Esses protocolos servem como diretrizes de melhores práticas para a geração de pó ósseo para uso na extração de DNA a jusante em uma variedade de elementos esqueléticos. Existem alguns protocolos de amostragem de DNA antigos publicados para outros locais além da dentina e da pirâmide petrosa. Hoje, mostraremos os métodos de amostragem detalhados para três alternativas.
Esses métodos também mostram grande potencial para uso com restos forenses degradados, mas também como uma linha de base para o desenvolvimento de técnicas semelhantes com espécimes não humanos. Realize todas as amostragens em uma sala limpa dedicada, sob um capô de PCR equipado com luz UV ou gabinete de biossegurança. Desligue o fluxo de ar e espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada para pegar qualquer pó ou fragmento de osso perdido.
Coloque uma folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem estéril. Segure o molar descontaminado pelo esmalte com a raiz voltada para baixo sobre uma bandeja de pesagem, usando uma braçadeira de mão. Equipe uma broca dentária com uma roda de corte circular com bordas de diamante.
Com a broca ajustada para uma configuração de velocidade média, toque levemente a borda da broca na raiz em um ângulo de aproximadamente 20 graus. Raspe a amostra para baixo na bandeja para coletar o material amarelo e mais externo da raiz. Pare a coleta assim que o material mais leve da dentina se tornar visível.
Transfira o pó para um tubo LoBind Safe-Lock de dois mililitros e registre essa massa de pó coletada usando uma balança fechada com uma precisão de pelo menos 0,01 miligrama. Transfira o pó do papel de pesagem para um tubo LoBind Safe-Lock de dois mililitros para extração. Armazene este tubo a 20 graus Celsius.
Certifique-se de recuperar todos os fragmentos ósseos e o máximo de pó possível. Troque a folha entre cada amostragem, descartando a folha usada em um saco de risco biológico autoclavável. Descontamine a área de trabalho e espalhe a folha de alumínio estéril pela bancada todas as vezes antes de passar para o próximo osso.
Coloque uma pequena folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem padrão. Remova e descarte a camada mais externa do osso cortical da arcada vertebral superior usando uma broca dentária. Em seguida, prenda as vértebras em uma braçadeira manual, com o processo espinhoso para fora e o aspecto superior para baixo.
Enquanto segura a vértebra, perfure para cima no centro do entalhe em forma de V, formado pela fusão do processo espinhoso com as lamelas com baixa velocidade e alto torque. Pare de perfurar quando houver uma queda perceptível na resistência. Mude ligeiramente a posição de perfuração e repita até que 50 a 100 miligramas de pó ósseo sejam coletados.
Transfira o pó ósseo do papel de pesagem para um tubo LoBind de dois mililitros para extração e armazene-o a 20 graus Celsius. Certifique-se de que todos os fragmentos ósseos e o máximo de pó possível sejam recuperados antes de descartar uma folha. Descontaminar a área de trabalho e preparar para a coleta de amostras, conforme descrito anteriormente.
Coloque uma pequena folha de papel de pesagem em uma bandeja de pesagem padrão. Segure a cúpula do tálus para cima e a superfície medial em direção ao coletor, sobre a bandeja de pesagem. Raspe o osso cortical a uma profundidade de aproximadamente um milímetro do pescoço do tálus usando uma broca dentária com uma broca de baixa calibre ajustada para baixa velocidade e alto torque.
Mude a posição de perfuração e repita isso até que aproximadamente 50 a 100 miligramas de pó ósseo sejam coletados. Transfira este pó ósseo do papel de pesagem para um tubo LoBind de dois mililitros para extração. Armazene o pó a 20 graus Celsius indefinidamente.
Armazene o osso restante e o excesso de pó em um ambiente seco e estéril com temperatura controlada a 25 graus Celsius. Eliminar todos os resíduos em sacos ou recipientes de risco biológico em autoclave. Esterilizar ou descontaminar todos os equipamentos reutilizáveis e expô-los aos raios UV entre cada amostragem.
A Pars petrosa produziu DNA endógeno mais alto do que os outros 23 locais de amostragem anatômica pesquisados. Os sete locais adicionais de amostragem anatômica apresentados neste protocolo produziram os próximos maiores rendimentos. Os locais alternativos consistentemente produziram rendimentos adequados para análises genéticas populacionais padrão.
As taxas de duplicação em bibliotecas provenientes de todos os locais de amostragem anatômica foram baixas, indicando alta complexidade. Os dentes, bem como as vértebras torácicas, apresentaram recuperação molecular adequada. Um dos aspectos mais desafiadores da amostragem óssea é o processo de perfuração, como segurar uma broca, onde perfurar e quando parar a perfuração.
