Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Die Autoren danken Hort Pome, Hort Stone und dem Technology and Human Resources for Industry Programme (THRIP: TP14062571871) für die Finanzierung des Projekts.
ORCID: Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Quelle von Pilzstämmen
<ol><li>Verwenden Sie südafrikanische isolierte Pilzstämme von M. pinghaense 5 HEID (GenBank Accession number: MT367414/MT895630) und M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), die aus Apfelplantagen in der Provinz Westkap, Südafrika, gesammelt wurden.</li>
	<li>Züchten Sie Kulturen jedes EPF-Isolats auf 60 g Sabouraud-Dextrose-Agar-Medium, ergänzt mit 1 g Hefeextrakt (SDAY) und 10 μL Streptomycin. HINWEIS: Inkubieren Sie EPF-Kulturen bei ein...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+biology+and+control+of+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae),+with+special+reference+to+biological+control+using+entomopathogenic+fungi+and+nematodes.">A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes.</a> African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).</li><li>Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production,+yield,+quality,+formulation+and+efficacy+of+entomopathogenic+Metarhizium+anisopliae+conidia.">Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia.</a> Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).</li><li>Banu, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+suitable+medium+for+mass+multiplication+of+entomofungal+pathogens.">Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens.</a> Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).</li><li>Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rice+by-products,+incubation+time,+and+photoperiod+for+solid+state+mass+multiplication+of+the+biocontrol+agents+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).</li><li>Price, R. 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Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+used+for+entomopathogenic+fungi:+Hypocreales.">Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).</li><li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+carbon+&amp;+nitrogen+sources+on+the+Trichoderma+viride+(Biofungicide)+and+Beauveria+bassiana+(entomopathogenic+fungi).">Impact of carbon &amp; nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi).</a> European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).</li><li>Burges, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+mycoinsecticides.">Formulation of mycoinsecticides.</a> Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).</li></ol>

Die erfolgreiche Integration mikrobieller Wirkstoffe zur biologischen Bekämpfung wichtiger landwirtschaftlicher Insektenschädlinge in ein Agrarökosystem hängt sowohl vom Erfolg als auch von der Leichtigkeit der Massenproduktion der Entomopathogene als erster Schritt unter Laborbedingungen ab. Die Massenproduktion von EPF ist wichtig für die großtechnische Anwendung und Verfügbarkeit von EPF-Produkten für IPM-Programme unter biologischer Kontrolle 9,10,11,12,13....

