercialement comprennent Green Muscle® (souche IMI 330189), développé à partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (souche Meta 69 ICIPE69), et Real Metarhizium 69 (L9281), développé à partir de M. anisopliae, et Broadband® (souche PPRI 5339) et Eco-Bb®, développé à partir de B. bassiana25,26 . Cependant, des tentatives limitées ont été faites pour la culture de masse Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber et Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Ces deux isolats ont été sélectionnés dans une étude précédente comme les plus efficaces pour la lutte contre la cochenille, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Par conséquent, la présente étude visait à formuler et à produire en masse un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes des isolats locaux de M. robertsii et M. pinghaense pour une application commerciale contre les insectes nuisibles. La méthode de fermentation du substrat solide a été utilisée pour produire en masse les conidies fongiques pour les deux isolats d’EPF. Deux méthodes d’inoculation EPF, utilisant des suspensions conidiales et la culture fongique liquide de blastospores, ont été utilisées pour inoculer les substrats solides.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

Les champignons entomopathogènes du complexe d’espèces Metarhizium anisopliae ont gagné en importance en tant qu’agents de lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles. L’augmentation de la résistance des ravageurs aux insecticides chimiques, les préoccupations croissantes concernant les effets négatifs des insecticides sur la santé humaine et la pollution de l’environnement par les pesticides ont conduit à une campagne mondiale pour trouver de nouvelles stratégies durables pour la protection des cultures et la lutte antiparasitaire. Auparavant, des tentatives de culture de masse d’espèces de champignons entomopathogènes (EPF) telles que Beauveria bassiana ont été menées. Cependant, seules des tentatives limitées ont été menées pour la culture de masse Metarhizium robertsii et M. pinghaense pour une utilisation contre les insectes nuisibles. Cette étude visait à produire en masse un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes d’isolats sud-africains de M. robertsii et de M. pinghaense pour une application commerciale. Trois produits céréaliers agricoles, l’avoine en flocons, l’orge en flocons et le riz, ont été utilisés comme substrats de fermentation solide epf. Deux méthodes d’inoculation, les suspensions conidiales et la culture fongique liquide de blastospores ont été utilisées pour inoculer les substrats solides. L’inoculation à l’aide de suspensions conidiales s’est avérée relativement moins efficace, car des niveaux accrus de contamination ont été observés sur les substrats solides par rapport à l’utilisation de la méthode d’inoculation blastospore. L’avoine en flocons n’a pas été un substrat de croissance approprié pour M. robertsii et M. pinghaense, car aucune conidie sèche n’a été récoltée à partir du substrat. Il a été constaté que l’orge en flocons favorisait la production de conidies M. robertsii par rapport à celle de M. pinghaense, et une moyenne de 1,83 g ± 1,47 g de conidies sèches de M. robertsii et zéro gramme de conidies M. pinghaense ont été récoltés sur le substrat. Il a été constaté que les grains de riz favorisaient la production de masse conidiale d’isolats de M. pinghaense et de M. robertsii , avec une moyenne de 8,2 g ± 4,38 g et 6 g ± 2 g récoltés sur le substrat, respectivement.

Une diminution de la masse de teneur des cultures sur le riz pour le M. pinghaense et le M. robertsii a été observée au fil du temps pendant la phase de séchage des cultures fongiques, sans ou peu de changement observé dans la masse une fois les cultures sèches (figure 5). La poudre de conidies fongiques sèches récoltées du M. pinghaense et du M. robertsii est illustrée à la figure 6.
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Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Les champignons entomopathogènes ont gagné en importance en tant qu’agents de lutte biologique contre les insectes nuisibles agricoles. Dans cette étude, la production en masse d’un nombre suffisant de propagules infectieuses résilientes d’isolats sud-africains de Metarhizium robertsii et de M. pinghaense pour une application commerciale contre les insectes nuisibles a été menée avec succès en utilisant des produits céréaliers agricoles.

