Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Los autores desean agradecer a Hort Pome, Hort Stone y al Programa de Tecnología y Recursos Humanos para la Industria (THRIP: TP14062571871) por financiar el proyecto.
ORCID: Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Fuente de cepas fúngicas
<ol><li>Utilice cepas fúngicas aisladas sudafricanas de M. pinghaense 5 HEID (número de acceso de GenBank: MT367414/MT895630) y M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), recolectadas de huertos de manzanas en la provincia occidental del Cabo, Sudáfrica.</li>
	<li>Cultivar cultivos de cada aislado de EPF en 60 g de medio de agar dextrosa Sabouraud, complementado con 1 g de extracto de levadura (SDAY) y 10 μL de estreptomicina. NOTA: Incubar c...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+biology+and+control+of+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae),+with+special+reference+to+biological+control+using+entomopathogenic+fungi+and+nematodes.">A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes.</a> African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).</li><li>Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production,+yield,+quality,+formulation+and+efficacy+of+entomopathogenic+Metarhizium+anisopliae+conidia.">Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia.</a> Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).</li><li>Banu, J. 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S., Pal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+and+economics+of+entomopathogenic+fungus,+Beauveria+bassiana,+Metarhizium+anisopliae+and+Verticillium+lecanii+on+agricultural+and+industrial+waste.">Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste.</a> Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).</li><li>Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+nematodes+for+plant+protection.">Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).</li><li>Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycopesticides+production+by+fermentation.+Potential+and+challenges.">Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges.</a> Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).</li><li>Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products+and+by+products.">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products.</a> African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).</li><li>Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. 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Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+used+for+entomopathogenic+fungi:+Hypocreales.">Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).</li><li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+carbon+&amp;+nitrogen+sources+on+the+Trichoderma+viride+(Biofungicide)+and+Beauveria+bassiana+(entomopathogenic+fungi).">Impact of carbon &amp; nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi).</a> European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).</li><li>Burges, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+mycoinsecticides.">Formulation of mycoinsecticides.</a> Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).</li></ol>

La integración exitosa de agentes microbianos para el control biológico de importantes plagas de insectos agrícolas en un agroecosistema depende tanto del éxito como de la facilidad de producción en masa de los entomopatógenos como primer paso en condiciones de laboratorio. La producción en masa de EPF es importante para la aplicación a gran escala y la disponibilidad de productos EPF para programas de MIP utilizando control biológico 9,10,11,12,13....

