Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Хорта Поме, Хорта Стоуна и Программу технологий и человеческих ресурсов для промышленности (THRIP: TP14062571871) за финансирование проекта.
ORCID: Летоди Л. Матулве http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Антуанетта. Малан http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Номахолва Ф. Стокве http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Источник грибковых штаммов
<ol><li>Используйте южноафриканские изолированные грибковые штаммы как M. pinghaense 5 HEID (номер присоединения GenBank: MT367414/MT895630), так и M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), собранные из яблоневых садов в Западно-Капской провинции, Южная Африка.</li>
	<li>Выращива...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+biology+and+control+of+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae),+with+special+reference+to+biological+control+using+entomopathogenic+fungi+and+nematodes.">A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes.</a> African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).</li><li>Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production,+yield,+quality,+formulation+and+efficacy+of+entomopathogenic+Metarhizium+anisopliae+conidia.">Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia.</a> Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).</li><li>Banu, J. G., Rajalakshmi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+media+for+mass+multiplication+of+entomopathogenic+fungi.">Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi.</a> Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).</li><li>Roberts, D. W., Humber, R. A., Cole, G. T., Kendrick, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomogenous+fungi.">Entomogenous fungi.</a> Biology of Conidial Fungi. , 201-236 (1981).</li><li>Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+formulation+and+application+of+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+for+insect+control.+Current+status.">Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status.</a> Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).</li><li>Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+solid+substrates+on+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae+entomopathogens.">Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens.</a> The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , 8-12 (2010).</li><li>Prasad, C. S., Pal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+and+economics+of+entomopathogenic+fungus,+Beauveria+bassiana,+Metarhizium+anisopliae+and+Verticillium+lecanii+on+agricultural+and+industrial+waste.">Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste.</a> Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).</li><li>Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+nematodes+for+plant+protection.">Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).</li><li>Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+blastospore+of+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+in+a+submerged+batch+culture.">Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture.</a> Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).</li><li>Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products.">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products.</a> The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).</li><li>Latifian, M., Rad, B., Amani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+Metarhizium+anisopliae+by+using+agricultural+products+based+on+liquid-solid+diphasic+method+for+date+palm+pest+control.">Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control.</a> International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).</li><li>Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+(Metarhizium+anisopliae)+using+different+grains+as+a+substrate.">Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).</li><li>Jackson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nutritional+conditions+for+the+liquid+culture+production+of+effective+fungal+biological+control+agents.">Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).</li><li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycopesticides+production+by+fermentation.+Potential+and+challenges.">Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges.</a> Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).</li><li>Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products+and+by+products.">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products.</a> African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).</li><li>Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verticillium+lecanii+spore+production+in+solid-state+and+liquid-state+fermentations.">Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations.</a> Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).</li><li>Jaronski, S. T., Jackson, M. A., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+Hypocreales.">Mass production of entomopathogenic Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. , 255-284 (2012).</li><li>Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+nutrition+on+spore+yields+for+various+fungal+entomopathogens+in+liquid+culture.">The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).</li><li>El Damir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+growing+media+and+water+volume+on+conidial+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).</li><li>Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+grains+as+solid+substrates+on+sporulation,+viability+and+pathogenicity+of+Metarhizium+anisopliae+(Metschnikoff)+Sorokin.">Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin.</a> Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).</li><li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whey+for+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).</li><li>Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+suitable+medium+for+mass+multiplication+of+entomofungal+pathogens.">Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens.</a> Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).</li><li>Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rice+by-products,+incubation+time,+and+photoperiod+for+solid+state+mass+multiplication+of+the+biocontrol+agents+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).</li><li>Price, R. E., M&#252;ller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+trial+of+a+Metarhizium+anisopliae+var.+acridum+mycoinsecticide+for+the+control+of+the+red+locust+in+a+recognised+outbreak+area.">The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area.</a> International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).</li><li>Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+control+of+phytophagous+invertebrate+pests+in+South+Africa.+Current+status+and+future+prospects.">Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+used+for+entomopathogenic+fungi:+Hypocreales.">Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).</li><li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+carbon+&amp;+nitrogen+sources+on+the+Trichoderma+viride+(Biofungicide)+and+Beauveria+bassiana+(entomopathogenic+fungi).">Impact of carbon &amp; nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi).</a> European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).</li><li>Burges, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+mycoinsecticides.">Formulation of mycoinsecticides.</a> Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).</li></ol>

Успешная интеграция микробных агентов для биологической борьбы с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями в агроэкосистему зависит как от успеха, так и от простоты массового производства энтомопатогенов в качестве первого шага в лабораторных условиях. Массовое произво?...