Production de masse de champignons entomopathogènes, Metarhizium robertsii et Metarhizium pinghaense, pour une application commerciale contre les insectes nuisibles

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Cette méthode fournit de nouvelles informations sur la façon de produire en masse des conidies infectieuses de champignons entomopathogènes pour lutter contre les insectes nuisibles importants dans les agro-écosystèmes commerciaux, compte tenu de la situation actuelle où la plupart des insecticides sont progressivement éliminés en raison de préoccupations concernant leur effet toxique sur l’environnement et la santé humaine. La technique décrit la méthode utilisée pour assurer le rendement optimal des conidies EPF lors de la production de masse. La méthode est utile pour la lutte intégrée contre les ravageurs et la lutte biologique en fournissant un aperçu de l’efficacité des conidies produites en masse pour la gestion à grande échelle des insectes nuisibles résistants aux insecticides nuisibles dans les agro-écosystèmes.Cette procédure a été développée et démontrée par le Dr Letodi Luki Mathulwe, le Dr Nomakholwa Faith Stokwe et le professeur Antoinette Paula Malan. Chauffez un litre d’eau distillée et éteignez le feu avant d’atteindre le point d’ébullition. Maintenant, ajoutez 30 grammes de glucose, quatre grammes de phosphate de potassium dibasique, 20 grammes d’extrait de levure, 15 millilitres de liqueur de maïs et portez le contenu à ébullition douce pendant deux à trois minutes.Versez un total de 100 millilitres du milieu dans neuf flacons différents de 250 millilitres. Placez un bouchon de coton sur chaque flacon et recouvrez le coton avec du papier d’aluminium comme bouchon. Autoclavez le milieu dans les flacons pendant 55 minutes à 121 degrés Celsius.Plus tard, laissez refroidir le milieu dans les flacons et ajoutez 10 milligrammes par millilitre de streptomycine au milieu dans chaque flacon. Recueillir deux à trois boucles bactériennes de conidies fongiques dans des plaques de culture fongiques vieilles de deux à trois semaines pour les deux isolats de FPE. Transférer les conidies fongiques dans chaque 100 millilitres de milieu liquide dans les flacons de 250 millilitres dans des conditions stériles et sceller les flacons.Incuber les flacons de culture liquide à environ 25 degrés Celsius sur un agitateur orbital à 140 tr / min pendant trois jours et cesser l’incubation une fois que les cultures montrent des signes de turbidité élevée avec la croissance fongique des blastospores. Pour détecter toute contamination bactérienne possible des cultures, prélever un échantillon de 100 microlitres dans chaque flacon de culture liquide après 24 heures d’incubation et plaquer sur trois plaques SDA par isolat. Incuber les plaques pendant 48 heures à une température contrôlée de plus ou moins 25 degrés Celsius.Utilisez un petit tuyau de déchets de polychlorure de vinyle pour créer un goulot pour le sac de fermentation à l’extrémité ouverte du sac d’autoclave et utilisez du ruban adhésif pour fixer le tuyau. Fermez le tuyau avec un bouchon de coton stérile pour permettre un échange de gaz suffisant pendant la fermentation. Utilisez du riz blanc à grains longs étuvé comme substrat solide pour les blastospores de Metarhizium pinghaense et de Metarhizium robertsii.Pour chaque sac de fermentation, ajoutez un kilogramme de riz et 300 millilitres d’eau distillée stérile. Mélangez délicatement le contenu des sachets de fermentation. Placez-les dans des sacs d’autoclave extérieurs en position verticale et autoclavez à 121 degrés Celsius pendant 55 minutes.Après l’autoclavage, laissez les substrats refroidir pendant environ 45 minutes dans des conditions stériles. Retirer la fermeture de chacune des fioles de culture liquide de Metarhizium pinghaense et de Metarhizium robertsii sous un écoulement laminaire et enflammer le bord de chaque fiole pendant 10 secondes. Versez 100 millilitres de cultures liquides dans les sacs de fermentation en retirant les bouchons de coton de leur cou.Replacez les bouchons de coton et couvrez le haut du cou du sac avec du papier chirurgical fixé avec un élastique. Tournez la partie supérieure du sac et mélangez le contenu du sac en secouant