Entomopathogene Pilze (EPF) haben als Pflanzenschutzmittel bei der biologischen Bekämpfung wichtiger landwirtschaftlicher Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen 1,2. Die Entomopathogene, die natürlicherweise im Boden vorkommen, verursachen Tierseuchen in den Populationen verschiedener Schädlingsarten3. Die Arten von EPF sind wirtsspezifisch und stellen relativ wenige Risiken in Bezug auf den Angriff auf Nichtzielarten dar, und sie sind ungiftig für die Umwelt4. EPF haben einen einzigartigen Mechanismus für das Eindringen in ihren Wirt sowie für die Ausbreitung und Persistenz in ihrer unmittelbaren Umgebung1. Sie greifen den Wirt hauptsächlich durch asexuelle Sporen an, die sich an die Nagelhaut des Wirts anheften und diese durchdringen, um in den Hämocoel des Wirts einzudringen und sich zu vermehren. Der Wirt stirbt schließlich aufgrund der Erschöpfung der Hämolymph-Nährstoffe oder als Folge der Toxämie, die durch die toxischen Metaboliten verursacht wird, die vom Pilz freigesetzt werden. Nach dem Tod tritt der Pilz unter idealen Umweltbedingungen auf der äußeren Oberfläche (offene Mykose) des Wirtskadaversaus 5,6.
Wachsende Besorgnis über die negativen Auswirkungen chemischer Rückstände auf die menschliche Gesundheit, Umweltverschmutzung und die Entwicklung von Schädlingsresistenzen haben zu dem globalen Bestreben geführt, den Einsatz von Insektiziden auf chemischer Basis zu reduzieren und alternative, neuartige und nachhaltige Strategien für Pflanzenschutz und Schädlingsbekämpfungzu finden 6,7,8 . Dies hat Möglichkeiten geschaffen, mikrobielle Insektizide für den Einsatz in Programmen für den integrierten Pflanzenschutz (IPM) zu entwickeln, die ökologisch günstigere Strategien sind als die herkömmliche chemische Kontrolle 3,8.
Um ein erfolgreiches mikrobielles Bekämpfungsmittel für einen landwirtschaftlichen Schädling zu entwickeln, muss zunächst ein geeigneter Organismus isoliert, charakterisiert, identifiziert und seine Pathogenität für den Zielschädling bestätigt werden. Es ist jedoch eine einfache und kostengünstige Methode für die großtechnische Produktion des mikrobiellen Agens erforderlich, um ein lebensfähiges Produkt für die Verwendung in biologischen Bekämpfungsprogrammen 9,10,11,12,13 herzustellen. Die Massenproduktion erheblicher Mengen hochwertiger Entomopathogene hängt vom mikrobiellen Stamm, der Umwelt, dem Zielschädling, der Formulierung, dem Markt, der Anwendungsstrategie und dem gewünschten Endproduktab 14,15,16. EPF kann unter Verwendung von flüssiger Substratfermentation zur Herstellung von Blastosporen oder des festen Substratfermentationsprozesses zur Herstellung von Luftkonidien 6,17,18 in Massenproduktion hergestellt werden. Der Massenproduktions- und Formulierungsprozess von Entomopathogenen beeinflusst jedoch direkt die Virulenz, die Kosten, die Haltbarkeit und die Feldwirksamkeit des Endprodukts. Für eine erfolgreiche Verwendung in IPM muss der Produktionsprozess der Entomopathogene einfach zu bedienen sein, minimale Arbeit erfordern, eine hohe Ausbeute an virulenten, lebensfähigen und persistenten Vermehrungen erzeugen und kostengünstigsein 4,13,14,16.
Das Verständnis des Nährstoffbedarfs von Entomopathogenen ist wichtig für die Massenkultivierung mit allen Anbaumethoden 4,12. Die Nährstoffkomponenten des Produktionsmediums haben einen signifikanten Einfluss auf die Eigenschaften der resultierenden Vermehrungen, einschließlich der Wirksamkeit der Biokontrolle, des Ertrags, der Austrocknungstoleranz und der Persistenz 8,19,20,21. Die Optimierung von Produktionsabläufen ist darauf ausgerichtet, solche Faktoren anzugehen22. Für EPF sind die Hauptanforderungen für ein gutes Wachstum, Sporulation und Massenproduktion von Pilzkonidien ausreichende Feuchtigkeit, optimale Wachstumstemperatur, pH-Wert, Gasaustausch von CO2 undO2 und Ernährung, einschließlich guter Phosphor-, Kohlenhydrat-, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen18.
Jaronski und Jackson18 beschreiben die feste Substratfermentationsmethode als die effizienteste und engste Annäherungsmethode an den natürlichen Prozess zur EPF-Produktion im Vergleich zur Fermentationsmethode für flüssige Substrate, da das Pilzkonidium unter natürlichen Bedingungen auf festen aufrechten Strukturen wie der Oberfläche von Insektenkadavern getragen wird. Landwirtschaftliche Produkte und Nebenprodukte, die Stärke enthalten, werden hauptsächlich für die Massenproduktion von hypokrealischen Pilzen verwendet, da die Pilze Stärke leicht durch Sekretion hochkonzentrierter hydrolytischer Enzyme aus ihren Hyphenspitzen zersetzen, um in die feste Substanz einzudringen und auf die in der Substanz vorhandenen Nährstoffe zuzugreifen11,17,18,23 . Die Getreideprodukte liefern auch die Voraussetzungen für eine gesunde Biomasseproduktion, denn wenn sie hydratisiert und sterilisiert sind, können die Substrate weitere Nährstoffe aus jedem flüssigen Medium aufnehmen16,18,24.
Zuvor wurde in mehreren Studien versucht, EPF-Arten wie Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas und einige der Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin-Spezies-Komplex-Isolate auf verschiedenen Substraten 16,23,24. Zu diesen massenproduzierten und kommerziell entwickelten Isolaten gehören Green Muscle® (Stamm IMI 330189), entwickelt aus M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner), J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 Stamm ICIPE69) und Real Metarhizium 69 (L9281), entwickelt aus M. anisopliae, und Broadband® (Stamm PPRI 5339) und Eco-Bb®, entwickelt aus B. bassiana 25,26 . Es wurden jedoch begrenzte Versuche unternommen, Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber und Metarhizium pinghaense Chen & Guo in Massenkultur zu bringen. Diese beiden Isolate wurden in einer früheren Studie als die wirksamsten für die Bekämpfung der Wollläuse ausgewählt, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Daher zielte die aktuelle Studie darauf ab, eine ausreichende Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Vermehrungen der lokalen Isolate von M. robertsii und M. pinghaense für die kommerzielle Anwendung gegen Insektenschädlinge zu formulieren und in Massenproduktion zu produzieren. Die Festsubstratfermentationsmethode wurde verwendet, um die Pilzkonidien für beide EPF-Isolate in Massenproduktion herzustellen. Zwei EPF-Impfmethoden, bei denen konidielle Suspensionen und die flüssige Pilzkultur von Blastosporen verwendet wurden, wurden verwendet, um die festen Substrate zu impfen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

