Name: effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes
Uploaded: 2022-03-01T13:00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا الموظفين والعلماء داخل فرع علم الحشرات وشعبة الأمراض الطفيلية والملاريا في مركز السيطرة على الأمراض ، وبراين تريغ وميشيل تشيو على المساعدة في إعداد البكتيريا في JHU و / أو المناقشات المفيدة لهذا العمل. نشكر JHMRI Insectary ومديرها كريس كيزيتو على الوصول إلى البعوض الغامبي وتربية البعوض الغامبي . نشكر وي هوانغ (JHSPH) على المساعدة في الحصول على البلازميدات PJet GFP و pPB47 GFP لاستخدامها في هذه الدراسة. وقدم التمويل لهذا العمل كل من: NIH R21AI153588 (إلى DJA)، وهي زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هوبكنز لبحوث الملاريا (إلى MW)؛ وزمالة ما بعد الدكتوراه من معهد جونز هو ومن خلال منحة من مؤسسة Good Ventures ومشروع العمل الخيري المفتوح لمؤسسة CDC بعنوان دعم الحفظ بالتبريد وقمع نمو الإناث في البعوض للمساعدة في البحث عن الملاريا ، مشروع العمل الخيري المفتوح ، 2017. نحن نقدر تقديرا عميقا المساعدة المقدمة من موظفي مرفق المجهر JHU ودعم منحة المعاهد الوطنية للصحة المعمول به للمجهر المستخدم (NIH Grant #: S10OD016374). النتائج والاستنتاجات الواردة في هذه المخطوطة هي نتائج المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات نظر مركز السيطرة على الأمراض. استخدام الأسماء التجارية هو لتحديد الهوية فقط ولا يعني موافقة مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها أو خدمة الصحة العامة أو وزارة الصحة والخدمات الإنسانية الأمريكية.

1. استنساخ dsRNA إلى متجه تعبير E. coli
<ol><li>حدد تسلسل الجينات المستهدفة لإدخاله في متجه مناسب للتعبير عن dsRNA. استرداد قيم التعبير من Vectorbase.org باستخدام الطريقة التالية.<ol>
<li>ابحث عن جين ذي أهمية (على سبيل المثال، الجدول 1) في مربع البحث في الصفحة الرئيسية.</li>
		<li>في صفحة الجينات الناتجة، انتقل إلى الرقم 8. قسم النسخ .</li>
		<li>ابحث عن تجارب التعبير الجيني RNA-seq و microarray ذات الصلة.</li>
		<li>قم بنسخ القيم ذات الأهمية في برنامج جدول البيانات وإنشاء جدول بيانات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حدد بلازميد متاح تجاريا مع مروج T7 واحد على الأقل لاستخدامه. إذا كان البلازميد المختار يحتوي على مروج T7 واحد فقط (كما تفعل معظم البلازميدات التجارية) ، فقم بتضمين مروج T7 ثان في التمهيدي العكسي لاستخدامه لتضخيم dsDNA للجين محل الاهتمام. ملاحظة: يمكن اختيار تسلسل dsRNA للجينات المستهدفة باستخدام تطبيق الويب E-RNAi لتصميم كواشف RNAi30. يمكن تصميم إما dsRNA طويل (حوالي 400 نقطة أساس) أو dsRNA قصير الشعر (shRNA) بناء على تسلسلات جينية محددة. وينبغي تضخيم هذه التسلسلات وتسلسلها للتأكد من هويتها قبل استنساخها. يتم سرد مناطق الجينات المختارة والبلازميدات والمروجين المستخدمة في هذه الدراسة في الملف التكميلي 1.</li>
