גישות קרטוגרפיה כימית לחקר זיהום טריפנוסומטיד

פרוטוקול זה יכול לשמש לבניית מודלים תלת-ממדיים של מטבוליט והפצת טפילים. זה יכול לעזור בהבנת הקשר בין הפרעה מטבולית רקמות מקומיות, הפצת טפילים, ותסמיני מחלות קליניות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת מיפוי חוצה איברים בקנה מידה חי של התפלגות מטבוליט לעומת התפלגות פתוגן וניתוח סטטיסטי שלה.

תיאורטית, קרטוגרפיה כימית יכולה לחקור את התפתחות המחלה והשפעתה על הפונדקאי על ידי בחינה ישירה של המטבוליטים האחראים לפתוגנזה ולהשפעות הטיפול. התחל על ידי שקילה ותיוג הצינורות. חלק את הרקמות באופן שיטתי עם חלק אחד לכל צינור.

לשקול את הצינורות המכילים דגימות רקמות כדי לקבוע את משקל המדגם ולתעד את המשקל. כדי לבצע הומוגניזציה על בסיס מים של דגימות הרקמות, הוסף חרוז נירוסטה אחד חמישה מילימטר לצינורות מיקרוצנטריפוגה שני מיליליטר המכילים דגימות רקמות. צור צינור ריק אחד המכיל מים בדרגת LCMS.

הפוך את הנפח ל 500 microliters לכל 50 מיליגרם של המדגם על ידי הוספת מים כיתה LCMS מצוננים, ולאחר מכן הומוגניזציה דגימות ב 25 הרץ במשך שלוש דקות. דגימות צריך להיות הומוגני לחלוטין. לאסוף 1/10th של נפח הומוגניזציה עבור מיצוי DNA וניתוחים אחרים.

הוסף מתנול כיתה LCMS קר כקרח ממוסמר עם ארבעה מיקרומולר של sulfachloropyridazine להומוגנט. הומוגניזציה דגימות ברקמות הומוגניזר ב 25 הרץ במשך שלוש דקות, ואחריו צנטריפוגה במשך 10 דקות. לאסוף נפח שווה של supernatant לתוך צלחת 96 באר ולשמור שאריות מוצקות על קרח תוך איסוף supernatants.

יבש את מיצוי מימית supernatant לחלוטין באמצעות מהירות מקסימלית וללא חימום. בצע מיצוי אורגני על ידי הוספת 1, 000 מיקרוליטרים של מתנול דיכלורומתאן צונן מראש מתובל עם שני מיקרומולרי sulfachloropyridazine לכל 50 מיליגרם של דגימת שאריות מוצקות. דגימות הומוגניזציה ב 25 הרץ במשך חמש דקות, ואחריו צנטריפוגה במשך 10 דקות.

לאסוף נפח שווה של supernatant לתוך צלחת 96 באר. צלם תמונה של איבר העניין. לחץ על קובץ ולאחר מכן לייבא בתוכנת SketchUp כדי לייבא תמונה של האיברים מעניינים.

לחץ על הכלי קווים ובחר את האפשרות ביד חופשית. השתמש בכלי העיפרון כדי לעקוב ולצייר את קווי המתאר של איברי העניין. בחרו בכלי הדחיפה/משיכה ומשכו כלפי מעלה את האזור המוצל כדי להמיר את הציור מדו-ממד לתלת-ממד.

יצא את הקובץ בתבנית Dae על-ידי לחיצה על ייצוא קבצים ולאחר מכן על דגם תלת-ממד. כדי לשפר את הריאליזם של המודל, יבא את המודל לתוכנת MeshLab על-ידי בחירה באפשרות קובץ ולאחר מכן לחיצה על ייבוא רשת שינוי. בחר מסגרת תיל בתפריט העליון ולאחר מכן בחר מסננים, לחץ על פישוט ושחזור של Remeshing ולאחר מכן על נקודת אמצע של משטחי חלוקה משנית.