Энтомопатогенные грибы (EPF) приобрели важное значение в качестве средств защиты растений в биологической борьбе с важными сельскохозяйственными насекомыми-вредителями 1,2. Энтомопатогены, встречающиеся естественным образом в почве, вызывают эпизоотии в популяциях различных видов вредителей3. Виды EPF специфичны для хозяина и представляют относительно небольшой риск с точки зрения нападения на нецелевые виды, и они нетоксичны для окружающей среды4. EPF имеют уникальный механизм для вторжения в своего хозяина, а также для распространения и сохранения в их ближайшем окружении1. Они атакуют хозяина в основном через бесполые споры, которые прикрепляются и проникают в кутикулу хозяина, чтобы вторгнуться и размножаться в гемокоэле хозяина. Хозяин в конечном итоге умирает из-за истощения питательных веществ гемолимфы или в результате токсикоза, вызванного токсичными метаболитами, выделяемыми грибком. После смерти, в идеальных условиях окружающей среды, грибок появляется на внешней поверхности (явный микоз) трупа хозяина 5,6.
Растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия химических остатков на здоровье человека, загрязнения окружающей среды и развития устойчивости к вредителям привела к глобальному стремлению сократить потребление инсектицидов на химической основе и найти альтернативные, новые и устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями 6,7,8 . Это предоставило возможности для разработки инсектицидов на основе микробов для использования в программах комплексной борьбы с вредителями (IPM), которые являются более экологически благоприятными стратегиями, чем обычный химический контроль 3,8.
Чтобы разработать успешный микробный агент борьбы с сельскохозяйственным вредителем, подходящий организм должен быть сначала выделен, охарактеризован, идентифицирован и подтверждена его патогенность для целевого вредителя. Однако для получения жизнеспособного продукта для использования в программах биологического контроля 9,10,11,12,13 требуется простой и экономически эффективный метод крупномасштабного производства микробного агента. Массовое производство значительных количеств высококачественных энтомопатогенов зависит от микробного штамма, окружающей среды, целевого вредителя, состава, рынка, стратегии применения и желаемого конечного продукта 14,15,16. EPF может быть массово произведен с использованием ферментации жидкого субстрата для получения бластоспор или процесса ферментации твердого субстрата для получения воздушных конидий 6,17,18. Однако процесс массового производства и рецептуры энтомопатогенов напрямую влияет на вирулентность, стоимость, срок годности и полевую эффективность конечного продукта. Для успешного использования в IPM процесс производства энтомопатогенов должен быть простым в эксплуатации, требовать минимальной рабочей силы, производить высокую концентрацию вирулентных, жизнеспособных и стойких пропагул и быть недорогим 4,13,14,16.
Понимание потребностей в питании энтомопатогенов важно для массового выращивания всеми методами культивирования 4,12. Питательные компоненты производственной среды оказывают значительное влияние на характеристики полученных пропагул, включая эффективность биоконтроля, выход, устойчивость к высыханию и стойкость 8,19,20,21. Оптимизация производственных процедур предназначена для устранения таких факторов22. Для EPF основными требованиями для хорошего роста, споруляции и массового производства грибковых конидий являются достаточная влажность, оптимальная температура роста, рН, газообмен CO2 и O2 и питание, включая хорошие источники фосфора, углеводов, углерода и азота18.
Jaronski и Jackson18 описывают метод ферментации твердого субстрата как наиболее эффективный и наиболее близкий метод приближения к естественному процессу производства EPF по сравнению с методом ферментации жидкого субстрата, поскольку в естественных условиях грибковый конидиум переносится на твердые прямостоячие структуры, такие как поверхность трупов насекомых. Сельскохозяйственные продукты и побочные продукты, содержащие крахмал, в основном используются для массового производства гипокреальных грибов, поскольку грибы легко разлагают крахмал путем секреции высококонцентрированных гидролитических ферментов из своих гифальных кончиков, проникают в твердое вещество и получают доступ к питательным веществам, присутствующим в веществе 11,17,18,23 . Зерновые продукты также обеспечивают требования для здорового производства биомассы, потому что, когда они гидратируются и стерилизуются, субстраты могут поглощать дополнительные питательные вещества из любой жидкой среды 16,18,24.
Ранее в нескольких исследованиях предпринимались попытки массового культивирования видов EPF, таких как Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Виегас и некоторые из Metarhizium anisopliae (Metschn.) Сорокинский видовой комплекс изолирует на различных субстратах 16,23,24. К таким массово производимым и коммерчески разработанным изолятам относятся Green Muscle® (штамм IMI 330189), разработанный из M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 штамм ICIPE69), и Real Metarhizium 69 (L9281), разработанный из M. anisopliae, и Broadband® (штамм PPRI 5339) и Eco-Bb®, разработанный из B. bassiana25,26 . Однако были предприняты ограниченные попытки массовой культуры Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber и Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Эти два изолята были выбраны в предыдущем исследовании как наиболее эффективные для борьбы с мучнистым червецом, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Поэтому настоящее исследование направлено на формулирование и массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул местных изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей. Метод ферментации твердого субстрата был использован для массового получения грибковых конидий для обоих изолятов EPF. Два метода инокуляции EPF, с использованием конидиальных суспензий и жидкой грибковой культуры бластоспор, были использованы для инокуляции твердых субстратов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

