Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer hort Pome, Hort Stone, e o Programa de Tecnologia e Recursos Humanos para a Indústria (THRIP: TP14062571871) pelo financiamento do projeto.
ORCID: Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette Http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Fonte de cepas fúngicas
<ol><li>Use cepas fúngicas isoladas sul-africanas tanto do M. pinghaense 5 HEID (número de adesão do GenBank: MT367414/MT895630) e M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), coletados de pomares de maçã na província do Cabo Ocidental, África do Sul.</li>
	<li>Culturas de cultivo de cada EPF isolam em 60 g de sabouraud dextrose agar medium, suplementado com 1 g de extrato de levedura (SDAY) e 10 μL de Estreptomicina. NOTA: Incubar culturas ...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. 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Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+used+for+entomopathogenic+fungi:+Hypocreales.">Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).</li><li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+carbon+&amp;+nitrogen+sources+on+the+Trichoderma+viride+(Biofungicide)+and+Beauveria+bassiana+(entomopathogenic+fungi).">Impact of carbon &amp; nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi).</a> European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).</li><li>Burges, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+mycoinsecticides.">Formulation of mycoinsecticides.</a> Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).</li></ol>

A integração bem-sucedida dos agentes microbianos para o controle biológico de importantes pragas de insetos agrícolas em um agroecossistema depende tanto do sucesso quanto da facilidade de produção em massa dos entomopatógenos como o primeiro passo em condições laboratoriais. A produção em massa de EPF é importante para a aplicação em larga escala e disponibilidade de produtos EPF para programas de IPM utilizando controle biológico 9,10,11,12,13.<...

Os fungos entomopatômicos (EPF) ganharam importância como agentes de proteção de culturas no controle biológico de importantes pragas de insetos agrícolas 1,2. Os entomopatógenos, que ocorrem naturalmente no solo, causam epizooóticos nas populações de várias espécies de pragas3. As espécies de EPF são específicas do hospedeiro e representam relativamente poucos riscos em termos de ataque a espécies não-alvo, e não sãotóxiis para o meio ambiente4. A EPF tem um mecanismo único para invadir seu hospedeiro, bem como para propagar e persistir em seu ambiente imediato1. Eles atacam o hospedeiro principalmente através de esporos assexuados que se prendem e penetram na cutícula hospedeira para invadir e proliferar no hemocoel hospedeiro. O hospedeiro eventualmente morre devido ao esgotamento dos nutrientes hemofífonos ou como resultado da toxemia causada pelos metabólitos tóxicos liberados pelo fungo. Após a morte, sob condições ambientais ideais, o fungo emerge na superfície externa (micose exerce) do cadáverhospedeiro 5,6.
Preocupações crescentes com os efeitos negativos dos resíduos químicos na saúde humana, poluição ambiental e desenvolvimento da resistência a pragas levaram ao impulso global de reduzir os insumos de inseticidas de base química e a encontrar estratégias alternativas, novas e sustentáveis para a proteção das culturas e o controle de pragas 6,7,8 . Isso proporcionou oportunidades para desenvolver inseticidas à base de microbianos para uso em programas integrados de Manejo de Pragas (IPM), que são estratégias mais ecologicamente favoráveis do que o controle químico convencional 3,8.
Para desenvolver um agente de controle microbiano bem sucedido para uma praga agrícola, um organismo adequado deve primeiro ser isolado, caracterizado, identificado e sua patogenicidade para a praga alvo confirmada. No entanto, é necessário um método fácil e econômico para a produção em larga escala do agente microbiano para produzir um produto viável para uso em programas de controle biológico 9,10,11,12,13. A produção em massa de quantidades substanciais de entomopatógenos de boa qualidade depende da cepa microbiana, do meio ambiente, da praga-alvo, da formulação, do mercado, da estratégia de aplicação e do produto final desejado 14,15,16. O EPF pode ser produzido em massa usando fermentação de substrato líquido para produzir blastospores ou o processo de fermentação de substrato sólido para produzir conídio aéreo 6,17,18. No entanto, o processo de produção e formulação em massa de entomopatógenos influencia diretamente a virulência, o custo, a vida útil e a eficácia do campo do produto final. Para o uso bem-sucedido no IPM, o processo de produção dos entomopatógenos deve ser fácil de executar, exigir mão-de-obra mínima, produzir uma concentração de alto rendimento de propagules virulentas, viáveis e persistentes, e ser baixo no custo 4,13,14,16.
Compreender os requisitos nutricionais dos entomopatógenos é importante para o cultivo em massa com todos os métodos de cultivo 4,12. Os componentes nutricionais do meio de produção têm impacto significativo nos atributos dos propagules resultantes, incluindo eficácia de biocontrole, rendimento, tolerância à dessecação e persistência 8,19,20,21. A otimização dos procedimentos de produção é projetada para abordar tais fatores22. Para a EPF, os principais requisitos para o bom crescimento, esporulação e produção em massa de conídio fúngico são umidade adequada, temperatura de crescimento ideal, pH, troca de gás de CO2 e O2, e nutrição, incluindo boas fontes de fósforo, carboidratos, carbono e nitrogênio18.
Jaronski e Jackson18 descrevem o método de fermentação de substrato sólido como o método de aproximação mais eficiente e mais próximo do processo natural de produção de EPF em relação ao método de fermentação do substrato líquido porque, em condições naturais, o conidium fúngico é suportado em estruturas eretos sólidas, como a superfície dos cadáveres de insetos. Produtos agrícolas e subprodutos contendo amido são usados principalmente para a produção em massa de fungos hipocrealeanos, pois os fungos prontamente se decompõem o amido através da secreção de enzimas hidrolíticas altamente concentradas de suas pontas hífas, para penetrar a substância sólida e para acessar os nutrientes presentes na substância 11,17,18,23 . Os produtos de grãos também fornecem os requisitos para a produção saudável de biomassa, pois, quando são hidratados e esterilizados, os substratos podem absorver mais nutrientes de qualquer meio líquido 16,18,24.
Anteriormente, vários estudos tentaram cultivar espécies de EPF como Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas e alguns dos metarhizium anisopliae (Metschn.) O complexo de espécies de Sorokin isola-se em vários substratos 16,23,24. Tais isolados produzidos em massa e comercialmente desenvolvidos incluem o Músculo® Verde (cepa IMI 330189), desenvolvido a partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 strain ICIPE69), e Real Metarhizium 69 (L9281), desenvolvidos a partir de M. anisopliae, e Banda larga® (cepa PPRI 5339) e Eco-Bb®, desenvolvido a partir de B. bassiana25,26 . No entanto, tentativas limitadas foram feitas à cultura de massa Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber e Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Esses dois isolados foram selecionados em estudo anterior como o mais eficaz para o controle do mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Portanto, o presente estudo teve como objetivo formular e produzir em massa um número suficiente de propagules infecciosos resilientes dos isolados locais de M. robertsii e M. pinghaense para aplicação comercial contra pragas de insetos. O método de fermentação de substrato sólido foi utilizado para produzir em massa a conídia fúngica para ambos os isolados de EPF. Dois métodos de inoculação de EPF, utilizando suspensões conidiais e a cultura fúngica líquida de blastospores, foram utilizados para inocular os substratos sólidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

