Name: modeling paracrine noncanonical wnt signaling in vitro
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av NIH-utmärkelserna F30HL154324 till OT och K08HL121191 och R03HL154301 till S.R.K. Författarna vill erkänna att schemat i figur 1 i detta manuskript skapades med biorender.com.

1. Preexperimentell expansion och passering av celler
<ol><li>C2C12 cellodling:<ol><li>Förbered 500 ml C2C12-odlingsmedium genom att kombinera Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1 % penicillin / streptomycin.</li>
		<li>Tina en injektionsflaska med C2C12-celler i 37 °C vattenbad. Medan C2C12-cellerna tinar, tillsätt 5 ml C2C12-medium till ett 15 ml koniskt rör. Överför omedelbart de tinade cellerna till 15 ml röret med en P1000-pipett. OBS: C2C12...

<ol>
	<li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis.">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li><li>&#268;apek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration.">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093 (2019).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation.">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719 (2019).</li><li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling.">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).</li><li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice.">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li><li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow.">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li><li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt/planar+cell+polarity+signaling.">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li><li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma.">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li><li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+&#946;-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling.">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both &#946;-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li><li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+complex+of+SCRIB,+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration,+and+is+associated+with+breast+cancer+progression.">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li><li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling.">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li><li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles.">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li><li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels.">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).</li><li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT16+requires+G&#945;+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts.">WNT16 requires G&#945; subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li><li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness.">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305 (2016).</li><li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling.">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Wnt/Ca2++signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer.">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).</li><li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects.">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li><li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis,+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton.">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).</li><li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila.">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li><li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells.">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, 12540 (2020).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment.">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li><li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome.">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+instruction+to+output:+Wnt/PCP+signaling+in+development+and+cancer.">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li><li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development.">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).</li><li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+development+and+disease.">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li><li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H.">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li><li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development.">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).</li><li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field.">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li><li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice.">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li><li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells.">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).</li><li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays.">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).</li><li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scratch+wound+healing+assay.">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li></ol>

Den icke-kanoniska Wnt / planar cellpolaritet (PCP) signalvägen är en kritiskt viktig cellulär signalväg som har varit inblandad i flera utvecklingsprocesser 24,25 och sjukdomsprocesser 24,26. Under embryonal utveckling involverar icke-kanonisk Wnt-signalering ett expansivt nätverk av molekylära signaler från signalsändande celler som i slutändan inducerar förändringar i morfologi, asy...