Энтомопатогенные грибы видового комплекса Metarhizium anisopliae приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. Повышение устойчивости вредителей к химическим инсектицидам, растущая обеспокоенность по поводу негативного воздействия инсектицидов на здоровье человека и загрязнение окружающей среды пестицидами привели к глобальному стремлению найти новые устойчивые стратегии защиты растений и борьбы с вредителями. Ранее предпринимались попытки массовой культивации таких энтомопатогенных видов грибов (EPF), как Beauveria bassiana . Однако были предприняты лишь ограниченные попытки массового культивирования Metarhizium robertsii и M. pinghaense для использования против насекомых-вредителей. Это исследование было направлено на массовое получение достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов M. robertsii и M. pinghaense для коммерческого применения. Три сельскохозяйственных зерновых продукта, слоеный овес, шелушащийся ячмень и рис, были использованы в качестве твердых ферментационных субстратов EPF. Для инокуляции твердых субстратов использовали два метода инокуляции, конидиальные суспензии и жидкую грибковую культуру бластоспор. Было отмечено, что инокуляция с использованием конидиальных суспензий была относительно менее эффективной, поскольку на твердых субстратах наблюдались повышенные уровни загрязнения по сравнению с использованием метода инокуляции бластоспор. Было обнаружено, что шелушащийся овес не является подходящим субстратом для роста как для M. robertsii , так и для M. pinghaense, поскольку с субстрата не собирали сухих конидий. Было обнаружено, что шелушеный ячмень благоприятствует производству M. robertsii conidia по сравнению с M. pinghaense, и в среднем из субстрата было собрано 1,83 г ± 1,47 г сухой M. robertsii conidia и ноль граммов M. pinghaense conidia. Было обнаружено, что рисовые зерна благоприятствуют конидиальному массовому производству изолятов M. pinghaense и M. robertsii , в среднем 8,2 г ± 4,38 г и 6 г ± 2 г, собранных из субстрата, соответственно.

Снижение массы содержания культур на рисе как для M. pinghaense , так и для M. robertsii наблюдалось с течением времени во время стадии сушки грибковых культур, при этом никаких или незначительных изменений в массе наблюдалось после того, как культуры были сухими (рисунок 5...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Энтомопатогенные грибы приобрели значение в качестве агентов биологического контроля сельскохозяйственных насекомых-вредителей. В данном исследовании было успешно проведено массовое производство достаточного количества устойчивых инфекционных пропагул южноафриканских изолятов как Metarhizium robertsii , так и M. pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей с использованием сельскохозяйственных зерновых продуктов.