Fungos entomopatômicos do complexo de espécies anisopliae metarhizium ganharam importância como agentes de controle biológico de pragas de insetos agrícolas. O aumento da resistência a pragas a inseticidas químicos, as crescentes preocupações com os efeitos negativos dos inseticidas na saúde humana e a poluição ambiental dos pesticidas levaram a um impulso global para encontrar novas estratégias sustentáveis para a proteção das culturas e o controle de pragas. Anteriormente, foram conduzidas tentativas de cultura de massa, tais espécies de fungos entomopatômicos (EPF) como Beauveria bassiana . No entanto, apenas tentativas limitadas foram conduzidas à cultura de massa Metarhizium robertsii e M. pinghaense para uso contra pragas de insetos. Este estudo teve como objetivo produzir em massa um número suficiente de propagules infecciosos resilientes de isolados sul-africanos de M. robertsii e M. pinghaense para aplicação comercial. Três produtos agrícolas de grãos, aveia em flocos, cevada em flocos e arroz, foram utilizados como substratos de fermentação sólida da EPF. Dois métodos de inoculação, suspensões conidiais e a cultura fúngica líquida de blastospores foram usados para inocular os substratos sólidos. Observou-se que a inoculação por suspensões conidiais foi relativamente menos eficaz, uma vez que foram observados níveis de contaminação aumentados nos substratos sólidos em relação ao uso do método de inoculação blastospore. A aveia flocada não foi um substrato de crescimento adequado tanto para M. robertsii quanto para M. pinghaense, uma vez que nenhuma conidia seca foi colhida do substrato. A cevada flocada foi encontrada para favorecer a produção de M. robertsii conidia sobre a de M. pinghaense, e uma média de 1,83 g ± 1,47 g de M. robertsii conidia seca e zero gramas de M. pinghaense conidia foi colhida do substrato. Os grãos de arroz foram encontrados para favorecer a produção em massa conidial tanto dos isolados M. pinghaense quanto M. robertsii , com média de 8,2 g ± 4,38 g e 6 g ± 2 g colhidas do substrato, respectivamente.