Icke-kanonisk Wnt-signalering är en evolutionärt bevarad väg som reglerar cellulär filamentorganisation och riktningsmigration. Denna väg har varit inblandad i flera biologiska processer, inklusive embryonal vävnadsmorfogenes 1,2,3, lymfatisk och vaskulär angiogenes 4,5,6,7 och cancertillväxt och metastasering 8,9,10 . På cellnivå utförs icke-kanonisk Wnt-signalering genom samordnade parakrina interaktioner mellan signalsändande och signalmottagande celler. Dessa interaktioner förekommer ofta mellan celler av olika härstamning eller typ och involverar ett varierat molekylärt nätverk som inkluderar upp till 19 ligander och flera receptorer, samreceptorer och nedströms signaltransduktionseffektorer11. För att ytterligare komplicera denna signalprocess har tidigare studier visat att ligand-receptorkombinationer kan variera på ett kontext- och vävnadsberoende sätt 12,13, och att samma källligander som driver icke-kanonisk Wnt-signalering i signalmottagande celler kan produceras av flera signalsändande celltyper 14,15 . Med tanke på den cellulära och molekylära komplexiteten associerad med icke-kanonisk Wnt-signalering har förmågan att studera individuella och kliniskt relevanta mekanismer in vivo varit begränsad.
Försök har gjorts att studera icke-kanonisk Wnt-signalering med hjälp av cellodlingstekniker in vitro. Till exempel har sårläkningsanalyser utförda i cellulära monolager använts för att funktionellt bedöma cellulär riktningsmigration 4,16,17,18,19. Immunfärgningstekniker har använts för att utföra rumsliga analyser av ytproteinuttryck för att utvärdera icke-kanoniska Wnt-inducerade förändringar i cellulär morfologi 7,10, arkitektur och asymmetrisk polarisation18,19,20. Även om dessa tillvägagångssätt har gett viktiga verktyg för att karakterisera Wnt-relaterade fenotyper i signalmottagande celler, begränsar bristen på signalsändande komponenter i dessa protokoll deras förmåga att exakt modellera parakrina signalmekanismer som observerats in vivo. Som ett resultat kvarstår ett kritiskt behov av att utveckla in vitro-system som möjliggör robust och reproducerbar utvärdering av parakrina signalinteraktioner mellan signalsändande och mottagande celler i den icke-kanoniska Wnt-vägen, särskilt de av olika celltyper.
För detta ändamål var det primära målet med denna studie att upprätta ett protokoll för att modellera parakrina icke-kanoniska Wnt-signalinteraktioner in vitro. Vi utvecklade ett kontaktfritt kokultursystem som rekapitulerar signalsändande och signalmottagande komponenter i dessa interaktioner och tillåter användning av standard molekylära, genetiska eller farmakologiska metoder för att självständigt studera specifika ligandreceptormekanismer i den icke-kanoniska Wnt-vägen. Mekanismer för NCC-medierad Wnt-signalering undersöktes i myoblaster med hjälp av etablerade murina cellinjer. Som bevis på princip användes denna modell för att bekräfta fynd av tidigare in vivo-studier på möss som implicerar Wnt5a-ROR2-axeln som en relevant icke-kanonisk Wnt-signalväg mellan NCC 21 och SHF kardiomyoblast stamfäder 3,22,23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200-10</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2323</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C2C12 murine myoblast cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks, 75 cm2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>154526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 &#181;M transparent PET membrane</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3381E</td>
			<td>Stored in 50 mL aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, 0.1%</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-999-027</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated and sterile pipette tips, 10 &#181;L</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200 mM (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107409001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm</td>
			<td>Springside Scientific</td>
			<td>HRTCG2455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O9-1 neural crest cell line</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCC049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I, 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde solution in PBS, 4%</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-281692</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 &#956;g/mL streptomycin)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3470H</td>
			<td>Stored in 10 mL aliquots at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-iFluor 488</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab176753</td>
			<td>Stored at -20 &#176;C, Keep out of light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human/mouse Wnt5a protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>645-WN-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate, 100 mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri dish with grid</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1219C98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STO murine fibroblast feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W3513C</td>
			<td>Stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen lite 2012 microscopy software</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>imaging software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling paracrine noncanonical wnt signaling in vitro

Icke-kanonisk Wnt-signalering reglerar intracellulär aktinfilamentorganisation och polariserad migration av stamceller under embryogenesen. Denna process kräver komplexa och samordnade parakrina interaktioner mellan signalsändande och signalmottagande celler. Med tanke på att dessa interaktioner kan uppstå mellan olika typer av celler från olika släktlinjer kan in vivo-utvärdering av cellspecifika defekter vara utmanande. Denna studie beskriver en mycket reproducerbar metod för att utvärdera parakrin icke-kanonisk Wnt-signalering in vitro. Detta protokoll utformades med förmågan att (1) genomföra funktionella och molekylära bedömningar av icke-kanonisk Wnt-signalering mellan två celltyper av intresse; (2) dissekera rollen av signalsändande kontra signalmottagande molekyler i den icke-kanoniska Wnt-signalvägen; och (3) utföra fenotypiska räddningsexperiment med vanliga molekylära eller farmakologiska metoder.
Detta protokoll användes för att utvärdera neurala crest cell (NCC) -medierade icke-kanoniska Wnt-signalering i myoblaster. Närvaron av NCC är associerad med ett ökat antal falloidinpositiva cytoplasmatiska filopodier och lamellipodier i myoblaster och förbättrad myoblastmigration i en sårläkningsanalys. Wnt5a-ROR2-axeln identifierades som en avgörande icke-kanonisk Wnt-signalväg mellan NCC och andra hjärtfält (SHF) kardiomyoblastförfäder. Sammanfattningsvis är detta ett mycket lätthanterligt protokoll för att studera parakrina icke-kanoniska Wnt-signalmekanismer in vitro.

Effekter av NCC på migrationskapaciteten hos murina myoblaster Denna analys tillämpades först för att utvärdera effekterna av NCC på myoblasternas migrationskapacitet. Figur 1 beskriver den schematiska modellen för analysen. För att testa denna påverkan utfördes repanalyser med myoblaster som odlades isolerat (utan NCC-insatser) jämfört med de som odlades i närvaro av skär. Som en positiv kontroll tillsattes 500 ng/ml rekombinant Wnt5a (rWnt5a) till kammarbr...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro at JoVE.com

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Den aktuella studien beskriver en mycket reproducerbar och lätthanterlig metod för att studera parakrina icke-kanoniska Wnt-signaleringshändelser in vitro. Detta protokoll tillämpades för att utvärdera effekten av parakrin Wnt5a-signalering i murina neurala vapenceller och myoblaster.