השאר את כל הערכים כברירת מחדל ובחר החל פעמיים. יצא את המודל בתבנית sdl על-ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן על ייצוא רשת שינוי As ולאחר מכן בחירה בתבנית קובץ SDL בתפריט הנפתח קבצים מסוג. שמור אפשרות זו ובחר אישור בתפריט המוקפץ הבא.

פתח את תוכנת Meshmixer וייבא את קובץ ה- sdl שנוצר בשלב הקודם. השתמש בפיסול, מברשות, פיסול דרקון, מברשות, לנפח כלים כדי לשלוף את משטחי המודל כי צריך להיות מעוגל החוצה. שמור אותו בתבנית sdl ברגע שלדגם יש את המראה הרצוי על-ידי לחיצה על קובץ וייצוא.

תן שם לקובץ כרצונך, בחר בתבנית הבינארית של SDL ושמור. פתחו את דגם התלת-ממד בתוכנת MeshLab. לחץ על אישור בחלון המוקפץ של העיבוד הפתוח לאחר הפתיחה.

השג קואורדינטות X, Y ו- Z עבור כל נקודת דגימה על-ידי בחירה בכלי נקודות איסוף ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני במרווחי זמן קבועים על פני משטח הדגם התלת-ממדי. לאחר שכל הקואורדינטות הרצויות נבחרו, לחץ על לחצן השמירה העליון בחלון המוקפץ של הטופס. בתוכנת גיליון אלקטרוני, פתח את קובץ ה- pp שנוצר בשלב הקודם.

התאם את תצוגת הנתונים על-ידי לחיצה על טקסט נתונים לעמודות ולאחר מכן מופרד. לחץ על הבא ולאחר מכן בחר רווח ולחץ על סיום. אתחל מחדש כך שרק ערכים מספריים יישארו בתאי הגיליון האלקטרוני על-ידי בחירה באפשרות חיפוש הבית ובחר החלף.

בתיבה חפש את, הזן מעיל שווה Y ולהשאיר את תיבת ההחלפה ריקה. לחץ על החלף הכל ולאחר מכן על אישור. חזור על הפעולה עבור מעיל שווה X ועבור מעיל שווה Z ועבור קו נטוי מעיל גדול מ. בטבלת התוכנה של הגיליון האלקטרוני, שורות תואמות לכל מיקום ועמודות לנתונים.

הדבק את שפע תכונות המטה-נתונים והמטבוליט המתאימות בעמודות הגיליון האלקטרוני הבאות. בעמודת הרדיוס, הזינו את הגודל הרצוי של כתמי הדגימה שיש להציגם באופן חזותי בדגם. קבע את הערכים עבור הרדיוס באופן אמפירי ושמור את הקובץ בתבנית CSV.

נווטו אל תוכנת ELI Plot, בחרו 'משטח' ולאחר מכן גררו ושחררו את דגם התלת-ממד שנוצר בחלון הדפדפן. גרור ושחרר את טבלת התכונות שנוצרה באותו חלון דפדפן. השתמשו במקרא בפינה השמאלית התחתונה כדי להקרין את עמודת הנתונים הרצויה במודל התלת-ממד.

בחר ברצף כל עמודת נתונים כדי להעריך את ההתפלגות של תכונת מטבוליט זו בדגם התלת-ממד. ניתוח זה הוביל לטבלה של 5, 502 תכונות ואת ההדמיה שלהם בתלת-ממד. גישה זו מאפשרת הדמיה של תכונות מטבוליט בבעלי חיים בודדים כי הם גבוהים באתר של עומס טפיל גבוה, מטבוליטים עם הפצה דיפרנציאלית על פני אזורי רקמות ותכונות מטבוליט הנמצאים ברמות דומות על פני מעיים קטנים וגדולים.

חשוב לזכור להשתמש רק בממסים LCMS ולאסוף את כל הרקמה הסמוכה ולחלץ את המטבוליטים עבור כל הדגימות שנאספו כדי למנוע פערים במפות מרחביות. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הדרישות התזונתיות עבור קולוניזציה רקמות על ידי טפילים Trypanosomatid כדי להבין פתוגנזה המחלה באמצעות השוואת מפות התפלגות מטבוליטים 3D עם זיהום.