Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare Hort Pome, Hort Stone e il programma Technology and Human Resources for Industry (THRIP: TP14062571871) per aver finanziato il progetto.
ORCID: Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Fonte di ceppi fungini
<ol><li>Utilizzare ceppi fungini isolati sudafricani di M. pinghaense 5 HEID (GenBank Numero di adesione: MT367414/MT895630) e M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), raccolti da meleti nella provincia del Capo Occidentale, in Sudafrica.</li>
	<li>Coltivare colture di ciascun isolato di EPF su 60 g di mezzo agar destrosio Sabouraud, integrato con 1 g di estratto di lievito (SDAY) e 10 μL di streptomicina. NOTA: Incubare colture di EPF a temperat...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. 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Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. 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Il successo dell'integrazione di agenti microbici per il controllo biologico di importanti insetti nocivi agricoli in un agroecosistema dipende sia dal successo che dalla facilità di produzione di massa degli entomopatogeni come primo passo in condizioni di laboratorio. La produzione di massa di EPF è importante per l'applicazione su larga scala e la disponibilità di prodotti EPF per programmi IPM utilizzando il controllo biologico 9,10,11,12,13.<su...

I funghi entomopatogeni (EPF) hanno acquisito importanza come agenti di protezione delle colture nel controllo biologico di importanti insetti nocivi agricoli 1,2. Gli entomopatogeni, che si trovano naturalmente nel suolo, causano epizoozie nelle popolazioni di varie specie di parassiti3. Le specie di EPF sono specifiche dell'ospite e presentano relativamente pochi rischi in termini di attacco alle specie non bersaglio, e non sono tossiche per l'ambiente4. Gli EPF hanno un meccanismo unico per invadere il loro ospite, così come per propagarsi e persistere nel loro ambiente immediato1. Attaccano l'ospite principalmente attraverso spore asessuate che si attaccano e penetrano nella cuticola dell'ospite per invadere e proliferare nell'emocoel ospite. L'ospite alla fine muore a causa dell'esaurimento dei nutrienti dell'emolinfa o a causa della tossiemia causata dai metaboliti tossici rilasciati dal fungo. Dopo la morte, in condizioni ambientali ideali, il fungo emerge sulla superficie esterna (micosi conclamata) del cadavere ospite 5,6.
Le crescenti preoccupazioni per quanto riguarda gli effetti negativi dei residui chimici sulla salute umana, l'inquinamento ambientale e lo sviluppo della resistenza ai parassiti hanno portato alla spinta globale a ridurre gli input di insetticidi a base chimica e a trovare strategie alternative, nuove e sostenibili per la protezione delle colture e il controllo dei parassiti 6,7,8 . Ciò ha fornito l'opportunità di sviluppare insetticidi a base microbica da utilizzare nei programmi di gestione integrata dei parassiti (IPM), che sono strategie ecologicamente più favorevoli rispetto al controllo chimico convenzionale 3,8.
Per sviluppare un agente di controllo microbico di successo per un parassita agricolo, un organismo adatto deve prima essere isolato, caratterizzato, identificato e la sua patogenicità per l'organismo nocivo bersaglio confermato. Tuttavia, è necessario un metodo semplice ed economico per la produzione su larga scala dell'agente microbico per produrre un prodotto valido da utilizzare nei programmi di controllo biologico 9,10,11,12,13. La produzione di massa di quantità sostanziali di entomopatogeni di buona qualità dipende dal ceppo microbico, dall'ambiente, dal parassita bersaglio, dalla formulazione, dal mercato, dalla strategia di applicazione e dal prodotto finale desiderato 14,15,16. L'EPF può essere prodotto in serie utilizzando la fermentazione del substrato liquido per produrre blastospore o il processo di fermentazione del substrato solido per produrre conidiaerei 6,17,18. Tuttavia, il processo di produzione e formulazione di massa di entomopathogens influenza direttamente la virulenza, il costo, la durata di conservazione e l'efficacia sul campo del prodotto finale. Per un uso di successo nella difesa integrata, il processo di produzione degli entomopatogeni deve essere facile da eseguire, richiedere manodopera minima, produrre una concentrazione ad alto rendimento di propaguli virulenti, vitali e persistenti ed essere a basso costo 4,13,14,16.
Comprendere le esigenze nutrizionali degli entomopatogeni è importante per la coltivazione di massa con tutti i metodi dicoltivazione 4,12. I componenti nutrizionali del mezzo di produzione hanno un impatto significativo sugli attributi dei propaguli risultanti, tra cui l'efficacia del biocontrollo, la resa, la tolleranza all'essiccazione e la persistenza 8,19,20,21. L'ottimizzazione delle procedure di produzione è progettata per affrontare tali fattori22. Per l'EPF, i requisiti principali per una buona crescita, sporulazione e produzione di massa di conidi fungini sono l'umidità adeguata, la temperatura di crescita ottimale, il pH, lo scambio di gas di CO2 e O2 e la nutrizione, comprese buone fonti di fosforo, carboidrati, carbonio e azoto18.
Jaronski e Jackson18 descrivono il metodo di fermentazione del substrato solido come il metodo di approssimazione più efficiente e più vicino al processo naturale per la produzione di EPF rispetto al metodo di fermentazione del substrato liquido perché, in condizioni naturali, il conidio fungino è portato su solide strutture erette, come la superficie dei cadaveri di insetti. I prodotti agricoli e i sottoprodotti contenenti amido sono utilizzati principalmente per la produzione di massa di funghi ipocrealeani, poiché i funghi decompongono facilmente l'amido attraverso la secrezione di enzimi idrolitici altamente concentrati dalle loro punte ifali, per penetrare nella sostanza solida e per accedere ai nutrienti presenti nella sostanza 11,17,18,23 . I prodotti a base di cereali forniscono anche i requisiti per una produzione sana di biomassa perché, quando sono idratati e sterilizzati, i substrati possono assorbire ulteriori nutrienti da qualsiasi mezzo liquido 16,18,24.
In precedenza, diversi studi hanno tentato di coltivare in massa specie di EPF come Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas e alcuni dei Metarhizium anisopliae (Metschn.) Il complesso di specie Sorokin si isola su vari substrati 16,23,24. Tali isolati prodotti in serie e sviluppati commercialmente includono Green Muscle® (ceppo IMI 330189), sviluppato da M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (ceppo Meta 69 ICIPE69), e Real Metarhizium 69 (L9281), sviluppato da M. anisopliae, e Broadband® (ceppo PPRI 5339) ed Eco-Bb®, sviluppato da B. bassiana25,26 . Tuttavia, sono stati fatti tentativi limitati alla cultura di massa Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber e Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Questi due isolati sono stati selezionati in uno studio precedente come i più efficaci per il controllo della cocciniglia, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Pertanto, l'attuale studio mirava a formulare e produrre in serie un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti degli isolati locali di M. robertsii e M. pinghaense per l'applicazione commerciale contro gli insetti nocivi. Il metodo di fermentazione del substrato solido è stato utilizzato per produrre in serie i conidi fungini per entrambi gli isolati di EPF. Due metodi di inoculazione EPF, utilizzando sospensioni conidiali e la coltura fungina liquida di blastospore, sono stati utilizzati per inoculare i substrati solidi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

