Name: mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Författarna vill tacka Hort Pome, Hort Stone och programmet Technology and Human Resources for Industry (THRIP: TP14062571871) för finansieringen av projektet.
ORCID: Letodi L. Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette P. Malan http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Källa till svampstammar
<ol><li>Använd sydafrikanska isolerade svampstammar av både M. pinghaense 5 HEID (GenBank Accession number: MT367414/MT895630) och M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), insamlade från äppelodlingar i Västra Kapprovinsen, Sydafrika.</li>
	<li>Odla kulturer av varje EPF-isolat på 60 g Sabouraud dextrosagarmedium, kompletterat med 1 g jästextrakt (SDAY) och 10 μL Streptomycin. OBS: Inkubera EPF-kulturer vid en kontrollerad temperatur på...

<ol>
	<li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents.">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+biology+and+control+of+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae),+with+special+reference+to+biological+control+using+entomopathogenic+fungi+and+nematodes.">A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes.</a> African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).</li><li>Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production,+yield,+quality,+formulation+and+efficacy+of+entomopathogenic+Metarhizium+anisopliae+conidia.">Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia.</a> Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).</li><li>Banu, J. G., Rajalakshmi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+media+for+mass+multiplication+of+entomopathogenic+fungi.">Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi.</a> Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).</li><li>Roberts, D. W., Humber, R. A., Cole, G. T., Kendrick, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomogenous+fungi.">Entomogenous fungi.</a> Biology of Conidial Fungi. , 201-236 (1981).</li><li>Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+formulation+and+application+of+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+for+insect+control.+Current+status.">Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status.</a> Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).</li><li>Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+solid+substrates+on+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae+entomopathogens.">Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens.</a> The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , 8-12 (2010).</li><li>Prasad, C. S., Pal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+and+economics+of+entomopathogenic+fungus,+Beauveria+bassiana,+Metarhizium+anisopliae+and+Verticillium+lecanii+on+agricultural+and+industrial+waste.">Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste.</a> Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).</li><li>Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+nematodes+for+plant+protection.">Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).</li><li>Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+blastospore+of+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+in+a+submerged+batch+culture.">Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture.</a> Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).</li><li>Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products.">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products.</a> The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).</li><li>Latifian, M., Rad, B., Amani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+Metarhizium+anisopliae+by+using+agricultural+products+based+on+liquid-solid+diphasic+method+for+date+palm+pest+control.">Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control.</a> International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).</li><li>Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+(Metarhizium+anisopliae)+using+different+grains+as+a+substrate.">Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).</li><li>Jackson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+nutritional+conditions+for+the+liquid+culture+production+of+effective+fungal+biological+control+agents.">Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).</li><li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycopesticides+production+by+fermentation.+Potential+and+challenges.">Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges.</a> Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).</li><li>Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products+and+by+products.">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products.</a> African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).</li><li>Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Verticillium+lecanii+spore+production+in+solid-state+and+liquid-state+fermentations.">Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations.</a> Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).</li><li>Jaronski, S. T., Jackson, M. A., Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+production+of+entomopathogenic+Hypocreales.">Mass production of entomopathogenic Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition. , 255-284 (2012).</li><li>Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+nutrition+on+spore+yields+for+various+fungal+entomopathogens+in+liquid+culture.">The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).</li><li>El Damir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+growing+media+and+water+volume+on+conidial+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).</li><li>Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+different+grains+as+solid+substrates+on+sporulation,+viability+and+pathogenicity+of+Metarhizium+anisopliae+(Metschnikoff)+Sorokin.">Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin.</a> Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).</li><li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whey+for+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).</li><li>Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+a+suitable+medium+for+mass+multiplication+of+entomofungal+pathogens.">Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens.</a> Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).</li><li>Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+rice+by-products,+incubation+time,+and+photoperiod+for+solid+state+mass+multiplication+of+the+biocontrol+agents+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae.">Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).</li><li>Price, R. E., M&#252;ller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+trial+of+a+Metarhizium+anisopliae+var.+acridum+mycoinsecticide+for+the+control+of+the+red+locust+in+a+recognised+outbreak+area.">The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area.</a> International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).</li><li>Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+control+of+phytophagous+invertebrate+pests+in+South+Africa.+Current+status+and+future+prospects.">Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li><li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug,+Pseudococcus+viburni+(Hemiptera:+Pseudococcidae).">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li><li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+techniques+used+for+entomopathogenic+fungi:+Hypocreales.">Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 189-253 (2012).</li><li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+carbon+&amp;+nitrogen+sources+on+the+Trichoderma+viride+(Biofungicide)+and+Beauveria+bassiana+(entomopathogenic+fungi).">Impact of carbon &amp; nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi).</a> European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).</li><li>Burges, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formulation+of+mycoinsecticides.">Formulation of mycoinsecticides.</a> Formulation of Microbial Biopesticides. , 131-185 (1998).</li></ol>