Los hongos entomopatógenos (EPF) han ganado importancia como agentes protectores de cultivos en el control biológico de importantes plagas de insectos agrícolas 1,2. Los entomopatógenos, que se producen de forma natural en el suelo, causan epizootias en las poblaciones de diversas especies de plagas3. Las especies de EPF son específicas del huésped y plantean relativamente pocos riesgos en términos de atacar a especies no objetivo, y no son tóxicas para el medio ambiente4. Los EPF tienen un mecanismo único para invadir su huésped, así como para propagarse y persistir en su entorno inmediato1. Atacan al huésped principalmente a través de esporas asexuales que se adhieren y penetran en la cutícula del huésped para invadir y proliferar en el hemocoel del huésped. El huésped finalmente muere debido al agotamiento de los nutrientes de la hemolinfa o como resultado de la toxemia causada por los metabolitos tóxicos liberados por el hongo. Después de la muerte, en condiciones ambientales ideales, el hongo emerge en la superficie externa (micosis manifiesta) del cadáver huésped 5,6.
La creciente preocupación por los efectos negativos de los residuos químicos en la salud humana, la contaminación ambiental y el desarrollo de resistencia a las plagas ha llevado a la campaña mundial para reducir los insumos de insecticidas de base química y encontrar estrategias alternativas, novedosas y sostenibles para la protección de cultivos y el control de plagas 6,7,8 . Esto ha brindado oportunidades para desarrollar insecticidas a base de microbios para su uso en programas de Manejo Integrado de Plagas (MIP), que son estrategias ecológicamente más favorables que el control químico convencional 3,8.
Para desarrollar un agente de control microbiano exitoso para una plaga agrícola, primero se debe aislar, caracterizar, identificar y confirmar su patogenicidad para la plaga objetivo. Sin embargo, se requiere un método fácil y rentable para la producción a gran escala del agente microbiano para producir un producto viable para su uso en programas de control biológico 9,10,11,12,13. La producción en masa de cantidades sustanciales de entomopatógenos de buena calidad depende de la cepa microbiana, el medio ambiente, la plaga objetivo, la formulación, el mercado, la estrategia de aplicación y el producto final deseado 14,15,16. EPF se puede producir en masa utilizando la fermentación de sustrato líquido para producir blastosporas o el proceso de fermentación de sustrato sólido para producir conidios aéreos 6,17,18. Sin embargo, el proceso de producción y formulación en masa de entomopatógenos influye directamente en la virulencia, el costo, la vida útil y la eficacia de campo del producto final. Para un uso exitoso en MIP, el proceso de producción de los entomopatógenos debe ser fácil de ejecutar, requerir mano de obra mínima, producir una concentración de alto rendimiento de propágulos virulentos, viables y persistentes, y ser de bajo costo 4,13,14,16.
Comprender los requerimientos nutricionales de los entomopatógenos es importante para el cultivo masivo con todos los métodos de cultivo 4,12. Los componentes nutricionales del medio de producción tienen un impacto significativo en los atributos de los propágulos resultantes, incluyendo la eficacia del biocontrol, el rendimiento, la tolerancia a la desecación y la persistencia 8,19,20,21. La optimización de los procedimientos de producción está diseñada para abordar estos factores22. Para la EPF, los principales requisitos para un buen crecimiento, esporulación y producción en masa de conidios fúngicos son la humedad adecuada, la temperatura óptima de crecimiento, el pH, el intercambio gaseoso de CO2 y O2, y la nutrición, incluidas las buenas fuentes de fósforo, carbohidratos, carbono y nitrógeno18.
Jaronski y Jackson18 describen el método de fermentación de sustrato sólido como el método de aproximación más eficiente y más cercano al proceso natural para la producción de EPF en relación con el método de fermentación de sustrato líquido porque, en condiciones naturales, el conidio fúngico se transmite sobre estructuras erectas sólidas, como la superficie de los cadáveres de insectos. Los productos agrícolas y los subproductos que contienen almidón se utilizan principalmente para la producción en masa de hongos hipocreales, ya que los hongos descomponen fácilmente el almidón a través de la secreción de enzimas hidrolíticas altamente concentradas de sus puntas hifales, para penetrar en la sustancia sólida y acceder a los nutrientes presentes en la sustancia 11,17,18,23 . Los productos de grano también proporcionan los requisitos para una producción saludable de biomasa porque, cuando se hidratan y esterilizan, los sustratos pueden absorber más nutrientes de cualquier medio líquido 16,18,24.
Anteriormente, varios estudios intentaron cultivar en masa especies de EPF como Beauveria bassiana (Bals). Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas y algunos de los Metarhizium anisopliae (Metschn.) El complejo de especies de Sorokin se aísla sobre diversos sustratos 16,23,24. Tales aislados producidos en masa y desarrollados comercialmente incluyen Green Muscle® (cepa IMI 330189), desarrollado a partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 cepa ICIPE69), y Real Metarhizium 69 (L9281), desarrollado a partir de M. anisopliae, y Broadband® (cepa PPRI 5339) y Eco-Bb®, desarrollado a partir de B. bassiana25,26 . Sin embargo, se han hecho intentos limitados para el cultivo de masas Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber y Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Estos dos aislados fueron seleccionados en un estudio previo como los más efectivos para el control de la cochinilla, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Por lo tanto, el estudio actual tuvo como objetivo formular y producir en masa un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de los aislados locales de M. robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial contra plagas de insectos. El método de fermentación de sustrato sólido se utilizó para producir en masa los conidios fúngicos para ambos aislados de EPF. Se utilizaron dos métodos de inoculación de EPF, utilizando suspensiones conidiales y el cultivo fúngico líquido de blastosporas, para inocular los sustratos sólidos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