I funghi entomopatogeni del complesso di specie Metarhizium anisopliae hanno acquisito importanza come agenti di controllo biologico degli insetti nocivi agricoli. L'aumento della resistenza dei parassiti agli insetticidi chimici, le crescenti preoccupazioni per gli effetti negativi degli insetticidi sulla salute umana e l'inquinamento ambientale da pesticidi hanno portato a una spinta globale per trovare nuove strategie sostenibili per la protezione delle colture e il controllo dei parassiti. In precedenza, sono stati condotti tentativi di coltura di massa di tali specie di funghi entomopatogeni (EPF) come Beauveria bassiana . Tuttavia, sono stati condotti solo tentativi limitati di coltura di massa di Metarhizium robertsii e M. pinghaense per l'uso contro gli insetti nocivi. Questo studio mirava a produrre in serie un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti di isolati sudafricani di M. robertsii e M. pinghaense per applicazioni commerciali. Tre prodotti a base di cereali agricoli, avena in fiocchi, orzo in fiocchi e riso, sono stati utilizzati come substrati di fermentazione solida EPF. Due metodi di inoculazione, sospensioni conidiali e la coltura fungina liquida di blastospore sono stati utilizzati per inoculare i substrati solidi. L'inoculazione con sospensioni conidiali è stata osservata come relativamente meno efficace, poiché sono stati osservati livelli aumentati di contaminazione sui substrati solidi rispetto a quando si utilizza il metodo di inoculazione delle blastospore. L'avena in scaglie non è risultata essere un substrato di crescita adatto sia per M. robertsii che per M. pinghaense, poiché nessun conidi secco è stato raccolto dal substrato. L'orzo in scaglie è stato trovato per favorire la produzione di M. robertsii conidia rispetto a quella di M. pinghaense, e una media di 1,83 g ± 1,47 g di conidia secca di M. robertsii e zero grammi di conidia M. pinghaense è stata raccolta dal substrato. I chicchi di riso sono risultati favorire la produzione di massa conidiale di isolati di M. pinghaense e M. robertsii , con una media di 8,2 g ± 4,38 g e 6 g ± 2 g raccolti dal substrato, rispettivamente.