Den framgångsrika integrationen av mikrobiella medel för biologisk bekämpning av viktiga jordbruksinsekter i ett agroekosystem beror på både framgång och enkel massproduktion av entomopatogenerna som det första steget under laboratorieförhållanden. Massproduktionen av EPF är viktig för storskalig tillämpning och tillgänglighet av EPF-produkter för IPM-program med biologisk bekämpning 9,10,11,12,13.<sup ...

Entomopatogena svampar (EPF) har fått betydelse som växtskyddsmedel vid biologisk bekämpning av viktiga skadedjur inom jordbruket 1,2. Entomopatogenerna, som förekommer naturligt i jord, orsakar epizootier i populationerna av olikaskadedjursarter 3. Arterna av EPF är värdspecifika och utgör relativt få risker när det gäller att attackera icke-målarter, och de är inte toxiska för miljön4. EPF har en unik mekanism för att invadera sin värd, liksom för att föröka och kvarstå i sin omedelbara miljö1. De attackerar värden främst genom asexuella sporer som fäster vid och tränger in i värdkutikeln för att invadera och sprida sig i värdhemomiljön. Värden dör så småningom på grund av utarmning av hemolymfnäringsämnena eller som ett resultat av toxemi orsakad av de giftiga metaboliterna som frigörs av svampen. Efter döden, under idealiska miljöförhållanden, dyker svampen upp på den yttre ytan (öppen mykos) av värdkadavren 5,6.
Växande oro över de negativa effekterna av kemiska rester på människors hälsa, miljöföroreningar och utvecklingen av skadedjursresistens har lett till den globala drivkraften att minska tillförseln av kemikaliebaserade insekticider och att hitta alternativa, nya och hållbara strategier för växtskydd och skadedjursbekämpning 6,7,8 . Detta har gett möjligheter att utveckla mikrobiella insekticider för användning i integrerade skadedjursbekämpningsprogram (IPM), som är mer ekologiskt gynnsamma strategier än konventionell kemisk kontroll 3,8.
För att utveckla ett framgångsrikt mikrobiellt bekämpningsmedel för en jordbruksskadegörare måste en lämplig organism först isoleras, karakteriseras, identifieras och dess patogenicitet för målskadegöraren bekräftas. Det krävs dock en enkel och kostnadseffektiv metod för storskalig produktion av det mikrobiella medlet för att framställa en livskraftig produkt för användning i biologiska bekämpningsprogram 9,10,11,12,13. Massproduktion av betydande mängder entomopatogener av god kvalitet beror på den mikrobiella stammen, miljön, målskadegöraren, formuleringen, marknaden, applikationsstrategin och den önskade slutprodukten 14,15,16. EPF kan massproduceras med flytande substratfermentering för att producera blastosporer eller den fasta substratfermenteringsprocessen för att producera luftkonidier 6,17,18. Massproduktions- och formuleringsprocessen av entomopatogener påverkar emellertid direkt virulensen, kostnaden, hållbarheten och fälteffektiviteten hos slutprodukten. För framgångsrik användning i IPM måste produktionsprocessen för entomopatogenerna vara lätt att köra, kräva minimal arbetskraft, producera en högutbyteskoncentration av virulenta, livskraftiga och ihållande propaguler och vara låg i kostnad 4,13,14,16.
Att förstå näringsbehovet hos entomopatogener är viktigt för massodling med alla odlingsmetoder 4,12. Näringskomponenterna i produktionsmediet har en signifikant inverkan på egenskaperna hos de resulterande propagulerna, inklusive biokontrolleffekt, utbyte, uttorkningstolerans och persistens 8,19,20,21. Optimeringen av produktionsförfaranden är utformad för att hantera sådana faktorer22. För EPF är de viktigaste kraven för god tillväxt, sporulering och massproduktion av svampkonidier tillräcklig fukt, optimal tillväxttemperatur, pH, gasutbyte avCO2 ochO2 och näring, inklusive goda fosfor-, kolhydrat-, kol- och kvävekällor18.
Jaronski och Jackson18 beskriver den fasta substratfermenteringsmetoden som den mest effektiva och närmaste approximationsmetoden till den naturliga processen för EPF-produktion i förhållande till jäsningsmetoden för flytande substrat eftersom svampkonidiumet under naturliga förhållanden bärs på fasta upprätta strukturer, som ytan på insektskadaver. Jordbruksprodukter och biprodukter som innehåller stärkelse används mest för massproduktion av hypokrealeansvampar, eftersom svamparna lätt sönderdelar stärkelse genom utsöndring av högkoncentrerade hydrolytiska enzymer från deras hyphalspetsar, för att tränga in i den fasta substansen och för att komma åt de näringsämnen som finns i ämnet 11,17,18,23 . Spannmålsprodukterna ger också kraven för hälsosam biomassaproduktion eftersom substraten, när de hydratiseras och steriliseras, kan absorbera ytterligare näringsämnen från vilket flytande medium som helst 16,18,24.
Tidigare försökte flera studier masskulturera EPF-arter som Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas och några av Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin artkomplex isolerar på olika substrat 16,23,24. Sådana massproducerade och kommersiellt utvecklade isolat inkluderar Green Muscle® (stam IMI 330189), utvecklad från M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver &Milner) J.F. Bisch, Rehner &Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 stam ICIPE69) och Real Metarhizium 69 (L9281), utvecklad från M. anisopliae, och Bredband® (stam PPRI 5339) och Eco-Bb®, utvecklad från B. bassiana25,26 . Begränsade försök har dock gjorts att masskulturera Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber och Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Dessa två isolat valdes i en tidigare studie som det mest effektiva för kontroll av mjölkfisken, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Därför syftade den aktuella studien till att formulera och massproducera ett tillräckligt antal motståndskraftiga infektiösa propaguler av de lokala isolaten av M. robertsii och M. pinghaense för kommersiell applicering mot skadedjur. Den fasta substratfermenteringsmetoden användes för att massproducera svampkonidierna för båda EPF-isolaten. Två EPF-inokuleringsmetoder, med användning av konidialsuspensioner och den flytande svampkulturen av blastosporer, användes för att inokulera de fasta substraten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Tween 