	<li>قم بإجراء الاستنساخ وفقا لإجراء بسيط من خطوة واحدة موصوف سابقا 9,31. لهذا الغرض ، قم بتنقية منتج PCR و ligate إلى الحمض النووي البلازميد الخطي. استخدم منتج الربط لتحويل الصدمة الحرارية لخلايا الإشريكية القولونية المختصة32. حدد الخلايا المحولة من خلال الفحص الأزرق/الأبيض. تأكد من اتجاه الإدراج باستخدام PCR T7-primer وتأكد من التسلسل باستخدام الاشعال M13. ملاحظة: يمكن استخدام الفحوصات البيضاء/الزرقاء عندما يحمل البلازميد المحدد للتحويل جين lacZ الذي يرمز β-galactosidase. يجب أن تحتوي المستعمرات البيضاء على الإدراج المطلوب داخل lacZ ويمكن تحديده لزيادة تأكيد وجود واتجاه التسلسل المستهدف33.</li>
	<li>تنقية البلازميد من التحول الأول واستخدامه لتحويل E. coli HT115 (DE3) المختص كما هو موضح سابقا34. بعد التأكد من أن البلازميد مع الإدراج موجود في E. coli HT115 (DE3) المختص ، قم بعمل مخزون الجلسرين من البكتيريا للاستخدام مرة واحدة. ملاحظة: يجب الحصول على DSRNA عنصر تحكم مناسب غير ذي صلة أو إعداده للاستخدام في كل تجربة. في هذه الحالة ، يتم استخدام تسلسل الجين غير ذي الصلة aintegumenta (النملة) من Arabidopsis thaliana .</li>
</ol>2. تحضير البكتيريا القاتلة بالحرارة التي تعبر عن dsRNA
<ol><li>تنمو مزرعة من مستعمرة بكتيرية واحدة من سلالة E. coli HT115 (DE3) التي تحتوي على dsRNA الذي يعبر عن البلازميد في 50 مل من مرق لوريا (LB) يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين ، على شاكر منصة (180 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.</li>
	<li>قم بتخفيف الثقافة البكتيرية (1:1000) إلى وسيط 2x Yeast Tryptone (2x YT) يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين.</li>
	<li>حث إنتاج dsRNA عن طريق إضافة 40 ميكرومتر (التركيز النهائي) الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).</li>
	<li>عندما تصل الخلايا إلى O.D.600 = 0.4 ، بعد حوالي 2 ساعة من الحث عند 37 درجة مئوية مع إثارة عند 180 دورة في الدقيقة ، قم بإعداد تعليق مركز للبكتيريا القاتلة بالحرارة كما هو موضح من قبل Taracena et al 9. قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي (4000 × جم ، 4 درجات مئوية ، 10 دقائق) واغسل الخلايا في حجم واحد من المخزن المؤقت لفوسفات الصوديوم (PBS).</li>
	<li>تدور مرة أخرى تحت نفس الظروف ، وتعيد التعليق في PBS إلى 1/100 من الحجم الأولي ، وتوضع عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.</li>
	<li>اصنع 400 ميكرولتر من البكتيريا القاتلة بالحرارة وخزن هذه الأليكوتات عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي (لا تخزن لأكثر من أسبوع). يحتوي هذا التعليق للبكتيريا القاتلة بالحرارة على dsRNA المحدد لتجارب RNAi. نفذ هذا الإجراء لكل من بكتيريا dsRNA الجينية المستهدفة وللتحكم في dsRNA غير ذي الصلة الذي سيتم استخدامه في كل تجربة.</li>
</ol>3. تغذية البعوض بالبكتيريا القاتلة بالحرارة التي تعبر عن dsRNA
<ol><li>تذويب أليكوت واحد من dsRNA (HT115 (DE3) تعليق البكتيريا) وتخلط مع 1.6 مل من محلول السكر 12 ٪ الذي يحتوي على 0.2 ٪ ميثيل بارابين.</li>
	<li>انقع كرة قطنية صغيرة في هذا المحلول وضع الكرة القطنية المنقوعة داخل قفص يحتوي على بعوض عمره 5 أيام. تأكد من أن البعوض يتغذى على هذا المحلول ، ويلتقط كل من السكر والبكتيريا المحتوية على dsRNA في وقت واحد.</li>