Los hongos entomopatógenos del complejo de especies Metarhizium anisopliae han ganado importancia como agentes de control biológico de plagas de insectos agrícolas. El aumento de la resistencia de las plagas a los insecticidas químicos, las crecientes preocupaciones con respecto a los efectos negativos de los insecticidas en la salud humana y la contaminación ambiental causada por los plaguicidas han llevado a un impulso mundial para encontrar nuevas estrategias sostenibles para la protección de cultivos y el control de plagas. Anteriormente, se han realizado intentos de cultivo masivo de especies de hongos entomopatógenos (EPF) como Beauveria bassiana . Sin embargo, solo se han realizado intentos limitados para el cultivo masivo de Metarhizium robertsii y M. pinghaense para su uso contra plagas de insectos. Este estudio tuvo como objetivo producir en masa un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de aislados sudafricanos de M. robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial. Se utilizaron tres productos de granos agrícolas, avena en copos, cebada en copos y arroz, como sustratos de fermentación sólida EPF. Se utilizaron dos métodos de inoculación, suspensiones conidiales y el cultivo fúngico líquido de blastosporas para inocular los sustratos sólidos. Se observó que la inoculación mediante suspensiones conidiales era relativamente menos efectiva, ya que se observaron mayores niveles de contaminación en los sustratos sólidos en relación con el uso del método de inoculación de blastosporas. Se encontró que la avena en escamas no era un sustrato de crecimiento adecuado tanto para M. robertsii como para M. pinghaense, ya que no se cosecharon conidios secos del sustrato. Se encontró que la cebada en escamas favorecía la producción de M. robertsii conidia sobre la de M. pinghaense, y se cosechó un promedio de 1,83 g ± 1,47 g de M. robertsii conidia seca y cero gramos de M. pinghaense conidia del sustrato. Se encontró que los granos de arroz favorecen la producción en masa conidial de los aislados de M. pinghaense y M. robertsii , con un promedio de 8,2 g ± 4,38 g y 6 g ± 2 g cosechados del sustrato, respectivamente.

Se observó una disminución en la masa de contenido de los cultivos de arroz tanto para el M. pinghaense como para el M. robertsii a lo largo del tiempo durante la etapa de secado de los cultivos de hongos, sin que se observara ningún cambio o poco en la masa una vez que los cultivos estaban secos (Figura 5). El polvo de conidios fúngicos secos cosechados tanto del M. pinghaense como del M. robertsii se muestra en la Figura 6</stron...

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Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Los hongos entomopatógenos han ganado importancia como agentes de control biológico de plagas de insectos agrícolas. En este estudio, la producción en masa de un número suficiente de propágulos infecciosos resistentes de aislados sudafricanos de Metarhizium robertsii y M. pinghaense para su aplicación comercial contra plagas de insectos se llevó a cabo con éxito utilizando productos de granos agrícolas.

Producción en masa de hongos entomopatógenos, Metarhizium robertsii y Metarhizium pinghaense, para aplicación comercial contra plagas de insectos