20</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Added to conidial suspensions to allow fungal spores to mix with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL McCartney bottles</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used as a cover of the cotton wool plugs on 250-mL flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize materials and ingredients used for the conidia production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave bags</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Fermentation bags or solid substrate containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave tape</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>To secure PVC pipes on the fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Kraft paper bags</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to dry conidia cultures on agricultural grains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burnner</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to flame equipment (surgical blades,inoculating loops and rims of flasks)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear edge test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn steep liquor</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>66071-94-1</td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Wool</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used as plug of the neck for fermentation bags</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran laboratory bottles</td>
			<td>Neolab</td>
			<td></td>
			<td>Used to autoclave SDA medium and distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to tape and seal the sieve joints to prevent the escape of conidial dust</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ENDECOTTS test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to separate fungal conidia from agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer Flasks, Narrow neck,250-mL flask</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Carrier of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (99%)</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to sterilize surgical blades and inoculating loops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked barley</td>
			<td>Health Connection Wholefoods</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaked oats</td>
			<td>Tiger brands</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Chamber/ incubators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For growing fungal conidia culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>For harvesting spores to innoculate liquid medium for blastospores growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kitchen rolling pin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to manipulate the solid grain substrate bed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow Cabinet</td>
			<td>ESCO Laminar Flow Cabinet</td>
			<td></td>
			<td>Provide as sterile environment during substrate inoculation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium pinghaense conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>5HEID</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium pinghaense</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metarhizium robertsii conidia</td>
			<td>Stellenbosch University</td>
			<td>6EIKEN</td>
			<td>Cultures used to mass culture conidia of Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ZEIZZ (Scope. A1)</td>
			<td></td>
			<td>Used to determine conidial concentrations and conidial viability</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>IncoShake- LABOTEC</td>
			<td></td>
			<td>Used for the blastospore production process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parboiled rice</td>
			<td>Spekko</td>
			<td></td>
			<td>Agricultural grain used as a solid substrate growth medium for conidia of both M. pinghaense and M. robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to prevent bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-dishes</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Containers for the SDA medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and pipette tips</td>
			<td>Labnet (BioPette PLUS)</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure liquids ingredients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylchloride Marley waste pipe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to create a neck for the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
			<td>Ingredient of the blastospore liquid medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber band</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the secure the surgical paper over the fermentation bag PVC pipe necks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sabaroud dextrose agar (SDA)</td>
			<td>NEOGEN Culture Media</td>
			<td></td>
			<td>Medium used to culture spores of both Metarhizium pinghaense and Metarhizium robertsii</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To hydrate agricultural grains, to make conidial suspensions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sticky pad</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to secure the seives on the vibratory shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to scrape off spores from fungal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical paper</td>
			<td>Lasec</td>
			<td></td>
			<td>Used to cover the PVC necks and cotton wool plugs of the fermentation bag</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratory shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Used to shake conidia off the agricultural grain substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Used to mix conidial suspensions in Mc Cartney bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Added to the SDA medium to improve spore germination and growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zipper-lock bags</td>
			<td>GLAD</td>
			<td></td>
			<td>Used to to store harvested fungal conidia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass production of entomopathogenic fungi, metarhizium robertsii and metarhizium pinghaense, for commercial application against insect pests

