Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

著者らは、このプロジェクトに資金を提供してくれたHort Pome、Hort Stone、およびTechnology and Human Resources for Industry Programme(THRIP:TP14062571871)に感謝したい。
オルシド: レトディ・L・マトゥルウェ http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
アントワネット・P・マラン・http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
ノマコルワ・F・ストクウェ http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1.真菌株の供給源
<ol><li>南アフリカの西ケープ州のリンゴ果樹園から採取したM. pinghaense 5 HEID(GenBankアクセッション番号:MT367414/MT895630)とM. robertsii 6EIKEN(MT378171/MT380849)の両方の南アフリカの単離真菌株を使用してください。</li>
	<li>各EPF分離株の培養物を、1gの酵母エキス(SDAY)および10μLのストレプトマイシンを添加した60gのサブローデキストロース寒天培地上で...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+biology+and+control+of+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae),+with+special+reference+to+biological+control+using+entomopathogenic+fungi+and+nematodes.">A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes.</a> African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).</li><li>Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production,+yield,+quality,+formulation+and+efficacy+of+entomopathogenic+Metarhizium+anisopliae+conidia.">Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia.</a> Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).</li><li>Banu, J. G., Rajalakshmi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+media+for+mass+multiplication+of+entomopathogenic+fungi.">Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi.</a> Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).</li><li>Roberts, D. W., Humber, R. A., Cole, G. T., Kendrick, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomogenous+fungi.">Entomogenous fungi.</a> Biology of Conidial Fungi. , 201-236 (1981).</li><li>Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+formulation+and+application+of+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+for+insect+control.+Current+status.">Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status.</a> Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).</li><li>Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+solid+substrates+on+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae+entomopathogens.">Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens.</a> The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , 8-12 (2010).</li><li>Prasad, C. S., Pal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+and+economics+of+entomopathogenic+fungus,+Beauveria+bassiana,+Metarhizium+anisopliae+and+Verticillium+lecanii+on+agricultural+and+industrial+waste.">Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste.</a> Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).</li><li>Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+nematodes+for+plant+protection.">Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).</li><li>Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+blastospore+of+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+in+a+submerged+batch+culture.">Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture.</a> Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).</li><li>Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products.">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products.</a> The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).</li><li>Latifian, M., Rad, B., Amani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+Metarhizium+anisopliae+by+using+agricultural+products+based+on+liquid-solid+diphasic+method+for+date+palm+pest+control.">Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control.</a> International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).</li><li>Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+(Metarhizium+anisopliae)+using+different+grains+as+a+substrate.">Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).</li><li>Jackson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nutritional+conditions+for+the+liquid+culture+production+of+effective+fungal+biological+control+agents.">Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).</li><li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycopesticides+production+by+fermentation.+Potential+and+challenges.">Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges.</a> Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).</li><li>Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products+and+by+products.">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products.</a> African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).</li><li>Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verticillium+lecanii+spore+production+in+solid-state+and+liquid-state+fermentations.">Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations.</a> Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).</li><li>Jaronski, S. T., Jackson, M. A., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+Hypocreales.">Mass production of entomopathogenic Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. , 255-284 (2012).</li><li>Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+grains+as+solid+substrates+on+sporulation,+viability+and+pathogenicity+of+Metarhizium+anisopliae+(Metschnikoff)+Sorokin.">Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin.</a> Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).</li><li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whey+for+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).</li><li>Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+suitable+medium+for+mass+multiplication+of+entomofungal+pathogens.">Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens.</a> Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).</li><li>Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rice+by-products,+incubation+time,+and+photoperiod+for+solid+state+mass+multiplication+of+the+biocontrol+agents+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).</li><li>Price, R. E., M&#252;ller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+trial+of+a+Metarhizium+anisopliae+var.+acridum+mycoinsecticide+for+the+control+of+the+red+locust+in+a+recognised+outbreak+area.">The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area.</a> International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).</li><li>Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+control+of+phytophagous+invertebrate+pests+in+South+Africa.+Current+status+and+future+prospects.">Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+used+for+entomopathogenic+fungi:+Hypocreales.">Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).</li><li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+carbon+&amp;+nitrogen+sources+on+the+Trichoderma+viride+(Biofungicide)+and+Beauveria+bassiana+(entomopathogenic+fungi).">Impact of carbon &amp; nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi).</a> European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).</li><li>Burges, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+mycoinsecticides.">Formulation of mycoinsecticides.</a> Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).</li></ol>