Um declínio na massa de conteúdo das culturas sobre arroz tanto para o M. pinghaense quanto para o M. robertsii foi observado ao longo do tempo durante a fase de secagem das culturas fúngicas, sem, ou pouco, mudança sendo observada na massa uma vez que as culturas estavam secas (Figura 5). O pó de conidia fúngica seca colhida tanto do M. pinghaense quanto do M. robertsii é mostrado na Figura 6.
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Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Fungos entomopatômicos ganharam importância como agentes de controle biológico de pragas de insetos agrícolas. Neste estudo, a produção em massa de um número suficiente de propagules infecciosos resilientes de isolados sul-africanos tanto de Metarhizium robertsii quanto de M. pinghaense para aplicação comercial contra pragas de insetos foi realizada com sucesso utilizando produtos agrícolas de grãos.

Produção em massa de Fungos Entomopatômicos, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, para Aplicação Comercial Contra Pragas de Insetos

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Este método fornece novas informações sobre como produzir em massa conidia infecciosa de fungos entomopatômicos para controlar pragas de insetos importantes em agrossistemas comerciais, dada a situação atual em que a maioria dos inseticidas são eliminados gradualmente devido a preocupações de seu efeito tóxico sobre o meio ambiente e a saúde humana. A técnica descreve o método utilizado para garantir o rendimento ideal da conidia EPF durante a produção em massa. O método é útil para o manejo integrado de pragas e controle biológico, fornecendo uma visão sobre a eficácia da conidia produzida em massa para o manejo em larga escala de pragas prejudiciais de insetos resistentes a inseticidas nos agrosistematos.Este procedimento foi desenvolvido e demonstrado pelo Dr. Letodi Luki Mathulwe, Dr. Nomakholwa Faith Stokwe e pela professora Antoinette Paula Malan. Aqueça um litro de água destilada e desligue o fogo antes de chegar ao ponto de ebulição. Agora, adicione 30 gramas de glicose, quatro gramas de fosfato de potássio dibásico, 20 gramas de extrato de levedura, 15 mililitros de licor de milho íngreme, e leve o conteúdo para ferver suavemente por dois a três minutos.Despeje um total de 100 mililitros do meio em nove frascos diferentes de 250 mililitros. Coloque um plugue de algodão em cada frasco e cubra a lã de algodão com papel alumínio como rolha. Autoclave o meio nos frascos por 55 minutos a 121 graus Celsius.Mais tarde, deixe o meio nos frascos esfriar e adicione 10 miligramas por mililitro de estreptomicina ao meio em cada frasco. Colete de duas a três alças bacterianas de conidia fúngica de placas de cultura fúngica de duas a três semanas de idade para ambos os isolados do EPF. Transfira a conidia fúngica para cada 100 mililitros de mídia líquida nos frascos de 250 mililitros em condições estéreis e selar os frascos.Incubar os frascos de cultura líquida a aproximadamente 25 graus Celsius em um agitador orbital a 140 RPM por três dias e cessar a incubação uma vez que as culturas mostram sinais de alta turbidez com o crescimento de blastospore fúngico. Para detectar qualquer possível contaminação bacteriana das culturas, desenhe uma amostra de 100 microliters de cada frasco de cultura líquida após 24 horas de incubação e placa em três placas SDA por isolação. Incubar as placas por 48 horas a uma temperatura controlada de mais ou menos 25 graus Celsius.Use um pequeno tubo de resíduo de cloreto de polivinil para criar um pescoço para o saco de fermentação na extremidade aberta do saco de autoclave e use fita autoclave para fixar o tubo. Feche o tubo com um plugue de algodão estéril para permitir a troca de gás suficiente durante a fermentação. Use arroz branco de grão longo parboiled como um meio de substrato sólido para os blastospores tanto de Metarhizium pinghaense quanto de Metarhizium robertsii.Para cada saco de fermentação, adicione um quilo de arroz e 300 mililitros de água destilada estéril. Misture delicadamente o conteúdo dos sacos de fermentação. Coloque-os em sacos de autoclave externos em uma posição vertical e autoclave a 121 graus Celsius por 55 minutos.Após a autoclavagem, deixe os substratos esfriarem por cerca de 45 minutos em condições estéreis. Remova o fechamento de cada um dos frascos de cultura líquida tanto do Metarhizium pinghaense quanto do Metarhizium robertsii sob um fluxo laminar e flame a borda de cada frasco por 10 segundos. Despeje 100 mililitros de culturas líquidas nos sacos de fermentação removendo os plugues de algodão de seus pescoços.Coloque os plugues de algodão de volta e cubra a parte superior do pescoço do saco com papel cirúrgico preso com um elástico. Torça a parte superior da bolsa e misture o conteúdo da bolsa sacudindo e manipulando