Entomopatogena svampar av Metarhizium anisopliae-artkomplexet har fått betydelse som biologiska bekämpningsmedel för skadedjur inom jordbruket. Ökningen av skadedjursresistens mot kemiska insekticider, den växande oron för de negativa effekterna av insekticider på människors hälsa och miljöföroreningarna från bekämpningsmedel har lett till en global strävan att hitta nya hållbara strategier för växtskydd och skadedjursbekämpning. Tidigare har försök att masskulturera sådana entomopatogena svampar (EPF) arter som Beauveria bassiana genomförts. Endast begränsade försök har dock gjorts för att masskulturera Metarhizium robertsii och M. pinghaense för användning mot skadedjur. Denna studie syftade till att massproducera ett tillräckligt antal fjädrande infektiösa propaguler av sydafrikanska isolat av M. robertsii och M. pinghaense för kommersiell tillämpning. Tre jordbrukskornsprodukter, flingad havre, flingat korn och ris, användes som EPF fasta jäsningssubstrat. Två inokuleringsmetoder, konidialsuspensioner och den flytande svampkulturen av blastosporer användes för att inokulera de fasta substraten. Inokulering med användning av konidiella suspensioner observerades vara relativt mindre effektiv, eftersom ökade nivåer av kontaminering observerades på de fasta substraten i förhållande till vid användning av blastosporinokuleringsmetoden. Flingad havre visade sig inte vara ett lämpligt tillväxtsubstrat för både M. robertsii och M. pinghaense, eftersom inga torra konidier skördades från substratet. Flingat korn visade sig gynna produktionen av M. robertsii conidia framför M. pinghaense, och i genomsnitt 1,83 g ± 1,47 g torr M. robertsii conidia och noll gram M. pinghaense conidia skördades från substratet. Riskorn visade sig gynna den konidiella massproduktionen av både M. pinghaense och M. robertsii isolat, med i genomsnitt 8,2 g ± 4,38 g respektive 6 g ± 2 g skördade från substratet.

En minskning av kulturernas innehållsmassa på ris för både M. pinghaense och M. robertsii observerades över tiden under svampkulturernas torkningsstadium, med ingen eller liten förändring som observerades i massan när kulturerna var torra (Figur 5). Det skördade torra svampkonidipulvret av både M. pinghaense och M. robertsii visas i figur 6.
<img alt="Figur...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests at JoVE.com

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Entomopatogena svampar har fått betydelse som biologiska bekämpningsmedel för skadedjur inom jordbruket. I denna studie genomfördes massproduktionen av ett tillräckligt antal fjädrande infektiösa propaguler av sydafrikanska isolat av både Metarhizium robertsii och M. pinghaense för kommersiell applicering mot skadedjur framgångsrikt med användning av jordbruksprodukter.

