Denne protokollen kan brukes til å bygge 3D-modeller av metabolitt og parasittdistribusjon. Dette kan bidra til å forstå forholdet mellom lokal vevsmetabolisk perturbasjon, parasittfordeling og kliniske sykdomssymptomer. Den største fordelen med denne metoden er at den muliggjør liveskala kryssorgankartlegging av metabolittfordeling versus patogenfordeling og dens statistiske analyse.
Teoretisk sett kan kjemisk kartografi utforske utviklingen og virkningen av sykdommen på verten ved å direkte undersøke metabolittene som er ansvarlige for patogenesen og effekten av behandlingen. Begynn med å veie og merke rørene. Seksjon vevet systematisk med en seksjon per rør.
Vei rørene som inneholder vevsprøver for å bestemme prøvevekten og registrere vekten. For å utføre vannbasert homogenisering av vevsprøvene, legg til en fem millimeter rustfritt stålperle til de to milliliter mikrocentrifugerørene som inneholder vevsprøver. Lag ett tomt rør som inneholder LCMS-vann.
Utgjør volumet til 500 mikroliter per 50 milligram av prøven ved å tilsette kjølt LCMS-klasse vann, og homogeniser deretter prøver ved 25 hertz i tre minutter. Prøver bør homogeniseres grundig. Samle 1/10th av homogeniseringsvolumet for DNA-ekstraksjon og andre analyser.
Tilsett iskald metanol av LCMS-klasse med fire mikromolar sulfachloropyridazine til homogenatet. Homogeniser prøver i en vevshomogenisator ved 25 hertz i tre minutter, etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter. Samle et likt volum supernatant i en 96 brønnplate og hold faste rester på is mens du samler supernatantene.
Tørk den vandige ekstraksjonen supernatant helt ved hjelp av maksimal hastighet og ingen oppvarming. Utfør organisk ekstraksjon ved å tilsette 1000 mikroliter kjølt dichlorometan metanol pigget med to mikromolar sulfachloropyridazine per 50 milligram fast restprøve. Homogeniser prøver ved 25 hertz i fem minutter, etterfulgt av sentrifugering i 10 minutter.
Samle et likt volum supernatant i en 96 brønnplate. Ta et bilde av interesseorganet. Klikk på Fil, og importer deretter i SketchUp-programvaren for å importere et bilde av organene av interesse.
Klikk på linjeverktøyet og velg frihåndsalternativet. Bruk blyantverktøyet til å spore og tegne konturene av organene av interesse. Velg push/pull-verktøyet og dra opp på det skyggelagte området for å konvertere tegningen fra 2D til 3D.
Eksporter filen i dae-format ved å klikke på Fileksport og deretter 3D-modell. For å forbedre modellens realisme, importer modellen til MeshLab-programvare ved å velge File, og klikk deretter på Import Mesh. Velg Trådramme på toppmenyen, velg Filtre, klikk på Forenkling og rekonstruksjon av omforming og rekonstruksjon, og velg deretter Midtpunkt for underinndelingsflater.
La alle verdier være standard, og velg Bruk to ganger. Eksporter modellen i sdl-format ved å klikke på Fil, deretter på Eksporter Mesh As, og velg deretter SDL-filformat i filene av typen rullegardinmeny. Lagre dette og velg OK i neste popup-meny.
Åpne Meshmixer-programvaren og importer sdl-filen som ble generert i forrige trinn. Bruk sculpt, børster, drage skulptur, børster, blåse opp verktøy for å trekke ut modellen overflater som må avrundes ut. Lagre den i sdl-format når modellen har ønsket utseende ved å klikke på Fil og eksporter.
Gi filen et navn etter ønske, velg SDL-binærformatet og lagre. Åpne 3D-modellen i MeshLab-programvaren. Klikk på OK i popup-vinduet etter åpen behandling.
Skaff deg X-, Y- og Z-koordinater for hvert prøvepunkt ved å velge plukkpunktverktøyet og deretter høyreklikke med intervaller med jevne mellomrom over 3D-modelloverflaten. Når alle de ønskede koordinatene er valgt, klikker du på den øverste Lagre-knappen i popup-vinduet for skjemaet. Åpne PP-filen som ble generert i forrige trinn, i regnearkprogramvaren.
Juster datavisningen ved å klikke Datatekst til kolonner, og deretter Skilletegn. Klikk neste og velg deretter Space og klikk på Fullfør. Formater på nytt slik at bare numeriske verdier blir værende i regnearkcellene ved å velge Søk etter hjemme og Velg erstatt.
Skriv inn Y lik frakk i søk etter -boksen, og la erstatningsboksen stå tom. Klikk på Erstatt alle og deretter på OK. Gjenta for X lik frakk og for Z lik frakk og for frakk skråstrek større enn. I programvaretabellen for regneark tilsvarer rader hver plassering og kolonner med data.
Lim inn de aktuelle metadataene og metabolittfunksjonen i de påfølgende regnearkkolonnene. I radiuskolonnen angir du ønsket størrelse på prøveplassene som skal visualiseres på modellen. Bestem verdiene for radiusen empirisk, og lagre filen i CSV-format.
Naviger til ELI Plot-programvaren, velg Surface, og dra og slipp deretter den opprettede 3D-modellen i nettleservinduet. Dra og slipp den opprettede funksjonstabellen i samme nettleservindu. Bruk forklaringen nederst til høyre for å projisere ønsket datakolonne på 3D-modellen.
Velg hver datakolonne fortløpende for å vurdere fordelingen av denne metabolittfunksjonen på 3D-modellen. Denne analysen førte til en tabell med 5 502 funksjoner og deres visualisering i 3D. Denne tilnærmingen muliggjør visualisering av metabolittfunksjoner hos enkelte dyr som er høye på stedet for høy parasittbelastning, metabolitter med differensialfordeling på tvers av vevsregioner og metabolittfunksjoner som finnes på sammenlignbare nivåer på tvers av små og store tarmer.
Det er viktig å huske å bruke bare LCMS-løsningsmidler og samle alt tilstøtende vev og trekke ut metabolittene for alle innsamlede prøver for å unngå hull i romlige kart. Denne teknikken kan brukes til å utforske næringsbehov for vevskolonisering av Trypanosomatid parasitter for å forstå sykdomspatogenese ved å sammenligne 3D-metabolittfordelingskart ved infeksjon.