Entomopathogene Pilze des Artenkomplexes Metarhizium anisopliae haben als biologische Bekämpfungsmittel für landwirtschaftliche Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen. Die Zunahme der Schädlingsresistenz gegen chemische Insektizide, die wachsende Besorgnis über die negativen Auswirkungen von Insektiziden auf die menschliche Gesundheit und die Umweltverschmutzung durch Pestizide haben zu einem globalen Bestreben geführt, neuartige nachhaltige Strategien für den Pflanzenschutz und die Schädlingsbekämpfung zu finden. Zuvor wurden Versuche unternommen, solche entomopathogenen Pilze (EPF) -Arten wie Beauveria bassiana in Massen zu kultivieren. Es wurden jedoch nur begrenzte Versuche unternommen, Metarhizium robertsii und M. pinghaense zur Verwendung gegen Insektenschädlinge zu kultivieren. Diese Studie zielte darauf ab, eine ausreichende Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Propagulationen südafrikanischer Isolate von M. robertsii und M. pinghaense für kommerzielle Anwendungen in Massenproduktion herzustellen. Drei landwirtschaftliche Getreideprodukte, Haferflocken, Gerstenflocken und Reis, wurden als feste EPF-Fermentationssubstrate verwendet. Zwei Impfmethoden, konidielle Suspensionen und die flüssige Pilzkultur von Blastosporen, wurden verwendet, um die festen Substrate zu impfen. Es wurde beobachtet, dass die Impfung mit konidiellen Suspensionen relativ weniger wirksam ist, da auf den festen Substraten im Vergleich zur Verwendung der Blastosporen-Impfmethode erhöhte Kontaminationsgrade beobachtet wurden. Haferflocken erwiesen sich sowohl für M. robertsii als auch für M. pinghaense als geeignetes Wachstumssubstrat, da keine trockenen Konidien aus dem Substrat geerntet wurden. Es wurde festgestellt, dass Gerstenflocken die Produktion von M. robertsii-Konidien gegenüber der von M. pinghaense begünstigten, und durchschnittlich 1,83 g ± 1,47 g trockene M. robertsii-Konidien und null Gramm M. pinghaense-Konidien wurden aus dem Substrat geerntet. Es wurde festgestellt, dass Reiskörner die konidielle Massenproduktion von M. pinghaense- und M. robertsii-Isolaten begünstigen, wobei durchschnittlich 8,2 g ± 4,38 g bzw. 6 g ± 2 g aus dem Substrat geerntet wurden.