Massproduktion av entomopatogena svampar, Metarhizium robertsii och Metarhizium pinghaense, för kommersiell användning mot skadedjur

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Denna metod ger ny information om hur man massproducerar infektiösa konidier av entomopatogena svampar för att bekämpa viktiga skadeinsekter i kommersiella agroekosystem, med tanke på den nuvarande situationen där de flesta insekticider fasas ut på grund av oro för deras toxiska effekt på miljön och människors hälsa. Tekniken beskriver den metod som används för att säkerställa optimalt utbyte av EPF-konidier under massproduktion. Metoden är användbar för integrerad skadedjursbekämpning och biologisk bekämpning genom att ge insikt i effektiviteten hos massproducerade konidier för storskalig hantering av skadliga insekticidresistensinsekter i agroekosystemen.Denna procedur utvecklades och demonstrerades av Dr.Letodi Luki Mathulwe, Dr.Nomakholwa Faith Stokwe och professor Antoinette Paula Malan. Värm en liter destillerat vatten och stäng av värmen innan du når kokpunkten. Tillsätt nu 30 gram glukos, fyra gram kaliumfosfat dibasisk, 20 gram jästextrakt, 15 ml majs brant sprit och koka innehållet försiktigt i två till tre minuter.Häll totalt 100 ml av mediet i nio olika 250-ml kolvar. Placera en bomullsplugg på varje kolv och täck bomullsullen med aluminiumfolie som stopp. Autoklavera mediet i kolvarna i 55 minuter vid 121 grader Celsius.Låt senare mediet i kolvarna svalna och tillsätt 10 milligram per milliliter streptomycin till mediet i varje kolv. Samla två till tre bakterieslingor av svampkonidier från två till tre veckor gamla svampodlingsplattor för båda EPF-isolaten. Överför svampkonidierna till varje 100 ml flytande media i 250 ml-kolvarna under sterila förhållanden och försegla kolvarna.Inkubera vätskekulturkolvarna vid cirka 25 grader Celsius på en orbitalskakare vid 140 rpm i tre dagar och avbryt inkubationen när kulturerna visar tecken på hög grumlighet med svampblastosportillväxt. För att upptäcka eventuell bakteriell kontaminering från kulturerna, dra ett 100-mikroliterprov från varje flytande odlingskolv efter 24 timmars inkubation och platta på tre SDA-plattor per isolat. Inkubera plattorna i 48 timmar vid en kontrollerad temperatur på plus eller minus 25 grader Celsius.Använd ett litet polyvinylkloridavfallsrör för att skapa en hals för jäsningspåsen i den öppna änden av autoklavpåsen och använd autoklavtejp för att säkra röret. Stäng röret med en steril bomullsplugg för att möjliggöra tillräckligt med gasutbyte under jäsningen. Använd parboiled långkornigt vitt ris som ett fast substratmedium för blastosporerna av både Metarhizium pinghaense och Metarhizium robertsii.För varje jäsningspåse, tillsätt ett kilo ris och 300 ml sterilt destillerat vatten. Blanda försiktigt innehållet i jäsningspåsarna. Placera dem i yttre autoklavpåsar i upprätt läge och autoklavera vid 121 grader Celsius i 55 minuter.Efter autoklavering, låt substraten svalna i cirka 45 minuter under sterila förhållanden. Avlägsna förslutningen av var och en av vätskekolvarna av både Metarhizium pinghaense och Metarhizium robertsii under ett laminärt flöde och flamma kanten på varje kolv i 10 sekunder. Häll 100 ml flytande kulturer i jäsningspåsarna genom att ta bort bomullspropparna från halsen.Sätt på bomullspluggarna igen och täck toppen av påsens hals med kirurgiskt papper säkrat med ett gummiband. Vrid den övre delen av påsen och blanda påsens innehåll genom att skaka och manipulera underlaget genom massage. Inkubera påsarna vid cirka 25 grader Celsius genom att platta ut substratet i påsarna för att förhindra bildandet av tjocka sängar.Två till tre dagar efter inokulering och inkubation, när synlig myceltillväxt och bindning av substratet av svampen hade inträffat, bryt substratet i jäsningspåsarna genom att massera påsarnas innehåll. Efter jäsning, överför de sporulerade kulturerna till 26 till 30 kg bruna papperspåsar och torka svampkulturerna i 10 till 12 dagar innan de används i försök. För att förbättra papperspåsarnas draghållfasthet, skär av 1/3 av påsens övre del horisontellt och fodra botten av påsen.Smula försiktigt substratet i varje jäsningspåse. Klipp av hörnet på varje påse och överför långsamt hela kulturen till papperspåsarna genom utrymmet kvar av det avskurna hörnet. Märk varje papperspåse, vik över den övre änden av varje påse två gånger och stäng med häftklamrar för att skapa en triangulär tältstruktur.Placera påsarna på trådtorkställ för att möjliggöra korrekt, jämn torkning vid en kontrollerad temperatur på cirka 25 grader Celsius och låg luftfuktighet på 30 till 40% Skörda svampkonidier från kulturerna med tre kapslade siktar monterade på en uppsamlingspanna. Fyll långsamt på torrodlingsprovet på ETS-masknummer 35 och sikta. Lägg ett lock på sikten för att förhindra utsläpp av svampkonidier i luften.Tillsätt 10 till 12 glaskulor i siktarna för att hjälpa svampkonidierna att passera genom nätskärmarna och undvik att konidierna hålls kvar i sikten, vilket kan resultera i minskad sporåtervinning. Tejpa och täta siktfogarna med elektrisk tejp. Placera siktarna på en vibrationsskakapparat försedd med en klibbig dyna för att säkra uppsamlingspannan och siktarna i 20 till 25 minuter vid en rörelse av 560 till 640 vibrationer per minut.Ta bort testsiktarna från uppsamlingspannan, samla upp konidier och förvara de uppsamlade konidierna i lufttäta och vattenogenomträngliga blixtlåspåsar för långvarig förvaring. I genomsnitt skördades cirka 1,83 gram torr Metarhizium robertsii conidia från det flingade kornsubstratet, medan noll Metarhizium pinghaense skördades från substratet. Inga torra svampkonidier skördades från det flingade havresubstratet för någon av Metarhizium-arterna.En signifikant skillnad observerades mellan de två arterna av Metarhizium i den uppskattade genomsnittliga konidien per gram skördad från riskornen. Metarhizium robertsii hade något högre genomsnittligt antal konidier per gram än Metarhizium pinghaense. Ingen signifikant skillnad observerades mellan de två arterna av Metarhizium i det uppskattade antalet konidier som finns på det förbrukade rissubstratet.Metarhizium pinghaense hade dock något högre konidier på rissubstratet än Metarhizium robertsii Ingen signifikant skillnad uppskattas hos de två arterna av Metarhizium i deras totala konidiautbyte erhållet från rissubstratkulturerna. Metarhizium pinghaense gav dock ett något högre konidiautbyte än Metarhizium robertsii, vilket gav ett lägre konidialutbyte. Den utmanande delen av denna teknik är substratföroreningen genom ympning med en förorenad blastospores inokulum.Således, säkerställ alltid sterilitet under arbetet. Denna demonstration hjälper eleverna att effektivt reproducera tekniken utan klumpiga misstag som kan leda till att hela processen avslutas.