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Este método proporciona nueva información sobre cómo producir en masa conidios infecciosos de hongos entomopatógenos para controlar importantes plagas de insectos en agroecosistemas comerciales, dada la situación actual en la que la mayoría de los insecticidas se eliminan gradualmente debido a las preocupaciones de su efecto tóxico sobre el medio ambiente y la salud humana. La técnica describe el método utilizado para garantizar el rendimiento óptimo de los conidios de EPF durante la producción en masa. El método es útil para el manejo integrado de plagas y el control biológico al proporcionar información sobre la efectividad de los conidios producidos en masa para el manejo a gran escala de plagas dañinas de insectos resistentes a los insecticidas en los agroecosistemas.Este procedimiento fue desarrollado y demostrado por la Dra. Letodi Luki Mathulwe, la Dra. Nomakholwa Faith Stokwe y la profesora Antoinette Paula Malan. Calentar un litro de agua destilada y apagar el fuego antes de llegar al punto de ebullición. Ahora, agregue 30 gramos de glucosa, cuatro gramos de fosfato de potasio dibásico, 20 gramos de extracto de levadura, 15 mililitros de licor de maíz empinado y lleve el contenido a un hervor suave durante dos o tres minutos.Vierta un total de 100 mililitros del medio en nueve matraces diferentes de 250 mililitros. Coloque un tapón de algodón en cada matraz y cubra el algodón con papel de aluminio como tapón. Autoclave el medio en los matraces durante 55 minutos a 121 grados centígrados.Más tarde, deje que el medio en los matraces se enfríe y agregue 10 miligramos por mililitro de estreptomicina al medio en cada matraz. Recolectar de dos a tres bucles bacterianos de conidios fúngicos de placas de cultivo de hongos de dos a tres semanas de edad para ambos aislados de EPF. Transfiera los conidios fúngicos a cada 100 mililitros de medios líquidos en los matraces de 250 mililitros en condiciones estériles y selle los matraces.Incubar los matraces de cultivo líquido a aproximadamente 25 grados Celsius en un agitador orbital a 140 RPM durante tres días y cesar la incubación una vez que los cultivos muestren signos de alta turbidez con crecimiento de blastosporas fúngicas. Para detectar cualquier posible contaminación bacteriana de los cultivos, extraiga una muestra de 100 microlitros de cada matraz de cultivo líquido después de 24 horas de incubación y placa en tres placas SDA por aislado. Incubar las placas durante 48 horas a una temperatura controlada de más o menos 25 grados centígrados.Use una pequeña tubería de desecho de cloruro de polivinilo para crear un cuello para la bolsa de fermentación en el extremo abierto de la bolsa de autoclave y use cinta de autoclave para asegurar la tubería. Cierre la tubería con un tapón de algodón estéril para permitir un intercambio de gases suficiente durante la fermentación. Use arroz blanco de grano largo hervido como medio de sustrato sólido para las blastosporas de Metarhizium pinghaense y Metarhizium robertsii.Para cada bolsa de fermentación, agregue un kilogramo de arroz y 300 mililitros de agua destilada estéril. Mezcle suavemente el contenido de las bolsas de fermentación. Colóquelos en bolsas exteriores para autoclaves en posición vertical y en autoclave a 121 grados centígrados durante 55 minutos.Después del autoclave, deje que los sustratos se enfríen durante unos 45 minutos en condiciones estériles. Retire el cierre de cada uno de los matraces de cultivo líquido de Metarhizium pinghaense y Metarhizium robertsii bajo un flujo laminar y encienda el borde de cada matraz durante 10 segundos. Vierta 100 mililitros de cultivos líquidos en las bolsas de fermentación retirando los tapones de algodón de sus cuellos.Vuelva a colocar los tapones de algodón y cubra la parte superior del cuello de la bolsa con papel quirúrgico asegurado con una banda elástica. Gire la parte superior de la bolsa y mezcle el contenido de la bolsa agitando y manipulando el sustrato mediante masaje. Incubar las bolsas a unos 25 grados centígrados aplanando el sustrato en las bolsas para evitar la formación de lechos gruesos.Dos o tres días después de la inoculación y la incubación, cuando se haya producido un crecimiento micelial visible y la unión del sustrato por el hongo, rompa el sustrato en las bolsas de fermentación masajeando el contenido de las bolsas. Después de la fermentación, transfiera los cultivos esporulados a bolsas de papel marrón de 26 a 30 kilogramos y seque los cultivos de hongos durante 10 a 12 días antes de su uso en ensayos. Para mejorar la resistencia a la tracción de las bolsas de papel, corte