	<li>قم بتغيير كرة القطن المنقوعة في محلول سكر dsRNA كل يومين لمدة 8 أيام متتالية.</li>
	<li>احتفظ بأقفاص البعوض في ظل ظروف ثابتة ، أي 27 درجة مئوية ورطوبة نسبية 80٪ مع فترة ضوئية تبلغ 12 ساعة: 12 ساعة ضوء: دورة ضوئية مظلمة ، مفصولة بفترة فجر 30 دقيقة وفترة غسق 30 دقيقة.</li>
</ol>4. فحص مستويات التعبير الجيني المستهدفة
<ol><li>تخدير البعوض على البارد عن طريق وضع الحاوية على الجليد لمدة دقيقة أو حتى يتوقف البعوض عن الحركة. بمجرد تخدير البعوض ، ضعه على سطح بارد لعزل الإناث للتشريح.</li>
	<li>رش 70 ٪ من الإيثانول على البعوض ووضعها على سطح زجاجي مع PBS. باستخدام زوج من الملقط ، قم بتأمين رأس البعوض ثابتا واسحب الصدر ببطء شديد ، مما يسمح بإطلاق الغدد اللعابية في PBS.</li>
	<li>احتفظ بالغدد اللعابية في PBS البارد حتى يتم تشريح 10 أفراد. تجمع عشرة SGs لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة جوانيدينيوم ثيوسيانات - فينول - كلوروفورم. بيليه الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.</li>
	<li>استخدم 1 ميكرولتر أليكوت من الحمض النووي الريبي المستخرج من SG في الخطوة السابقة ، لقراءة الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر وحساب تركيز الحمض النووي الريبي لكل عينة عن طريق الضرب مع عامل التخفيف. تشير نسبة 260/280 من ~ 2.0 إلى الحمض النووي الريبي ذي النوعية الجيدة.</li>
	<li>استخدم 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المنقى لتوليف الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة نسخ عكسي تجارية.</li>
	<li>قم بإجراء تخفيف 1:10 من cDNA لإعداد تفاعل RT-PCR وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. لكل عينة، قم بإعداد تفاعل للجين المستهدف وبالتوازي، قم بإعداد تفاعل مع جين التدبير المنزلي (HK). قم بتعيين كل تفاعل جيني في ثلاثية تقنية للقضاء على تأثير التباين العشوائي من الطريقة. ملاحظة: هنا ، تم استخدام جين An. gambiae ribosomal S7 (GeneBank: L20837.1) والأكتين (VectorBase: AGAP000651) كجينات HK.</li>
	<li>استخدم جميع الاشعال بتركيز نهائي يبلغ 300 نانومتر، وفقا لمؤشرات الشركة المصنعة ل SYBR-green. تضخيم مع ظروف PCR القياسية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها 40 دورة من 15 ثانية عند 95 درجة مئوية و 60 ثانية عند 60 درجة مئوية. ملاحظة: لقياس التعبير الجيني، يتم استخدام طريقة دلتا-دلتا-سي تي (ΔΔCt). Delta Ct (ΔCt) هو الفرق بين Ct للجين المستهدف و Ct لجين التدبير المنزلي. ΔΔCt هو الفرق بين ΔCt للمجموعة التجريبية و ΔCt للمجموعة الضابطة35.</li>
</ol>5. تقييم النمط الظاهري: تغذية الدم الناجحة
<ol><li>لتقييم القدرة على تغذية الدم ، قم بتعيين مجموعات من 15 أنثى من البعوض المعالج بالهدف والتحكم في dsRNA على أقفاص صغيرة (قطرها 12 سم) وتجويعها لمدة 4 ساعات.</li>
	<li>باستخدام حمام مائي متداول مضبوط على 37 درجة مئوية ، توفر مغذيات البعوض الزجاجية (قطرها 24 مم) وغشاء بارافيلم ، دم أغنام محدد للبعوض. ملاحظة: يمكن الحصول على الدم من بائع تجاري يقوم بسحبه بشكل معقم من الحيوانات السليمة المانحة من أصل أمريكي ويقوم بنزع الشعر يدويا دون مضادات التخثر أو المواد المضافة.</li>