o substrato por massagem. Incubar as sacolas a cerca de 25 graus Celsius, achatando o substrato nos sacos para evitar a formação de leitos grossos.Dois a três dias após a inoculação e incubação, quando ocorreu o crescimento micelial visível e a ligação do substrato pelo fungo, quebraram o substrato nos sacos de fermentação massageando o conteúdo das sacolas. Após a fermentação, transfira as culturas esporuladas em sacos de papel marrom de 26 a 30 kg e seque as culturas fúngicas por 10 a 12 dias antes de seu uso em ensaios. Para melhorar a resistência à tração dos sacos de papel, corte horizontalmente 1/3 da parte superior do saco e forra a parte inferior do saco.Destrua suavemente o substrato em cada saco de fermentação. Corte o canto de cada saco e transfira lentamente toda a cultura para os sacos de papel através do espaço deixado pelo canto cortado. Rotule cada saco de papel, dobre sobre a extremidade superior de cada saco duas vezes e feche com grampos para criar uma estrutura de tenda triangular.Coloque os sacos em racks de secagem de arame para permitir a secagem adequada, mesmo secando a uma temperatura controlada de cerca de 25 graus Celsius e baixa umidade de 30 a 40% Colher conidia fúngica das culturas usando três peneiras aninhadas montadas em uma panela de coleta. Carregue lentamente a amostra de cultura seca na malha ETS número 35 e peneira. Coloque uma tampa na peneira para evitar a liberação de conidia fúngica no ar.Adicione 10 a 12 bolinhas de vidro nas peneiras para auxiliar a passagem da coníddia fúngica através das telas de malha e evitar a retenção da conidia na peneira, o que pode resultar em redução da recuperação dos esporos. Fita e veda as juntas de peneira usando fita elétrica. Coloque as peneiras em um agitador vibratório equipado com uma almofada pegajosa para fixar a panela de coleta e peneiras por 20 a 25 minutos a um movimento de 560 a 640 vibrações por minuto.Remova as peneiras de teste da panela de coleta, colete conidia e armazene as conidia coletadas em sacos de zíper herméticos e impermeáveis para armazenamento a longo prazo. Uma média de aproximadamente 1,83 gramas de Metarhizium robertsii conidia seca foi colhida do substrato de cevada em flocos, enquanto zero Metarhizium pinghaense foi colhido do substrato. Nenhuma coníddia fúngica seca foi colhida do substrato de aveia em flocos para qualquer espécie de Metarhizium.Observou-se diferença significativa entre as duas espécies de Metarhizium na conídio média estimada por grama colhida a partir dos grãos de arroz. Metarhizium robertsii tinha uma contagem média de conídios ligeiramente maior por grama do que Metarhizium pinghaense. Não foi observada diferença significativa entre as duas espécies de Metarhizium no número estimado de conídios presentes no substrato de arroz gasto.No entanto, Metarhizium pinghaense tinha conidia ligeiramente maior no substrato de arroz do que Metarhizium robertsii Nenhuma diferença significativa é estimada nas duas espécies de Metarhizium em seu rendimento geral de conídio obtido a partir das culturas de substrato de arroz. No entanto, metarhizium pinghaense produziu um rendimento de conidia ligeiramente maior do que Metarhizium robertsii, que produziu um rendimento conidial menor. A parte desafiadora desta técnica é a contaminação do substrato através da inoculação com um inóculo de blastospores contaminados.Assim, sempre garanta a esterilidade durante o trabalho. Essa demonstração ajuda os alunos a reproduzir eficientemente a técnica sem erros desajeitados que podem resultar no término de todo o processo.

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Um método para produção de proteína recombinante em células de inseto mCD1d.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Biologia

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Produção eficiente e Purificação de recombinante murino Kindlin-3 a partir de células de insetos de Estudos biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Marcação por imunofluorescência de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de Hemiptera

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Desenvolvimento de processos para a produção e purificação do vírus associado ao Adeno (AAV)2 Vetor usando o sistema de cultura de células de baculovírus-inseto

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

Avaliação do Efeito Afidicida de Fungos Entomopatogênicos Contra Insetos Partenogenéticos, Pulgão Mostarda, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Explorando recursos de fungos entomopatogênicos de brocas de madeira florestal

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avaliação de fungos entomopatogênicos em populações selvagens de Monochamus alternatus para aplicações de biocontrole em brocas florest

Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...