Research

JoVE Journal

Biology

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

En metod för produktion av rekombinanta mCD1d Protein i insektsceller.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion och rening av rekombinant Murina Kindlin-3 från insektsceller för biofysikalisk Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

Applicering av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell avbildning av trådformiga svampar

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Immunofluorescerande märkning av växtvirus och insektsvektorproteiner i hemipterantarmar

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Processutveckling för produktion och rening av Adeno-associerat virus (AAV)2 Vektor med baculovirus-insektscellskultursystem

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Isolering och urval av entomopathogena svampar från jordprover och utvärdering av svampvinulens mot insektsskadedjur

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

Jämförelse av metoder för att isolera entomopatogena svampar från jordprover

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Optimized Bioassay for Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphid

Assessment of Aphidicidal Effect of Entomopathogenic Fungi against Parthenogenetic Insect, Mustard Aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Author Spotlight: Eco-Friendly Pest Management Using Entomopathogenic Fungi Against Mustard Aphids 

Bedömning av afidicid effekt av entomopatogena svampar mot partenogenetisk insekt, senapsbladlus, Lipaphis erysimi (Kalt.)

The mustard aphid (L. erysimi) is a pest that infests various cruciferous crops and transmits plant viruses. To achieve eco-friendly pest management, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Undersökning av entomopatogena svampresurser från skogsbovar

Isolation, Behavioral Identification, and Pathogenicity Assessment of Entomopathogenic Fungi from a Forest Wood Borer

<meta charset="utf8"></head><body>Författare Spotlight: Utvärdering av entomopatogena svampar i vilda Monochamus alternatus-populationer för biologisk bekämpning i skogsborrar

Isolering, beteendeidentifiering och patogenitetsbedömning av entomopatogena svampar från en skogsbometer

Forest wood borers (FWB) cause severe tree damage and economic losses worldwide. The release of entomopathogenic fungi (EPF) during the FWB emergence ...