Эти протоколы служат руководящими принципами наилучшей практики для генерации костного порошка для использования в последующей экстракции ДНК через ряд скелетных элементов. Есть несколько опубликованных древних протоколов отбора проб ДНК для мест, отличных от дентина и пирамиды Петроуса. Сегодня мы покажем подробные методы выборки для трех альтернатив.
Эти методы также демонстрируют большой потенциал для использования с деградировавшими криминалистическими останками, а также в качестве основы для разработки аналогичных методов с нечеловеческими образцами. Выполняйте все отборы проб в специальной чистой комнате, под вытяжкой ПЦР, оснащенной ультрафиолетовым светом, или шкафом биобезопасности. Выключите воздушный поток и распределите стерильную алюминиевую фольгу по столешнице, чтобы поймать любой случайный костный порошок или фрагменты.
Поместите лист бумаги для взвешивания в стерильный лоток для взвешивания. Удерживайте обеззараженный моляр эмалью корнем вниз над поддоном для взвешивания, используя ручной зажим. Оснастите зубную бормашину круглым режущим колесом с алмазной окантовкой.
Установив сверло на среднюю скорость, слегка прикоснитесь краем сверла к корню под углом примерно 20 градусов. Соскоблите образец вниз в лоток, чтобы собрать желтый, самый внешний материал из корня. Прекратите сбор, как только более легкий материал дентина станет видимым.
Переложите порошок в двухмиллилитровую трубку LoBind Safe-Lock и запишите эту собранную массу порошка с помощью закрытого баланса с точностью не менее 0,01 миллиграмма. Перенесите порошок из бумаги для взвешивания в двухмиллилитровую трубку LoBind Safe-Lock для экстракции. Храните эту трубку при температуре 20 градусов по Цельсию.
Убедитесь, что восстановлены все костные фрагменты и как можно больше порошка. Меняйте фольгу между каждым отбором проб, утилизируя использованную фольгу в автоклавируемый мешок биологической опасности. Обеззараживайте рабочую зону и каждый раз распределяйте стерильную алюминиевую фольгу по столешнице перед переходом к следующей кости.
Поместите небольшой лист бумаги для взвешивания в стандартный лоток для взвешивания. Удалите и отбросьте самый внешний слой кортикальной кости верхней дуги позвонка с помощью бормашины. Затем закрепите позвонки в ручном зажиме, с остистым отростком наружу и верхним аспектом вниз.
Удерживая позвонок, просверлите вверх в центр V-образную выемку, образованную слиянием остистого отростка с ламелями с низкой скоростью и высоким крутящим моментом. Прекращайте бурение, когда происходит заметное падение сопротивления. Слегка измените положение сверления и повторяйте до тех пор, пока не будет собрано от 50 до 100 миллиграммов костного порошка.
Переложите костный порошок из весовой бумаги в двухмиллилитровую трубку LoBind для экстракции и храните ее при 20 градусах Цельсия. Убедитесь, что все костные фрагменты и как можно больше порошка извлечены перед утилизацией фольги. Обеззаражьте рабочую зону и подготовьтесь к сбору проб, как описано ранее.
Поместите небольшой лист бумаги для взвешивания в стандартный лоток для взвешивания. Держите купол талуса вверх и медиальную поверхность к коллектору над поддоном для взвешивания. Соскоблите кортикальную кость на глубину примерно одного миллиметра от шейки таранной кости с помощью зубной бормашины с низкокалиберным долотом, настроенным на низкую скорость и высокий крутящий момент.
Измените положение сверления и повторяйте это до тех пор, пока не будет собрано примерно от 50 до 100 миллиграммов костного порошка. Перенесите этот костный порошок из весовой бумаги в двухмиллилитровую трубку LoBind для экстракции. Храните порошок при температуре 20 градусов Цельсия неограниченное время.
Храните оставшуюся кость и избыток порошка в сухой стерильной среде с контролируемой температурой при температуре 25 градусов цельсия. Утилизируйте все отходы в автоклавные биологически опасные мешки или сосуды. Стерилизуйте или обеззараживайте все многоразовое оборудование и подвергайте его воздействию ультрафиолета между каждым отбором проб.
Pars petrosa дала более высокую эндогенную ДНК, чем другие 23 исследованных анатомических места отбора проб. Семь дополнительных анатомических мест отбора проб, представленных в этом протоколе, дали следующий по величине урожай. Альтернативные места, в которых последовательно производится ДНК, дает достаточные результаты для стандартного анализа популяционной генетики.
Частота дублирования в библиотеках, происходящих из всех анатомических мест отбора проб, была низкой, что указывает на высокую сложность. Зубы, а также грудные позвонки показали адекватное молекулярное восстановление. Одним из наиболее сложных аспектов отбора проб кости является процесс сверления, например, как держать сверло, где сверлить и когда прекращать бурение.