Modellering Paracrine Noncanonical Wnt Signalering In Vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Detta protokoll beskriver en mycket reproducerbar metod för att funktionellt och molekylärt utvärdera parakrina icke-kanoniska Wnt-signalering i alla cellpopulationer av intresse. Funktionella och molekylära bedömningar utförs i samma cellpopulation och kan tillämpas för att studera alla komponenter i Wnt / PCP-vägen. För att börja, återsuspendera den tidigare pelleterade C2C12-cellen i 10 ml C2C12-medium.För att späda cellerna i förhållandet 1:20, tillsätt 0,5 ml cellsuspension i ett 15 ml rör innehållande 9,5 ml färskt C2C12-medium och blanda försiktigt med en serologisk pipett med en P1000-pipett, tillsätt en milliliter av den utspädda cellsuspensionen till varje brunn i en ny fyrkammarbrunn och placera den i inkubatorn. För plätering av O9-1-cellinsatser, återsuspendera O9-1-cellpelleten i 10 ml O9-1-tillväxtmedium. Och i likhet med C2C12-cellutspädning, späd O9-1-cellerna i förhållandet 1:20.Placera sedan en enda permeabel insats inuti varje brunn i en ny fyrkammarbrunn fylld med en milliliter O9-1 tillväxtmedium. Tillsätt 300 mikroliter av den utspädda O9-1-cellsuspensionen till varje insats och se till att insatsen är helt nedsänkt. Inkubera sedan brunnen vid 37 grader Celsius.För att utföra siRNA-knockdown i O9-1-cellerna, späd siRNA och transfektionsreagens i det reducerade serummediet enligt tillverkarens rekommendationer vid önskade koncentrationer. Blanda försiktigt det utspädda siRNA och transfektionsreagenset och inkubera blandningen vid rumstemperatur i sju minuter. Efter 18 till 24 timmars cellplätering, tillsätt siRNA-lipidkomplexen till O9-1-cellinsatserna och inkubera i cirka 34 till 48 timmar.När cellerna når 70 till 80% sammanflöde, ta bort mediet från C2C12-kammaren väl och tvätta cellerna en gång med PBS. Efter att ha tagit bort PBS, börja skrapa cellerna genom att passera en steril P10-pipettspets ordentligt i en enda riktning för att sträcka sig över hela längden eller bredden på cellmonoskiktet. När cellerna är repade, tillsätt snabbt en milliliter PBS.Slå sedan på datorn och mikroskopet. Placera kammarbilden på scenen och vrid målratten till 5X förstoring. Öppna bildbehandlingsprogrammet.Klicka på kamerafliken och klicka sedan på Live-knappen för att visualisera cellerna på fliken AxioCam IC. Se till att ljusfiltret dras hela vägen ut så att ljus kan passera till kameran och datorskärmen, flytta eller rotera kammarbilden manuellt för att placera sårområdet i mitten av livebilden på fliken AxioCam IC. Om du vill ta bilder klickar du på fäst för att öppna en ny flik bredvid fliken AxioCam IC som innehåller bilden.För att spara den här stillbilden, klicka på filen, välj spara som, välj skrivbord i fältet till vänster för att spara filen på skrivbordet, ange filnamnet i filnamnsrutan och spara figuren i czi-filformat. Om du vill spara bilden som en tiff klickar du på fil, väljer spara som, anger filnamnet i rutan filnamn. Klicka på knappen Spara som typ och välj tiff från rullgardinsmenyn.Flytta kammarbilden manuellt för att ta ytterligare två till tre bilder vid andra punkter i såret i samma brunn. Efter avbildning, ta bort PBS från varje brunn och tillsätt en milliliter C2C12-medium. Montera brunnsinsatsens samodlingssystem genom att manuellt placera insatserna som innehåller O9-1-cellerna i varje brunn i kammarbrunnen.Tryck försiktigt ner insatserna i brunnen, så att insatsens botten sitter strax ovanför de underliggande C2C12-cellerna. Återställ brunnsinsatskonstruktionerna till inkubatorn och låt cellerna migrera i totalt nio till 12 timmar. För att bestämma den optimala migrationstiden, kontrollera cellerna sex timmar efter sårskapande, sedan varannan till var tredje timme efter det.Avsluta experimentet när cellerna under kontrollförhållanden helt täcker såret. Börja migreringsanalysavslutningen och dekonstruktionen av systemet väl genom att ta bort O9-1-cellinsatserna efter nio till 12 timmar av migreringsperioden. Aspirera försiktigt C2C12-mediet.Tillsätt 0,5 ml PBS till kammarbrunnarna och ta slutliga bilder av celler efter migrering. Aspirera