ये प्रोटोकॉल कंकाल तत्वों की एक श्रृंखला में डाउनस्ट्रीम डीएनए निष्कर्षण में उपयोग के लिए हड्डी पाउडर उत्पादन के लिए सर्वोत्तम अभ्यास दिशानिर्देशों के रूप में काम करते हैं। डेंटिन और पेट्रोस पिरामिड के अलावा अन्य स्थानों के लिए कुछ प्रकाशित प्राचीन डीएनए नमूना प्रोटोकॉल हैं। आज, हम तीन विकल्पों के लिए विस्तृत नमूना विधियों को दिखाएंगे।
ये विधियां अवक्रमित फोरेंसिक अवशेषों के साथ उपयोग के लिए बड़ी क्षमता भी दिखाती हैं, लेकिन गैर-मानव नमूनों के साथ समान तकनीकों को विकसित करने के लिए आधार रेखा के रूप में भी। यूवी प्रकाश से लैस पीसीआर हुड या जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक समर्पित साफ कमरे में सभी नमूने करें। एयरफ्लो बंद करें और किसी भी आवारा हड्डी पाउडर या टुकड़ों को पकड़ने के लिए बेंच टॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
वजन कागज की एक शीट को बाँझ वजन ट्रे में रखें। एक हैंडहेल्ड क्लैंप का उपयोग करके, तामचीनी द्वारा परिशोधन किए गए दाढ़ को पकड़ें, जिसमें जड़ को वजन ट्रे के ऊपर नीचे की ओर रखा जाए। हीरे की धार वाले गोलाकार कटिंग व्हील के साथ एक दंत ड्रिल को लैस करें।
ड्रिल को मध्यम गति सेटिंग पर सेट करने के साथ, ड्रिल के किनारे को लगभग 20 डिग्री के कोण पर जड़ तक हल्के से स्पर्श करें। जड़ से पीले, सबसे बाहरी सामग्री को इकट्ठा करने के लिए नमूने को ट्रे में नीचे की ओर खुरचें। एक बार डेंटिन की हल्की सामग्री दिखाई देने के बाद संग्रह बंद कर दें।
पाउडर को दो मिलीलीटर लोबिंद सेफ-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कम से कम 0.01 मिलीग्राम की सटीकता के साथ संलग्न संतुलन का उपयोग करके पाउडर के इस एकत्रित द्रव्यमान को रिकॉर्ड करें। निष्कर्षण के लिए पाउडर को तौल पेपर से दो मिलीलीटर लोबिंद सेफ-लॉक ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस ट्यूब को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
सभी हड्डी के टुकड़ों और जितना संभव हो उतना पाउडर को पुनर्प्राप्त करना सुनिश्चित करें। प्रत्येक नमूने के बीच पन्नी को बदलें, एक ऑटोक्लेवेबल बायोहाजार्ड बैग में इस्तेमाल की गई पन्नी का निपटान करें। अगली हड्डी में जाने से पहले हर बार काम के क्षेत्र को अलग करें और बेंच टॉप पर बाँझ एल्यूमीनियम पन्नी फैलाएं।
वजन कागज की एक छोटी शीट को एक मानक वजन ट्रे में रखें। दंत ड्रिल का उपयोग करके बेहतर कशेरुक मेहराब की कॉर्टिकल हड्डी की सबसे बाहरी परत को हटा दें और त्याग दें। फिर, कशेरुकाओं को एक हैंड क्लैंप में सुरक्षित करें, जिसमें घुमावदार प्रक्रिया बाहर की ओर और बेहतर पहलू नीचे हो।
कशेरुका को पकड़ते समय, वी-आकार के नॉच के केंद्र में ऊपर की ओर ड्रिल करें, जो कम गति और उच्च टोक़ के साथ लैमेला के साथ स्पिनस प्रक्रिया के संलयन से बनता है। प्रतिरोध में ध्यान देने योग्य गिरावट होने पर ड्रिलिंग बंद करें। ड्रिलिंग स्थिति को थोड़ा बदलें, और 50 से 100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र होने तक दोहराएं।
निष्कर्षण के लिए वजन कागज से हड्डी पाउडर को दो मिलीलीटर लोबिंड ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि एक पन्नी के निपटान से पहले सभी हड्डी के टुकड़े और जितना संभव हो उतना पाउडर बरामद किया जाए। कार्य क्षेत्र को दूषित करें और नमूना संग्रह के लिए तैयार करें, जैसा कि पहले वर्णित है।
एक मानक वजन ट्रे में वजन कागज की एक छोटी शीट रखें। तालस गुंबद को ऊपर की ओर रखें, और वजन ट्रे के ऊपर कलेक्टर की ओर मध्यवर्ती सतह रखें। कम गति और उच्च टोक़ के लिए कम गेज बिट सेट के साथ एक दंत ड्रिल का उपयोग करके टैलस की गर्दन से लगभग एक मिलीमीटर की गहराई तक कॉर्टिकल हड्डी को स्क्रैप करें।
ड्रिलिंग स्थिति को बदलें और इसे तब तक दोहराएं जब तक कि लगभग 50 से 100 मिलीग्राम हड्डी पाउडर एकत्र न हो जाए। निष्कर्षण के लिए इस हड्डी पाउडर को वजन कागज से दो मिलीलीटर लोबिंड ट्यूब में स्थानांतरित करें। पाउडर को अनिश्चित काल के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
शेष हड्डी और अतिरिक्त पाउडर को 25 डिग्री सेल्सियस पर सूखे, तापमान-नियंत्रित बाँझ वातावरण में स्टोर करें। सभी कचरे को आटोक्लेव बायोहाजार्ड बैग या रिसेप्टेकल्स में निपटाएं। सभी पुन: प्रयोज्य उपकरणों को निष्फल या विघटित करें और प्रत्येक नमूने के बीच इसे यूवी में उजागर करें।
पार्स पेट्रोसा ने सर्वेक्षण किए गए अन्य 23 शारीरिक नमूना स्थानों की तुलना में उच्च अंतर्जात डीएनए प्राप्त किया। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सात अतिरिक्त शारीरिक नमूना स्थानों ने अगली उच्चतम पैदावार का उत्पादन किया। वैकल्पिक स्थानों ने मानक जनसंख्या आनुवंशिकी विश्लेषण के लिए लगातार पर्याप्त डीएनए पैदावार का उत्पादन किया।
सभी शारीरिक नमूना स्थानों से उपजी पुस्तकालयों में दोहराव दर कम थी, जो उच्च जटिलता का संकेत देती है। दांतों के साथ-साथ वक्ष कशेरुक ने पर्याप्त आणविक वसूली दिखाई। हड्डी के नमूने के सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक ड्रिलिंग प्रक्रिया है, जैसे कि ड्रिल कैसे पकड़ना है, कहां ड्रिल करना है, और ड्रिलिंग को कब रोकना है।