農業生態系における重要な農業害虫の生物学的防除のための微生物剤の統合の成功は、実験室条件下での第一歩としての昆虫病原体の成功と大量生産の容易さの両方に依存する。EPFの大量生産は、生物学的制御9、10、11、12、13を用いたIPMプログラムのためのEPF製品の大?...

昆虫病原性真菌(EPF)は、重要な農業害虫の生物学的防除における作物保護剤として重要性を増している1、2。土壌中に自然に発生する昆虫病原体は、様々な害虫種の集団に流行を引き起こす3。EPFの種は宿主特異的であり、非標的種を攻撃するという点で比較的リスクが少なく、環境に対して毒性がない4。EPF には、ホストに侵入するための独自のメカニズムと、その直接の環境での伝播と永続化のための独自のメカニズムがあります 1。彼らは主に宿主のキューティクルに付着して浸透する無性胞子を介して宿主を攻撃し、宿主のヘモコエルに侵入して増殖する。宿主は、最終的に血リンパ栄養素の枯渇のために、または真菌によって放出される毒性代謝産物によって引き起こされる毒素血症の結果として死亡する。死後、理想的な環境条件下で、真菌は宿主死体5,6の外表面(明白な真菌症)に出現する。
残留化学物質が人間の健康、環境汚染、および害虫抵抗性の開発に及ぼす悪影響に関する懸念の高まりは、化学ベースの殺虫剤の投入を減らし、作物保護と害虫駆除のための代替的で斬新で持続可能な戦略を見つける世界的な推進力をもたらしました6,7,8 .これは、従来の化学防除よりも生態学的に有利な戦略である統合害虫管理(IPM)プログラムで使用するための微生物ベースの殺虫剤を開発する機会を提供しました3,8。
農業害虫のための微生物防除剤の開発を成功させるためには、まず適切な生物を単離し、特徴付け、同定し、標的害虫に対するその病原性を確認しなければならない。しかしながら、微生物剤の大規模生産のための容易で費用対効果の高い方法は、生物学的制御プログラム9、10、11、12、13において使用するための生存可能な生成物を製造するために必要とされる。相当量の良質の昆虫病原体の大量生産は、微生物株、環境、標的害虫、製剤、市場、施用戦略、および所望の最終製品に依存する14、15、16。EPFは、胚芽胞子を生成するための液体基質発酵または空中分生子6、17、18を生成する固体基質発酵プロセスを使用して大量生産することができる。しかし、昆虫病原体の大量生産および製剤化プロセスは、最終製品の病原性、コスト、貯蔵寿命、および現場有効性に直接影響する。IPMでの使用を成功させるためには、昆虫病原体の生産プロセスは、実行が容易で、最小限の労力を必要とし、毒性、生存可能、および持続性の高収量濃度のプロパグルを生産し、低コストでなければならない4,13,14,16。
昆虫病原体の栄養要件を理解することは、すべての培養方法による大量培養にとって重要である4,12。生産培地の栄養成分は、生物防除有効性、収量、乾燥耐性、および持続性を含む、結果として生じるプロパグルの属性に重大な影響を及ぼす8、19、20、21。生産手順の最適化は、このような要因に対処するように設計されています 22.EPFにとって、真菌分生子の良好な成長、胞子形成、および大量生産のための主な要件は、適切な水分、最適な成長温度、pH、CO2およびO2のガス交換、ならびに良好なリン、炭水化物、炭素、および窒素源を含む栄養である18。
JaronskiとJackson18は、自然条件下では、真菌の分生子が昆虫の死体の表面のような固体直立構造に担がれるため、固体基質発酵法を液体基質発酵法と比較してEPF生産のための自然プロセスに最も効率的かつ最も近い近似法として記述している。デンプンを含む農産物および副産物は、真菌が菌糸先端からの高濃度加水分解酵素の分泌を介してデンプンを容易に分解し、固体物質に浸透し、物質中に存在する栄養素にアクセスするため、主に低クレアリア菌の大量生産に使用されている11、17、18、23.穀物製品はまた、それらが水和および滅菌されると、基質が任意の液体媒体16、18、24からさらなる栄養素を吸収することができるので、健康なバイオマス生産のための要件を提供する。
以前は、いくつかの研究がボーベリア・バッシアナ(Bals)のようなEPF種を大量培養しようと試みた。Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.)ViegasとMetarhizium anisopliae(Metschn)の一部。ソロキン種複合体は、種々の基質16、23、24上に単離する。このような大量生産され商業的に開発された分離株には、M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humberから開発されたGreen Muscle®(株IMI 330189)、Metarhizium 69(Meta 69株ICIPE69)、およびM. anisopliaeから開発されたReal Metarhizium 69(L9281)、およびB. bassiana25,26から開発されたBroadband® (株PPRI 5339)およびEco-Bb®が含まれる。.しかし、Metarhizium robertsii J.F. Bisch、S.A. Rehner & Humber、Metarhizium pinghaense Chen & Guoを大量培養する試みは限定的である。これら2つの分離株は、以前の研究で、ミツバチ、Pseudococcus viburni Signoret(半翅目:Pseudococcidae)の防除に最も効果的であるものとして選択されました27。したがって、現在の研究は、害虫に対する商業的適用のために、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの局所分離株の十分な数の弾力性のある感染性プロパグルを処方し、大量生産することを目的としていた。固体基質発酵法を用いて、両方のEPF分離株について真菌分生子を大量生産した。2つのEPF接種法は、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を使用して、固体基質を接種するために使用した。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