Массовое производство энтомопатогенных грибов Metarhizium robertsii и Metarhizium pinghaense для коммерческого применения против насекомых-вредителей

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Этот метод предоставляет новую информацию о том, как массово производить инфекционные конидии энтомопатогенных грибов для борьбы с важными насекомыми-вредителями в коммерческих агроэкосистемах, учитывая нынешнюю ситуацию, когда большинство инсектицидов постепенно выводятся из употребления из-за опасений их токсического воздействия на окружающую среду и здоровье человека. Методика описывает метод, используемый для обеспечения оптимального выхода КОНИДИЙ EPF при массовом производстве. Этот метод полезен для комплексной борьбы с вредителями и биологической борьбы, поскольку дает представление об эффективности массово производимых конидий для крупномасштабного управления вредными насекомыми-вредителями, устойчивыми к инсектицидам, в агроэкосистемах.Эта процедура была разработана и продемонстрирована доктором Летоди Луки Матулве, доктором Номахолвой Фейт Стокве и профессором Антуанеттой Паулой Малан. Нагрейте один литр дистиллированной воды и выключите огонь до достижения точки кипения. Теперь добавьте 30 граммов глюкозы, четыре грамма двухосновного фосфата калия, 20 граммов дрожжевого экстракта, 15 миллилитров кукурузного крутого ликера и доведите содержимое до мягкого кипения в течение двух-трех минут.Налейте в общей сложности 100 миллилитров среды в девять различных 250-миллилитровых колб. Поместите валотную пробку на каждую колбу и накройте вату алюминиевой фольгой в качестве пробки. Автоклав среды в колбах в течение 55 минут при 121 градусе Цельсия.Затем дайте среде в колбах остыть и добавьте 10 миллиграммов на миллилитр стрептомицина к среде в каждой колбе. Соберите две-три бактериальные петли грибковых конидий из двух-трехнедельных пластин грибковых культур для обоих изолятов EPF. Перенесите грибковые конидии на каждые 100 миллилитров жидкой среды в колбах по 250 миллилитров в стерильных условиях и запечатайте колбы.Инкубируйте колбы с жидкими культурами примерно при 25 градусах Цельсия на орбитальном шейкере при 140 оборотах в минуту в течение трех дней и прекратите инкубацию, как только культуры проявят признаки высокой мутности с ростом грибковой бластоспоры. Чтобы обнаружить любое возможное бактериальное загрязнение от культур, возьмите образец из 100 микролитров из каждой жидкостной колбы культуры после 24 часов инкубации и пластину на трех пластинах SDA на изолят. Инкубировать пластины в течение 48 часов при контролируемой температуре плюс-минус 25 градусов Цельсия.Используйте небольшую поливинилхлоридную отходную трубу для создания горловины для ферментационного мешка на открытом конце автоклавного мешка и используйте автоклавную ленту для закрепления трубы. Закройте трубу стерильной ватный пробкой, чтобы обеспечить достаточный газообмен во время ферментации. Используйте пропаренный длиннозернистый белый рис в качестве твердой субстратной среды для бластоспор как Metarhizium pinghaense, так и Metarhizium robertsii.На каждый ферментационный мешок добавьте один килограмм риса и 300 миллилитров стерильной дистиллированной воды. Аккуратно перемешайте содержимое ферментационных пакетов. Поместите их во внешние автоклавные мешки в вертикальном положении и автоклав при 121 градусе Цельсия на 55 минут.После автоклавирования дайте субстратам остыть в течение примерно 45 минут в стерильных условиях. Снимите крышку каждой из колб для жидких культур Metarhizium pinghaense и Metarhizium robertsii под ламинарной струей и воспламените ободок каждой колбы в течение 10 секунд. Налейте 100 миллилитров жидких культур в ферментационные мешки, удалив ваты с их шейки пробки.Поместите ватные пробки обратно и покройте верхнюю часть шеи сумки хирургической бумагой, закрепленной резинкой. Поверните верхнюю часть сумки и перемешайте содержимое пакета, встряхивая и манипулируя субстратом путем массажа. Инкубируйте мешки при температуре около 25 градусов по Цельсию, сплющивая субстрат в мешках, чтобы предотвратить образование толстых слоев.Через два-три дня после прививки и инкубации, когда произошел видимый рост мицелиала и связывание субстрата грибком, разорвите субстрат в ферментационных мешках, массируя содержимое пакетов. После ферментации переместите спорулированные культуры в 26-30-килограммовые коричневые бумажные пакеты и высушите грибковые культуры в течение 10-12 дней до их использования в испытаниях. Чтобы улучшить прочность бумажных пакетов на растяжение, горизонтально отрежьте 1/3 верхней части пакета и выровняйте нижнюю часть пакета.