försiktigt alla PBS blandade med medium och ta bort plastkamrarna från kammarbrunnarna med hjälp av kitinstruktioner. Lämna den underliggande bilden som innehåller C2C12-cellerna.För immunfärgning, inkubera omedelbart bilden med 4% paraformaldehyd i 10 minuter vid rumstemperatur. Ta sedan bort paraformaldehyd och tvätta bilden med 0,1% Triton X-100 innehållande PBST i 15 minuter vid rumstemperatur. Häll ut PBST efter 15 minuter och tvätta bilden två gånger med PBS i 10 minuter vardera.Skapa sedan en hydrofob gräns med en hydrofob penna runt bilden för att förhindra att lösningar spills från bilden och förhindrar störningar i vidhäftningscellerna. Tillsätt sedan cirka 0,5 ml 1% BSA-blockeringslösning till bilden inom den hydrofoba gränsen och inkubera bilden i en timme vid rumstemperatur i en fuktad glidkammare. Vid slutet av inkubationen, ta bort blockeringslösningen och tillsätt falloidinantikroppen till denna bild inom den hydrofoba gränsen och inkubera vid fyra grader Celsius över natten.Nästa dag, placera bilden i en glidhållare skyddad från ljusexponering. Tvätta cellerna tre gånger med PBS i 10 minuter vardera vid rumstemperatur. Lägg till DAPI-innehållande monteringsmedium, montera bilderna med glaslock och fånga cellerna med ett vanligt fluorescensmikroskop.I den aktuella studien accelererade tillsatsen av rekombinant Wnt5a till samodlingsbrunnar myoblastmigration med fullständig återhämtning av vissa områden med nio timmar. De migrerande myoblasterna uppvisade under alla tre tillstånden normal migrerande cellulär morfologi, inklusive välformad och utskjutande filopodia och lamellipodi och asymmetrisk polarisering av aktincytoskelettprojektioner. Den parakrina effekten av NCC-härledd Wnt5a på myoblastmigration studerades.Behandling med 50 nanomolärt siRNA mot Wnt5a minskade Wnt5a-genuttrycket med 64% jämfört med negativ kontroll. Migrationen av C2C12 mils sprängningar med signifikant reducerad efter Wnt5a-knockdown i NCC och tillägget av exogen rekombinant Wnt5a räddade detta migrerande underskott och morfologiska defekt i dessa myoblaster. För att bättre förstå de signalmottagande cellmekanismerna i den parakrina modellen slogs ROR2-receptorn ner och genuttrycket reducerades med 54% Knockdown av ROR2 i myoblaster minskar deras migrationskapacitet trots närvaron av NCC.Exogen rekombinant Wnt5a misslyckades med att rädda myoblastmigration efter ROR2-knockdown, vilket tyder på att ROR2-utarmning stör myoblasternas förmåga att ta emot Wnt5a-signaler. Odlingsceller till tillräcklig densitet repa med P10-spets endast en gång montera och omonterat samodlingssystem med försiktighet utan att störa underliggande cell. Denna teknik användes som ett bevis på koncept för att studera en specifik molekylär signalaxel inom den komplexa Wnt / PCP-vägen med relevans för neural crest cell och andra hjärtfältbiologi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymic Settling stamfäder i Mouse Embryo Använda<em&gt; In Vivo</em&gt; Och<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

Använda Konfokal Analys av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Att undersöka modulatorer av Wnt och Shh Morfogen övertoningar

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Studera Wnt Signaling Under Mönstring av ledande Airways

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Stimulering av Notch signalering i mus osteoklastprekursorer

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Exakt cellablationsmetod för modellering av akut njurskada vid utveckling av sebrafisk

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Analys av Epididymal proteinsyntes och utsöndring

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

RNA-baserade omprogrammering av mänskliga primära fibroblaster till inducerade pluripotenta stamceller

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

En samkulturmetod för att studera neurite utväxt som svar på dentalmassa paracrine signaler

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

Protokoll för humana blastoider modellering blastocystutveckling och implantation

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...