	<li>من خلال الملاحظة المباشرة ، قم بحساب وتسجيل عدد محاولات التحقيق للحصول بنجاح على وجبة دم من الإناث الخمس الأوائل لتصبح محتقنة بالكامل في كل مجموعة. ملاحظة: لتجنب التغيرات الأيضية الكبيرة في البعوض ، والتي يمكن أن تتداخل مع موارد الطاقة التي تؤثر على سلوك البحث عن الدم ، تم الحفاظ على الجوع إلى الحد الأدنى (4 ساعات). ونتيجة لذلك، لن تسعى كل بعوضة بشغف للحصول على وجبة الدم، وحددنا عدد الإناث المحتقنات إلى خمسة (ثلث إجمالي كل مجموعة)، للحد من تأثير المتغيرات الزمنية مثل التعرض للرائحة البشرية، وتغير درجة الحرارة بين الغرف وأسطح التغذية، وما إلى ذلك.</li>
</ol>6. تقييم النمط الظاهري: مورفولوجيا الغدة اللعابية والتنظيم السفلي للبروتينات ذات الصلة
<ol><li>عزل الأنسجة الطازجة في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كما هو موضح في الخطوة 4.2 وتثبيته في الأسيتون البارد لمدة 90 ثانية. شطف عدة مرات في 1x PBS بعد إزالة الأسيتون. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع المصل المضاد (انظر جدول المواد) المخفف إلى 1x PBS. ملاحظة: انظر جدول المواد لتحديد الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في بروتينات اللعاب (بروتين الأنوفيليس المضاد للصفائح الدموية، AAPP; Mucin 2 ، MUC2) ، عوامل النسخ SG (رأس الشوكة ، fkh ؛ حكيم ، حكيم. بروتين ربط عنصر الاستجابة Cyclic-AMP A ، CrebA) ، وعلامة على الحويصلات الإفرازية (Rab11). تستخدم هذه الأجسام المضادة كقراءات لشكل SG ووظيفته. ومع ذلك ، يجب أن يكون أي جسم مضاد مناسب للتألق المناعي مناسبا لهذا البروتوكول.</li>
	<li>يغسل في 1x PBS عدة مرات. أضف الأجسام المضادة الثانوية (الفلورسنت) المخففة في 1x PBS ، واحتضنها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. أضف أي بقعة مضادة [مثل 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; الحمض النووي)، وجرثومة القمح (WGA؛ للكيتين)، والفيلويدين (ل F-actin)، و / أو أحمر النيل (للدهون)] قبل 30 دقيقة من نهاية الحضانة لمدة 2 ساعة.</li>
	<li>يغسل ثلاث مرات في 1x PBS. بعد ذلك ، قم بتركيب الأنسجة في الجلسرين بنسبة 100٪ على شريحة مجهر قياسية مع غطاء بسماكة 1 مم وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى التصوير باستخدام المجهر البؤري الفلوري. ملاحظة: للحصول على بيانات كمية، يجب أن تظل إعدادات التصوير ثابتة. هنا ، تم تضمين صور الإسقاط القصوى للكثافة فقط من خلال حجم 3D بأكمله من الأنسجة ، وتم تطبيع جميع الصور الكمية بين العلاجات (داخل تجربة) بناء على إشارة DAPI في بقايا الأنسجة غير SG (الجسم الدهني أو البشرة أو الرأس) الموجودة أيضا على الشريحة.</li>
</ol>

ويفيد المؤلفون بأنه ليس لديهم تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