Ein Rückgang der Inhaltsmasse der Kulturen auf Reis sowohl für die M. pinghaense als auch für die M. robertsii wurde im Laufe der Zeit während der Trocknungsphase der Pilzkulturen beobachtet, wobei keine oder nur eine geringe Veränderung in der Masse beobachtet wurde, sobald die Kulturen trocken waren (Abbildung 5). Das geerntete trockene Pilzkonidienpulver sowohl der M. pinghaense als auch der M. robertsii ist in Abbildung 6</str...

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Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopathogene Pilze haben als biologische Bekämpfungsmittel für landwirtschaftliche Insektenschädlinge an Bedeutung gewonnen. In dieser Studie wurde die Massenproduktion einer ausreichenden Anzahl widerstandsfähiger infektiöser Vermehrungen südafrikanischer Isolate von Metarhizium robertsii und M. pinghaense für die kommerzielle Anwendung gegen Insektenschädlinge erfolgreich unter Verwendung von landwirtschaftlichen Getreideprodukten durchgeführt.

Massenproduktion von entomopathogenen Pilzen, Metarhizium robertsii und Metarhizium pinghaense, zur kommerziellen Anwendung gegen Insektenschädlinge

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Diese Methode liefert neue Informationen darüber, wie infektiöse Konidien entomopathogener Pilze in Massenproduktion hergestellt werden können, um wichtige Insektenschädlinge in kommerziellen Agrarökosystemen zu bekämpfen, angesichts der aktuellen Situation, in der die meisten Insektizide aufgrund von Bedenken hinsichtlich ihrer toxischen Wirkung auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit auslaufen. Die Technik beschreibt das Verfahren, mit dem die optimale Ausbeute von EPF-Konidien während der Massenproduktion sichergestellt wird. Die Methode ist hilfreich für die integrierte Schädlingsbekämpfung und biologische Bekämpfung, indem sie Einblicke in die Wirksamkeit von massenproduzierten Konidien für das großflächige Management von schädlichen Insektizidresistenz-Insektenschädlingen in den Agrarökosystemen bietet.Dieses Verfahren wurde von Dr. Letodi Luki Mathulwe, Dr. Nomakholwa Faith Stokwe und Professor Antoinette Paula Malan entwickelt und demonstriert. Erhitzen Sie einen Liter destilliertes Wasser und schalten Sie die Hitze aus, bevor Sie den Siedepunkt erreichen. Fügen Sie nun 30 Gramm Glukose, vier Gramm Kaliumphosphat dibasisch, 20 Gramm Hefeextrakt, 15 Milliliter Maissteillikör hinzu und bringen Sie den Inhalt zwei bis drei Minuten lang sanft zum Kochen.Gießen Sie insgesamt 100 Milliliter des Mediums in neun verschiedene 250-Milliliter-Kolben. Legen Sie einen Wattestopfen auf jeden Kolben und bedecken Sie die Watte mit Aluminiumfolie als Stopfen. Autoklavieren Sie das Medium in den Kolben für 55 Minuten bei 121 Grad Celsius.Lassen Sie später das Medium in den Kolben abkühlen und fügen Sie dem Medium in jedem Kolben 10 Milligramm pro Milliliter Streptomycin hinzu. Sammeln Sie zwei bis drei bakterielle Schleifen von Pilzkonidien aus zwei bis drei Wochen alten Pilzkulturplatten für beide EPF-Isolate. Übertragen Sie die Pilzkonidien auf jeweils 100 Milliliter flüssige Medien in den 250-Milliliter-Kolben unter sterilen Bedingungen und verschließen Sie die Kolben.Inkubieren Sie die flüssigen Kulturkolben bei etwa 25 Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler bei 140 U / min für drei Tage und stoppen Sie die Inkubation, sobald die Kulturen Anzeichen einer hohen Trübung mit pilzlichem Blastosporenwachstum zeigen. Um eine mögliche