メタリジウム・アニソプリアエ種複合体の昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。化学殺虫剤に対する害虫抵抗性の増加、殺虫剤の人間の健康への悪影響に関する懸念の高まり、および農薬による環境汚染は、作物保護と害虫駆除のための新しい持続可能な戦略を見出す世界的な推進力をもたらしました。これまで、ボーベリア・バッシアナのような昆虫病原性真菌(EPF)種を大量培養する試みが行われている。しかしながら、昆虫害虫に対する使用のためにメタリジウム・ロベルツィイおよびM. pinghaenseを大量培養する試みは限定的にしか行われていない。この研究は、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性伝播剤を商業用途のために大量生産することを目的としていた。3つの農業穀物製品、フレークドオート麦、フレーク大麦、および米をEPF固体発酵基質として使用した。2つの接種方法、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を固体基質に接種するために使用した。分生子懸濁液を用いた接種は、ブラストスポア接種法を使用した場合と比較して固体基質上に増加したレベルの汚染が観察されたため、比較的効果が低いことが観察された。フレーク状のオート麦は、M. robertsiiとM. pinghaenseの両方にとって適切な成長基質ではないことが判明し、基質から乾燥分生子が採取されなかった。フレーク状の大麦は、M. pinghaenseのそれよりもM. robertsii conidiaの生産に有利であることが見出され、平均1.83g±1.47gの乾燥M. robertsii分生子および0グラムのM. pinghaense分生子が基質から収穫された。 米粒は、M. pinghaense分離株とM. robertsii分離株の両方の分生子大量生産に有利に働くことが見出され、基質から収穫された±平均8.2g±4.38gおよび6gである。