Аккуратно рассыпьте субстрат в каждом ферментационном мешочке. Отрежьте угол каждого пакета и медленно перенесите всю культуру в бумажные пакеты через пространство, оставленное отрезанным углом. Пометьте каждый бумажный пакет, сложите верхний конец каждого пакета дважды и закройте скобами, чтобы создать треугольную структуру палатки.Поместите мешки на сушильные стеллажи для проволоки, чтобы обеспечить правильную, равномерную сушку при контролируемой температуре около 25 градусов по Цельсию и низкой влажности от 30 до 40% Собирайте грибковые конидии из культур с использованием трех вложенных сит, установленных на поддоне для сбора. Медленно загрузите образец сухой культуры на сетку ETS No 35 и сито. Поместите крышку на сито, чтобы предотвратить выброс грибковых конидий в воздух.Добавьте от 10 до 12 стеклянных шариков в сита, чтобы помочь прохождению грибковых конидий через сетчатые экраны и избежать удержания конидий в сите, что может привести к снижению восстановления спор. Заклейте лентой и ситовые соединения с помощью электрической ленты. Поместите сита на вибрационный шейкер, оснащенный липкой прокладкой, чтобы закрепить поддон для сбора и сита в течение 20-25 минут со скоростью от 560 до 640 вибраций в минуту.Извлеките тестовые сита из поддона для сбора, соберите конидии и храните собранные конидии в герметичных и водонепроницаемых пакетах-молниях для длительного хранения. В среднем примерно 1,83 грамма сухого Metarhizium robertsii conidia было собрано из шелушащегося ячменного субстрата, тогда как из субстрата было собрано ноль Metarhizium pinghaense. Ни один сухой грибковый конидий не был собран из шелушащегося овсяного субстрата ни для одного из видов Metarhizium.Существенная разница наблюдалась между двумя видами Metarhizium в расчетном среднем конидии на грамм, собранный из рисовых зерен. Metarhizium robertsii имел немного более высокое среднее количество конидий на грамм, чем Metarhizium pinghaense. Между двумя видами Metarhizium не наблюдалось существенной разницы в предполагаемом количестве конидий, присутствующих на отработанном рисовом субстрате.Тем не менее, Metarhizium pinghaense имел несколько более высокую конидию на рисовом субстрате, чем Metarhizium robertsii Нет существенных различий в двух видах Metarhizium в их общей урожайности конидий, полученных из культур рисового субстрата. Тем не менее, Metarhizium pinghaense дал немного более высокий выход конидий, чем Metarhizium robertsii, который дал более низкий конидиальный выход. Сложной частью этого метода является загрязнение субстрата через инокуляцию загрязненным бластоспором инокулята.Таким образом, всегда обеспечивайте стерильность во время работы. Эта демонстрация помогает учащимся эффективно воспроизводить технику без неуклюжих ошибок, которые могут привести к завершению всего процесса.

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Способ получения рекомбинантного белка mCD1d в клетках насекомых.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Эффективное производство и очистка рекомбинантного мышиного Kindlin-3 от клетках насекомых биофизической исследований

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Применение Membrane и клеточной стенки селективные флуоресцентные красители для Live-Cell Imaging filamentous Грибы

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Иммунофлюоресцентная маркировка белков вирусов растений и насекомых-векторов в полужесткокрылых кишках

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Разработка процесса производства и очистки переносчика аденоассоциированного вируса (AAV)2 с использованием системы культивирования клеток бакуловирус-насекомое

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Выделение и отбор энтомопатогенных грибов из образцов почвы и оценка грибковой вирулентности против насекомых-вредителей

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

Сравнение методов выделения энтомопатогенных грибов из образцов почвы

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

Оценка афидицидного действия энтомопатогенных грибов в отношении партеногенетического насекомого, горчичной тли, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Изучение ресурсов энтомопатогенных грибов лесных древоточцев

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

<meta charset="utf8"></head><body>В центре внимания автора: Оценка энтомопатогенных грибов в популяциях диких Monochamus alternatus для применения в биоконтроле у лесных древоточцев

Выделение, поведенческая идентификация и оценка патогенности энтомопатогенных грибов из лесного древоточца

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...