bakterielle Kontamination durch die Kulturen zu erkennen, ziehen Sie nach 24 Stunden Inkubation eine 100-Mikroliter-Probe aus jedem Flüssigkulturkolben und eine Platte auf drei SDA-Platten pro Isolat. Inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei einer kontrollierten Temperatur von plus oder minus 25 Grad Celsius.Verwenden Sie ein kleines Polyvinylchlorid-Abfallrohr, um einen Hals für den Gärbeutel am offenen Ende des Autoklavbeutels zu erstellen, und verwenden Sie Autoklavband, um das Rohr zu sichern. Schließen Sie das Rohr mit einem sterilen Wattestopfen, um einen ausreichenden Gasaustausch während der Gärung zu ermöglichen. Verwenden Sie parboiled langkörnigen weißen Reis als festes Substratmedium für die Blastosporen von Metarhizium pinghaense und Metarhizium robertsii.Für jeden Gärbeutel ein Kilogramm Reis und 300 Milliliter steriles destilliertes Wasser hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig den Inhalt der Gärbeutel. Legen Sie sie in äußere Autoklavenbeutel in aufrechter Position und autoklavieren Sie sie bei 121 Grad Celsius für 55 Minuten.Lassen Sie die Substrate nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen etwa 45 Minuten abkühlen. Entfernen Sie den Verschluss jedes der flüssigen Kulturkolben von Metarhizium pinghaense und Metarhizium robertsii unter einer laminaren Strömung und flammen Sie den Rand jedes Kolbens für 10 Sekunden an. Gießen Sie 100 Milliliter flüssige Kulturen in die Gärbeutel, indem Sie die Wattestopfen von ihren Hälsen nehmen.Setzen Sie die Baumwollstöpsel wieder auf und bedecken Sie die Oberseite des Halses der Tasche mit chirurgischem Papier, das mit einem Gummiband gesichert ist. Drehen Sie den oberen Teil des Beutels und mischen Sie den Inhalt des Beutels, indem Sie das Substrat durch Massage schütteln und manipulieren. Inkubieren Sie die Beutel bei etwa 25 Grad Celsius, indem Sie das Substrat in den Beuteln abflachen, um die Bildung dicker Betten zu verhindern.Zwei bis drei Tage nach der Impfung und Inkubation, wenn sichtbares Myzelwachstum und die Bindung des Substrats durch den Pilz aufgetreten sind, brechen Sie das Substrat in den Gärbeuteln auf, indem Sie den Inhalt der Beutel massieren. Nach der Fermentation die sporulierten Kulturen in 26 bis 30 Kilogramm schwere braune Papiertüten überführen und die Pilzkulturen 10 bis 12 Tage trocknen, bevor sie in Versuchen verwendet werden. Um die Zugfestigkeit der Papiertüten zu verbessern, schneiden Sie horizontal 1/3 des oberen Teils des Beutels ab und kleiden Sie den Boden des Beutels aus.Zerbröckeln Sie das Substrat vorsichtig in jedem Gärbeutel. Schneiden Sie die Ecke jeder Tasche ab und übertragen Sie langsam die gesamte Kultur auf die Papiertüten durch den Raum, der durch die abgeschnittene Ecke übrig bleibt. Beschriften Sie jede Papiertüte, falten Sie sie zweimal über das obere Ende jeder Tasche und schließen Sie sie mit Klammern, um eine dreieckige Zeltstruktur zu schaffen.Legen Sie die Beutel auf Drahttrockengestelle, um eine ordnungsgemäße, gleichmäßige Trocknung bei einer kontrollierten Temperatur von etwa 25 Grad Celsius und einer niedrigen Luftfeuchtigkeit von 30 bis 40% zu ermöglichen. Ernten Sie Pilzkonidien aus den Kulturen mit drei verschachtelten Sieben, die auf einer Auffangwanne montiert sind. Laden Sie die Trockenkulturprobe langsam auf das ETS-Netz Nummer 35 und das Sieb. Legen Sie einen Deckel auf das Sieb, um die Freisetzung von Pilzkonidien in die Luft zu verhindern.Fügen Sie 10 bis 12 