horizontalmente 1/3 de la parte superior de la bolsa y forre la parte inferior de la bolsa.Desmenuza suavemente el sustrato en cada bolsa de fermentación. Corte la esquina de cada bolsa y transfiera lentamente todo el cultivo a las bolsas de papel a través del espacio dejado por la esquina cortada. Etiquete cada bolsa de papel, doble sobre el extremo superior de cada bolsa dos veces y cierre con grapas para crear una estructura triangular de carpa.Coloque las bolsas en las rejillas de secado de alambre para permitir un secado adecuado y uniforme a una temperatura controlada de aproximadamente 25 grados centígrados y una humedad baja de 30 a 40% Cosechar conidios fúngicos de los cultivos utilizando tres tamices anidados montados en una bandeja de recolección. Cargue lentamente la muestra de cultivo seco en la malla ETS número 35 y tamiz. Coloque una tapa en el tamiz para evitar la liberación de conidios fúngicos en el aire.Agregue de 10 a 12 canicas de vidrio a los tamices para ayudar al paso de los conidios fúngicos a través de las pantallas de malla y evitar la retención de los conidios en el tamiz, lo que puede resultar en una reducción de la recuperación de esporas. Tape y selle las juntas del tamiz con cinta adhesiva eléctrica. Coloque los tamices en un agitador vibratorio equipado con una almohadilla adhesiva para asegurar la bandeja de recolección y los tamices durante 20 a 25 minutos a un movimiento de 560 a 640 vibraciones por minuto.Retire los tamices de prueba de la bandeja de recolección, recoja los conidios y guarde los conidios recolectados en bolsas herméticas e impermeables al agua con cierre de cremallera para su almacenamiento a largo plazo. Se cosechó un promedio de aproximadamente 1,83 gramos de Conidios secos de Metarhizium robertsii del sustrato de cebada en escamas, mientras que no se cosechó cero Metarhizium pinghaense del sustrato. No se cosecharon conidios fúngicos secos del sustrato de avena en escamas para ninguna de las especies de Metarhizium.Se observó una diferencia significativa entre las dos especies de Metarhizium en el promedio estimado de conidios por gramo cosechado de los granos de arroz. Metarhizium robertsii tuvo un recuento promedio de conidios por gramo ligeramente más alto que Metarhizium pinghaense. No se observaron diferencias significativas entre las dos especies de Metarhizium en el número estimado de conidios presentes en el sustrato de arroz gastado.Sin embargo, Metarhizium pinghaense tuvo conidios ligeramente más altos en el sustrato de arroz que Metarhizium robertsii No se estiman diferencias significativas en las dos especies de Metarhizium en su rendimiento total de conidios obtenidos de los cultivos de sustrato de arroz. Sin embargo, Metarhizium pinghaense produjo un rendimiento de conidios ligeramente mayor que Metarhizium robertsii, que produjo un rendimiento conidial más bajo. La parte desafiante de esta técnica es la contaminación del sustrato a través de la inoculación con un inóculo de blastosporas contaminado.Por lo tanto, siempre asegure la esterilidad mientras trabaja. Esta demostración ayuda a los estudiantes a reproducir eficientemente la técnica sin errores torpes que pueden resultar en la terminación de todo el proceso.

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

Un método para la producción de proteínas recombinantes en células de insecto mCD1d.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Investigación

Biología

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Producción eficiente y purificación de recombinante murino kindlin-3 a partir de células de insecto para estudios biofísicos

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Aplicación de colorantes fluorescentes selectivos de membrana y pared celular para imágenes de células vivas de hongos filamentosos

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Etiquetado inmunofluorescente de virus vegetales y proteínas vectoras de insectos en intestinos hemípteros

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

Evaluación del efecto afidicida de hongos entomopatógenos contra insectos partenogenéticos, pulgón de la mostaza, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Exploración de los recursos de hongos entomopatógenos de los barrenadores forestales de la madera

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Evaluación de hongos entomopatógenos en poblaciones silvestres de Monochamus alternatus para aplicaciones de biocontrol en barrenadores f

Aislamiento, identificación conductual y evaluación de la patogenicidad de hongos entomopatógenos de un barrenador forestal

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...