M. pinghaenseとM. robertsiiの両方について、イネ上の培養物の含量質量の減少は、真菌培養物の乾燥段階で経時的に観察され、培養物が乾燥した後、質量に変化は見られなかったか、またはほとんど観察されなかった(図5)。M. pinghaenseとM. robertsiiの両方の回収された乾燥真菌分生子粉末を図6に示す。
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Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。この研究では、害虫に対する商業利用のために、 Metarhizium robertsii および M. pinghaense の両方の南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性プロパグルの大量生産が、農業穀物製品を使用して首尾よく行われた。

昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

この方法は、環境や人間の健康に対する毒性の影響が懸念され、ほとんどの殺虫剤が段階的に廃止されている現状を踏まえ、商業農業生態系における重要な害虫を防除するために、昆虫病原性真菌の感染性分生子を大量生産する方法に関する新しい情報を提供します。この技術は、大量生産中にEPF分生子の最適な収率を保証するために使用される方法を説明しています。この方法は、農業生態系における有害な殺虫剤耐性昆虫害虫の大規模管理に対する大量生産分生子の有効性に関する洞察を提供することにより、統合された害虫管理および生物学的防除に役立つ。この手順は、Letodi Luki Mathulwe博士、Nomakholwa Faith Stokwe博士、Antoinette Paula Malan教授によって開発され、実証されました。1リットルの蒸留水を加熱し、沸点に達する前に火を止めます。次に、30グラムのグルコース、4グラムのリン酸カリウム二塩基、20グラムの酵母エキス、15ミリリットルのコーンスティープリカーを加え、内容物を2〜3分間穏やかに沸騰させます。合計100ミリリットルの培地を9つの異なる250ミリリットルフラスコに注ぐ。各フラスコにコットンウールプラグを置き、栓としてアルミホイルでコットンウールを覆います。フラスコ内の培地を121°Cで55分間オートクレーブする。その後、フラスコ内の培地を冷却し、各フラスコ内の培地にストレプトマイシン1ミリリットル当たり10ミリグラムを加える。両方のEPF分離株について、2〜3週齢の真菌培養プレートから真菌分生子の2〜3個の細菌ループを収集する。真菌分生子を滅菌条件下で250ミリリットルフラスコ内の液体培地の各100ミリリットルに移し、フラスコを密封する。液体培養フラスコを約25°Cで140RPMのオービタルシェーカー上で3日間インキュベートし、培養物が真菌芽胞子の成長を伴う高い濁度の徴候を示したらインキュベーションを停止する。培養物からの細菌汚染の可能性を検出するために、24時間の培養後に各液体培養フラスコから100マイクロリットルのサンプルを引き出し、単離物ごとに3つのSDAプレート上にプレートする。プレートをプラスまたはマイナス25°Cの制御された温度で48時間インキュベートする。小さなポリ塩化ビニル廃液パイプを使用して、オートクレーブバッグの開放端に発酵バッグ用のネックを作成し、オートクレーブテープを使用してパイプを固定します。発酵中に十分なガス交換を可能にするために、滅菌コットンウールプラグでパイプを閉じます。パーボイルド長粒白米を、メタリシウム・ピンヘンセとメタリシウム・ロバーツイの両方の芽胞子の固体基質培地として使用する。発酵袋ごとに、1キログラムの米と300ミリリットルの滅菌蒸留水を加える。発酵袋の内容物を静かに混ぜる。それらを外側のオートクレーブバッグに入れ直立させ、121°Cでオートクレーブを55分間置きます。オートクレーブ処理に続いて、基板を滅菌条件下で約45分間冷却します。メタリシウム・ピンヘーンセおよびメタリシウム・ロベルツィイの両方のそれぞれの液体培養フラスコの閉鎖を層流下で取り出し、各フラスコの縁を10秒間炎上させた。コットンウールのプラグを首から取り外して、発酵バッグに100ミリリットルの液体培養物を注ぎます。綿のプラグを元に戻し、バッグの首の上部を輪ゴムで固定された手術用紙で覆います。袋の上部をひねり、マッサージで基材を振ったり操作したりして、袋の中身を混ぜます。袋内の基質を平らにして、厚い床の形成を防ぐために、袋を約25°Cでインキュベートする。