Glasmurmeln zu den Sieben hinzu, um den Durchgang der Pilzkonidien durch die Netzsiebe zu unterstützen und die Retention der Konidien im Sieb zu vermeiden, was zu einer verminderten Sporenausbeute führen kann. Kleben und versiegeln Sie die Siebverbindungen mit Elektroband. Legen Sie die Siebe auf einen Vibrationsschüttler, der mit einem klebrigen Pad ausgestattet ist, um die Auffangwanne und die Siebe für 20 bis 25 Minuten bei einer Bewegung von 560 bis 640 Vibrationen pro Minute zu sichern.Entfernen Sie die Analysensiebe aus der Auffangwanne, sammeln Sie Konidien und lagern Sie die gesammelten Konidien in luftdichten und wasserundurchlässigen Reißverschlussbeuteln zur Langzeitlagerung. Durchschnittlich etwa 1,83 Gramm trockene Metarhizium robertsii conidia wurden aus dem Flockgerstensubstrat geerntet, während aus dem Substrat keine Metarhizium pinghaense gewonnen wurde. Für beide Metarhizium-Arten wurden keine trockenen Pilzkonidien aus dem Flockenhafersubstrat geerntet.Ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Arten von Metarhizium wurde in den geschätzten durchschnittlichen Konidien pro Gramm beobachtet, die aus den Reiskörnern geerntet wurden. Metarhizium robertsii hatte eine etwas höhere durchschnittliche Konidienzahl pro Gramm als Metarhizium pinghaense. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Arten von Metarhizium in der geschätzten Anzahl der Konidien auf dem verbrauchten Reissubstrat beobachtet.Metarhizium pinghaense hatte jedoch etwas höhere Konidien auf dem Reissubstrat als Metarhizium robertsii Bei den beiden Arten von Metarhizium wird kein signifikanter Unterschied in ihrem Gesamtkonidienertrag aus den Reissubstratkulturen geschätzt. Metarhizium pinghaense produzierte jedoch einen etwas höheren Konidienertrag als Metarhizium robertsii, der einen niedrigeren konidiellen Ertrag produzierte. Der herausfordernde Teil dieser Technik ist die Substratkontamination durch Impfung mit einem kontaminierten Blastosporen-Inokulum.Stellen Sie daher immer die Sterilität während der Arbeit sicher. Diese Demonstration hilft den Schülern, die Technik effizient zu reproduzieren, ohne ungeschickte Fehler, die zur Beendigung des gesamten Prozesses führen können.

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Protein in mCD1d Insektenzellen.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Forschung

Biologie

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Anwendung von Membran- und Zellwandselektiven Fluoreszenzfarbstoffen für die Live-Zell-Bildgebung von filamentösen Pilzen

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Immunfluoreszenzmarkierung von pflanzlichen Virus- und Insektenvektorproteinen in Hemipteren-Eingeweiden

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Prozessentwicklung zur Herstellung und Reinigung von Adeno-assoziiertem Virus (AAV)2 Vektor mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

Bewertung der aphidiziden Wirkung entomopathogener Pilze gegen parthenogenetisches Insekt, Senfblattlaus, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Erkundung entomopathogener Pilzressourcen aus Waldholzzünslern

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Bewertung entomopathogener Pilze in wilden Monochamus alternatus-Populationen für biologische Schädlingsbekämpfungsanwendungen bei W

Isolierung, Verhaltensidentifikation und Pathogenitätsbewertung von entomopathogenen Pilzen aus einem Waldholzbohrer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...