et en manipulant le substrat par massage. Incuber les sacs à environ 25 degrés Celsius en aplatissant le substrat dans les sacs pour éviter la formation de lits épais.Deux à trois jours après l’inoculation et l’incubation, lorsque la croissance mycélienne visible et la liaison du substrat par le champignon se sont produites, briser le substrat dans les sacs de fermentation en massant le contenu des sacs. Après la fermentation, transférer les cultures sporulées dans des sacs en papier brun de 26 à 30 kilogrammes et sécher les cultures fongiques pendant 10 à 12 jours avant leur utilisation dans les essais. Pour améliorer la résistance à la traction des sacs en papier, coupez horizontalement 1/3 de la partie supérieure du sac et tapissez le fond du sac.Émietter doucement le substrat dans chaque sac de fermentation. Coupez le coin de chaque sac et transférez lentement toute la culture dans les sacs en papier à travers l’espace laissé par le coin coupé. Étiquetez chaque sac en papier, pliez-le deux fois sur l’extrémité supérieure de chaque sac et fermez-le avec des agrafes pour créer une structure de tente triangulaire.Placez les sacs sur des séchoirs en fil de fer pour permettre un séchage correct et uniforme à une température contrôlée d’environ 25 degrés Celsius et une faible humidité de 30 à 40% Récoltez les conidies fongiques des cultures à l’aide de trois tamis imbriqués montés sur une casserole de collecte. Chargez lentement l’échantillon de culture sèche sur le maillage ETS numéro 35 et le tamis. Placez un couvercle sur le tamis pour éviter la libération de conidies fongiques dans l’air.Ajouter 10 à 12 billes de verre aux tamis pour faciliter le passage des conidies fongiques à travers les tamis à mailles et éviter la rétention des conidies dans le tamis, ce qui peut réduire la récupération des spores. Scotchez et scellez les joints du tamis à l’aide de ruban adhésif électrique. Placez les tamis sur un agitateur vibrant équipé d’un tampon collant pour fixer le bac de collecte et les tamis pendant 20 à 25 minutes à un mouvement de 560 à 640 vibrations par minute.Retirez les tamis d’essai de la casserole de collecte, collectez les conidies et rangez les conidies collectées dans des sacs à fermeture à glissière étanches à l’air et imperméables à l’eau pour un stockage à long terme. Une moyenne d’environ 1,83 gramme de conidies sèches de Metarhizium robertsii a été récoltée sur le substrat d’orge en flocons, tandis qu’aucun Metarhizium pinghaense n’a été récolté sur le substrat. Aucune conidie fongique sèche n’a été récoltée sur le substrat d’avoine en flocons pour les deux espèces de Metarhizium.Une différence significative a été observée entre les deux espèces de Metarhizium dans les conidies moyennes estimées par gramme récolté à partir des grains de riz. Metarhizium robertsii avait un nombre moyen de conidies par gramme légèrement plus élevé que Metarhizium pinghaense. Aucune différence significative n’a été observée entre les deux espèces de Metarhizium dans le nombre estimé de conidies présentes sur le substrat de riz usé.Cependant, Metarhizium pinghaense avait des conidies légèrement plus élevées sur le substrat de riz que Metarhizium robertsii Aucune différence significative n’est estimée chez les deux espèces de Metarhizium dans leur rendement global en conidies obtenues à partir des cultures de substrat de riz. Cependant, Metarhizium pinghaense a produit un rendement de conidies légèrement plus élevé que Metarhizium robertsii, qui a produit un rendement de conidiale inférieur. La partie difficile de cette technique est la contamination du substrat par inoculation avec un inoculum de blastospores contaminé.Ainsi, assurez-vous toujours de la stérilité tout en travaillant. Cette démonstration aide les élèves à reproduire efficacement la technique sans erreurs maladroites pouvant entraîner la fin de l’ensemble du processus.

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

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The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

Évaluation de l’effet aphidicide des champignons entomopathogènes contre l’insecte parthénogénétique, le puceron de la moutarde, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...