Un declino della massa di contenuto delle colture sul riso sia per il M. pinghaense che per il M. robertsii è stato osservato nel tempo durante la fase di essiccazione delle colture fungine, con nessun o poco cambiamento osservato nella massa una volta che le colture erano secche (Figura 5). La polvere di conidi fungini secchi raccolti sia del M. pinghaense che del M. robertsii è mostrata nella Figura 6.
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Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

I funghi entomopatogeni hanno acquisito importanza come agenti di controllo biologico degli insetti nocivi agricoli. In questo studio, la produzione di massa di un numero sufficiente di propaguli infettivi resilienti di isolati sudafricani di Metarhizium robertsii e M. pinghaense per l'applicazione commerciale contro gli insetti nocivi è stata condotta con successo utilizzando prodotti a base di cereali agricoli.

Produzione di massa di funghi entomopatogeni, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, per applicazioni commerciali contro gli insetti nocivi

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Questo metodo fornisce nuove informazioni su come produrre in serie conidi infettivi di funghi entomopatogeni per controllare importanti insetti nocivi negli agroecosistemi commerciali, data l'attuale situazione in cui la maggior parte degli insetticidi viene gradualmente eliminata a causa delle preoccupazioni del loro effetto tossico sull'ambiente e sulla salute umana. La tecnica descrive il metodo utilizzato per garantire la resa ottimale dei conidi EPF durante la produzione di massa. Il metodo è utile per la gestione integrata dei parassiti e il controllo biologico fornendo informazioni sull'efficacia dei conidi prodotti in serie per la gestione su larga scala dei dannosi insetti nocivi resistenti agli insetticidi negli agroecosistemi.Questa procedura è stata sviluppata e dimostrata dal Dr.Letodi Luki Mathulwe, dal Dr.Nomakholwa Faith Stokwe e dalla Professoressa Antoinette Paula Malan. Riscaldare un litro di acqua distillata e spegnere il fuoco prima di raggiungere il punto di ebollizione. Ora, aggiungi 30 grammi di glucosio, quattro grammi di fosfato di potassio bibasico, 20 grammi di estratto di lievito, 15 millilitri di liquore ripido di mais e porta il contenuto a ebollizione delicata per due o tre minuti.Versare un totale di 100 millilitri del mezzo in nove diversi palloni da 250 millilitri. Posizionare un tappo di cotone idrofilo su ogni pallone e coprire il batuffolo di cotone con un foglio di alluminio come tappo. Autoclave del mezzo nei palloni per 55 minuti a 121 gradi Celsius.Successivamente, lasciare raffreddare il mezzo nei palloni e aggiungere 10 milligrammi per millilitro di streptomicina al mezzo in ogni pallone. Raccogliere da due a tre anelli batterici di conidi fungini da piastre di coltura fungina di due o tre settimane per entrambi gli isolati di EPF. Trasferire i conidi fungini in ogni 100 millilitri di liquido nei palloni da 250 millilitri in condizioni sterili e sigillare i palloni.Incubare i palloni di coltura liquida a circa 25 gradi Celsius su uno shaker orbitale a 140 RPM per tre giorni e cessare l'incubazione una volta che le colture mostrano segni di elevata torbidità con la crescita di blastospore fungine. Per rilevare qualsiasi possibile contaminazione batterica dalle colture, prelevare un campione di 100 microlitri da ciascun pallone di coltura liquida dopo 24 ore di incubazione e piastra su tre piastre SDA per isolato. Incubare le piastre per 48 ore a una temperatura controllata di più o meno 25 gradi Celsius.Utilizzare un piccolo tubo di scarico di cloruro di polivinile per creare un collo per il sacchetto di fermentazione all'estremità aperta del sacchetto dell'autoclave e utilizzare il nastro adesivo per fissare il tubo. Chiudere il tubo con un tappo di cotone idrofilo sterile per consentire un sufficiente scambio di gas durante la fermentazione. Utilizzare riso bianco parboiled a grana lunga come substrato solido per le blastospore di Metarhizium pinghaense e Metarhizium robertsii.Per ogni sacchetto di fermentazione, aggiungere un chilogrammo di riso e 300 millilitri di acqua distillata sterile. Mescolare delicatamente il contenuto dei sacchetti di fermentazione. Metterli in sacchetti esterni in autoclave in posizione verticale e autoclave a 121 gradi Celsius per 55 minuti.Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare i substrati per circa 45 minuti in condizioni sterili. Rimuovere la chiusura di ciascuno dei palloni di coltura liquida di Metarhizium pinghaense e Metarhizium robertsii sotto un flusso laminare e fiammare il bordo di ciascun matraccio per 10 secondi. Versare 100 millilitri di colture liquide nei sacchetti di fermentazione rimuovendo i tappi di cotone idrofilo dal collo.Riposizionare i tappi di cotone e coprire la parte superiore del collo della borsa con carta chirurgica fissata con un elastico. Ruotare la parte superiore della borsa e mescolare il contenuto della borsa agitando e manipolando il substrato mediante massaggio. Incubare i sacchetti a circa 25 gradi Celsius appiattindo il substrato nei sacchetti per evitare la formazione di letti spessi.Due o tre giorni dopo l'inoculazione e l'incubazione, quando si era verificata la crescita miceliale visibile e il legame del substrato da parte del fungo, rompere il substrato nei sacchi di fermentazione massaggiando il contenuto dei sacchetti. Dopo la fermentazione, trasferire le colture sporulate in sacchetti di carta marrone da 26 a 30 chilogrammi e asciugare le colture fungine per 10-12 giorni prima del loro utilizzo nelle prove. Per migliorare la resistenza alla trazione dei sacchetti di carta, tagliare orizzontalmente 1/3 della parte superiore del sacchetto e foderare il fondo del sacchetto.Sbriciolare delicatamente il substrato in ogni sacchetto di fermentazione. Taglia l'angolo di ogni sacchetto e trasferisci lentamente l'intera cultura nei sacchetti di carta attraverso lo spazio lasciato dall'angolo tagliato. Etichetta ogni sacchetto di carta, piega due volte l'estremità superiore di ogni sacchetto e chiudi con graffette per creare una struttura triangolare della tenda.Posizionare i sacchetti su stendibiancheria per consentire una corretta e uniforme asciugatura a una temperatura controllata di circa 25 gradi Celsius e bassa umidità dal 30 al 40% Raccogliere i conidi fungini dalle colture utilizzando tre setacci nidificati montati su una padella di raccolta. Caricare lentamente il campione di coltura a secco sulla maglia ETS numero 35 e setacciare. Posizionare un coperchio sul setaccio per impedire il rilascio di conidi fungini nell'aria.Aggiungere da 10 a 12 biglie di vetro ai setacci per favorire il passaggio dei conidi fungini attraverso gli schermi a rete ed evitare la ritenzione dei conidi nel setaccio, che può comportare un ridotto recupero delle spore. Nastro adesivo e sigillare i giunti del setaccio utilizzando nastro adesivo. Posizionare i setacci su uno shaker vibrante dotato di un cuscinetto appiccicoso per fissare la padella di raccolta e i setacci per 20-25 minuti con un movimento da 560 a 640 vibrazioni al minuto.Rimuovere i setacci di prova dalla padella di raccolta, raccogliere i conidi e conservare i conidi raccolti in sacchetti ermetici e impermeabili con chiusura a cerniera per la conservazione a lungo termine. Una media di circa 1,83 grammi di Metarhizium robertsii conidia secca è stata raccolta dal substrato d'orzo in fiocchi, mentre zero Metarhizium pinghaense è stato raccolto dal substrato. Nessun conidi fungino secco è stato raccolto dal substrato di avena in scaglie per entrambe le specie di Metarhizium.Una differenza significativa è stata osservata tra le due specie di Metarhizium nei conidi medi stimati per grammo raccolto dai chicchi di riso. Metarhizium robertsii aveva un numero medio di conidi per grammo leggermente superiore a Metarhizium pinghaense. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra le due specie di Metarhizium nel numero stimato di conidi presenti sul substrato di riso esaurito.Tuttavia, Metarhizium pinghaense aveva conidi leggermente più alti sul substrato di riso rispetto a Metarhizium robertsii Nessuna differenza significativa è stimata nelle due specie di Metarhizium nella loro resa complessiva di conidi ottenuta dalle colture di substrato di riso. Tuttavia, Metarhizium pinghaense ha prodotto una resa di conidi leggermente superiore rispetto a Metarhizium robertsii, che ha prodotto una resa conidiale inferiore. La parte impegnativa di questa tecnica è la contaminazione del substrato attraverso l'inoculazione con un inoculo di blastospore contaminato.Pertanto, garantire sempre la sterilità durante il lavoro. Questa dimostrazione aiuta gli studenti a riprodurre in modo efficiente la tecnica senza errori maldestri che possono comportare la fine dell'intero processo.

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

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Un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.

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Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

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Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

Valutazione dell'effetto afididida di funghi entomopatogeni contro insetti partenogenetici, afide della senape, Lipaphis erysimi (Kalt.)

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<meta charset="utf8"></head><body>Esplorazione delle risorse di funghi entomopatogeni dai piralidi del legno forestale

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Valutazione dei funghi entomopatogeni nelle popolazioni selvatiche di Monochamus alternatus per applicazioni di biocontrollo nei pi

Isolamento, identificazione comportamentale e valutazione della patogenicità di funghi entomopatogeni da una piralide forestale

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...