Disse protokoller tjener som retningslinjer for bedste praksis for knoglepulvergenerering til brug i nedstrøms DNA-ekstraktion på tværs af en række skeletelementer. Der er et par offentliggjorte gamle DNA-prøveudtagningsprotokoller for andre steder end dentinet og petrouspyramiden. I dag viser vi de detaljerede prøveudtagningsmetoder for tre alternativer.
Disse metoder viser også et stort potentiale for brug med nedbrudte retsmedicinske rester, men også som udgangspunkt for udvikling af lignende teknikker med ikke-menneskelige prøver. Udfør alle prøveudtagninger i et dedikeret rent rum under en UV-lysudstyret PCR-hætte eller biosikkerhedsskab. Sluk for luftstrømmen, og spred steril aluminiumsfolie over bordpladen for at fange vildfaren knoglepulver eller fragmenter.
Læg et ark vejepapir i en steril vejebakke. Hold den dekontaminerede kindtand ved emaljen med roden nedad over en vejebakke ved hjælp af en håndholdt klemme. Udstyr en tandbor med et diamantkantet cirkulært skærehjul.
Når boret er indstillet til en medium hastighedsindstilling, skal du let røre ved borets kant til roden i en vinkel på ca. 20 grader. Skrab prøven nedad i bakken for at samle det gule, yderste materiale fra roden. Stop indsamlingen, når det lettere materiale i dentinet bliver synligt.
Overfør pulveret til et to milliliter LoBind Safe-Lock-rør, og registrer denne opsamlede masse pulver ved hjælp af en lukket balance med en nøjagtighed på mindst 0,01 milligram. Overfør pulveret fra vejepapiret til et to milliliter LoBind Safe-Lock-rør til ekstraktion. Opbevar dette rør ved 20 grader Celsius.
Sørg for at genvinde alle knoglefragmenter og så meget pulver som muligt. Skift folien mellem hver prøveudtagning, og bortskaf den brugte folie i en autoklavelig biohazardpose. Dekontaminere arbejdsområdet og spred steril aluminiumsfolie over bordpladen hver gang, før du går videre til næste knogle.
Læg et lille ark vejepapir i en standardvejebakke. Fjern og kassér det yderste lag af den kortikale knogle i den overlegne hvirvelbue ved hjælp af en tandbor. Fastgør derefter hvirvlerne i en håndklemme med den spinøse proces udad og overlegen aspekt nedad.
Mens du holder hvirvlen, skal du bore opad i midten af det V-formede hak, dannet ved fusion af den spinøse proces med lamellerne med lav hastighed og højt drejningsmoment. Stop boringen, når der er et mærkbart fald i modstanden. Skift borepositionen lidt, og gentag, indtil 50 til 100 milligram knoglepulver er opsamlet.
Overfør knoglepulveret fra vejepapiret til et to milliliter LoBind-rør til ekstraktion, og opbevar det ved 20 grader Celsius. Sørg for, at alle knoglefragmenter og så meget pulver som muligt genvindes, inden en folie bortskaffes. Dekontaminere arbejdsområdet og forberede sig på prøveindsamling som tidligere beskrevet.
Læg et lille ark vejepapir i en standardvejebakke. Hold taluskuplen opad og den mediale overflade mod samleren over vejebakken. Skrab kortikal knogle til en dybde på cirka en millimeter fra halsen af talus ved hjælp af en tandbor med en lavmåler bit indstillet til lav hastighed og højt drejningsmoment.
Skift boreposition og gentag dette, indtil ca. 50 til 100 milligram knoglepulver er opsamlet. Overfør dette knoglepulver fra vejepapiret til et to milliliter LoBind-rør til ekstraktion. Opbevar pulveret ved 20 grader Celsius på ubestemt tid.
Opbevar den resterende knogle og overskydende pulver i et tørt, temperaturstyret sterilt miljø ved 25 grader Celsius. Bortskaf alt affald i autoklave biohazardposer eller beholdere. Steriliser eller dekontaminerer alt genanvendeligt udstyr og udsæt det for UV mellem hver prøveudtagning.
Pars petrosa gav højere endogent DNA end de andre 23 undersøgte anatomiske prøveudtagningssteder. De syv yderligere anatomiske prøveudtagningssteder, der præsenteres i denne protokol, gav de næsthøjeste udbytter. De alternative placeringer producerede konsekvent DNA-udbytter, der er tilstrækkelige til standardpopulationsgenetiske analyser.
Duplikeringsrater i biblioteker, der stammer fra alle anatomiske prøveudtagningssteder, var lave, hvilket indikerer høj kompleksitet. Tænderne såvel som brysthvirvlerne viste tilstrækkelig molekylær genopretning. Et af de mest udfordrende aspekter ved knogleprøvetagning er boreprocessen, såsom hvordan man holder en boremaskine, hvor man skal bore, og hvornår man skal stoppe boringen.