接種・インキュベーションの2~3日後、真菌による基質の結合と目に見える菌糸増殖が生じていた場合には、袋内容物をマッサージして発酵袋内の基質を壊す。発酵後、胞子状培養物を26〜30キログラムの茶色の紙袋に移し、真菌培養物を試験で使用する前に10〜12日間乾燥させる。紙袋の引張強度を向上させるために、袋の上部の1/3を水平に切断し、袋の底部を並べる。各発酵バッグ内の基質を穏やかに崩壊させる。各袋の角を切り取り、切り取られた角が残したスペースを通して文化全体を紙袋にゆっくりと移します。各紙袋にラベルを付け、各袋の上端を2回折り、ホチキス止めで閉じて三角形のテント構造を作成します。バッグをワイヤー乾燥ラックに置き、約25°Cの制御された温度と30〜40%の低湿度で適切に乾燥できるように、収集鍋に取り付けられた3つの入れ子になったふるいを使用して、培養物から真菌分生子を収穫します。乾式培養サンプルをETSメッシュ番号35およびふるいにゆっくりとロードする。真菌の分生子が空気中に放出されるのを防ぐためにふるいにかける。10〜12個のガラス大理石をふるいに追加して、メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を支援し、篩内の分生子の保持を回避し、胞子の回収を減少させる可能性がある。電気テープを使用してふるいの目地をテープで固定し、密封する。粘着性パッドを取り付けた振動シェーカーの上にふるいを置き、毎分560〜640振動の動きで収集パンとふるいを20〜25分間固定する。採取パンから試験ふるいを取り出し、分生子を採取し、採取した分生子を気密で水不透過性のジッパーロック袋に保管し、長期保存する。平均約1.83グラムの乾燥したメタリシウム・ロベルツィイ・コナディアがフレーク状の大麦基質から収穫されたが、基質からはゼロのメタリシウム・ピンヘンセが収穫された。いずれのメタリジウム種についても、フレーク状のオート麦基質から乾燥真菌分生子は採取されなかった。メトリシウムの2つの種の間には、米粒から収穫されたグラムあたりの推定平均分生子において有意差が観察された。メタリシウム・ロベルツィイは、メタリシウム・ピンヘーンセよりもグラム当たりの平均分生子数がわずかに高かった。使用済みイネ基質上に存在する分生子の推定数において、メタリシウムの2種間に有意差は認められなかった。しかしながら、メタリシウム・ピンヘンセは、メネ基質上にわずかに高い分生子を有していたが、メタリシウム・ロベルツィイよりも、イネ基質培養物から得られたそれらの全体的な分生子収量においてメタリシウムの2種において有意差は推定されない。しかし、メタリシウム・ピンヘーンセは、より低い分生子収量を生み出したメタリシウム・ロバーツイよりもわずかに高い分生子収量を生み出した。この技術の困難な部分は、汚染された芽球胞子接種剤による接種による基質汚染である。したがって、作業中は常に無菌性を確保してください。このデモンストレーションは、学生がプロセス全体の終了につながる可能性のある不器用な間違いなしにテクニックを効率的に再現するのに役立ちます。

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

生物学

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

半翅目腸内における植物ウイルスおよび昆虫ベクタータンパク質の免疫蛍光標識

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

バキュロウイルス昆虫細胞培養システムを用いたアデノ関連ウイルス(AAV)2ベクターの製造と精製のためのプロセス開発

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

単為生殖昆虫、カラショウアブラムシ、 Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

<meta charset="utf8"></head><body>森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌資源の探索

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:森林ウッドボーラーの生物的防除アプリケーションのための野生の Monochamus alternatus 個体群における昆虫病原性真菌の評価

森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...