إن القدرة على توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال بشكل فعال إلى البعوض الغامبي عن طريق التغذية الفموية لها آثار واسعة النطاق على دراسات بيولوجيا النواقل في المختبر وفي الميدان على حد سواء. منذ فترة طويلة تم قبول الحقن المجهري باعتباره الطريقة المفضلة لتوصيل المواد الكيميائية والأجسام المضادة والحمض النووي الريبي واستراتيجيات التعديل الوراثي في البعوض43,44. يمكن تجنب نتيجة التلاعب المادي الكبير ، والأضرار الخلوية ، والإجهاد عن طريق استخدام التسليم عن طريق الفم ، والتي يمكن أن تكون مناسبة أيضا للتطبيقات واسعة النطاق أو الميدانية. وقد اقترح العمل السابق أن الحمض النووي الريبي يعمل في كل مكان داخل البعوض البالغ الفرد29 ، مما يسمح بتأثيرات في جميع الأنسجة ، بما في ذلك الغدد اللعابية. من خلال إطعام البعوض بأعداد كبيرة من الإشريكية القولونية المعبرة عن dsRNA والتي يتم هضمها بشكل غير متزامن على مدى إطار زمني طويل ، يمكن للمرء أن يحقق تعرضا ثابتا وموحدا للحمض النووي الريبي عبر جميع الأفراد في قفص. تسمح هذه الطريقة بإطعام أعداد كبيرة من البعوض وتحليل التباين المحتمل للأنماط الظاهرية الناتجة اعتمادا على الجين المستهدف. ومع ذلك ، فإن أحد الاعتبارات المهمة هو إمكانية التوزيع غير المتجانس للبكتيريا ، وبالتالي dsRNA ، في ألياف القطن. تحتوي 400 ميكرولتر من البكتيريا المستخدمة يوميا لتغذية البعوض بالسكر على ما يقرب من 4.6 ≤ميكروغرام من dsRNA ، كما هو موضح ومحسوب سابقا9 ولكن كمية dsRNA التي يتناولها كل بعوض لم يتم تحديدها بشكل فردي. إذا أصبح بناء هياكل dsRNA أمرا روتينيا ، فإن بروتوكول العلاج البسيط هذا يسمح بالاستيعاب السريع لهذه التقنية من قبل أي باحث في البعوض. بداهة ، فإن الوقت الذي ينفقه العلاج (30 دقيقة في اليوم) تافه مقارنة بالوقت المستغرق للتعلم وتطبيق الحقن المجهري على أحجام عينات مماثلة.
يستخدم تغذية dsRNA بشكل روتيني لدراسات علم الوراثة العكسية في الكائن الحي النموذجي Caenorhabditis elegans45. ويؤكد هذا المستوى الثقيل من الاستخدام على قيمة نهج التسليم عن طريق الفم. إن بناء مكتبة على مستوى الجينوم على مستوى An. gambiae في الإشريكية القولونية المحولة ، على غرار تلك الموجودة في C. elegans46,47 ، سيسمح بإجراء فحص وراثي عكسي سريع في البعوض على نطاق متزايد. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن كفاءة الطريقة تعتمد إلى حد كبير على المستويات الداخلية للنسخ وإذا كان التعبير لا يقتصر على الأنسجة المستهدفة ولكن يتم التعبير عنه على نطاق أوسع 4,8,44. بالإضافة إلى ذلك ، هناك أدلة على أن بعض المبيدات الحشرية يمكن أن تحفز تجنب السلوك من البعوض48 ، والتغذية بالبكتيريا التي يحتمل أن تحفز الآثار الضارة فيها يمكن أن تؤدي إلى أنماط مماثلة من التجنب. في بيئة المختبر الخاضعة للرقابة ، حيث لم يكن لدى البعوض مصدر غذائي بديل ، لم يكن لديهم خيار لتجنب ماء السكر مع الإشريكية القولونية ، وربما تتجاوز الحاجة إلى مصدر مغذي غريزة تجنب البكتيريا. ومع ذلك ، ينبغي النظر في ذلك إذا كان من المفترض استخدام الاستراتيجية في إعدادات أقل تحكما فيها.
قد يكون من الممكن استهداف جينات متعددة في وقت واحد (باستخدام بنية واحدة أو تركيبات متعددة أو خليط من العزلات البكتيرية المتحولة) ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لتقييم الفعالية. وثمة اعتبار هام آخر لهذه النقطة هو تقييم الآثار المحتملة خارج الهدف أو الآثار التآزرية عند استخدام أهداف واحدة أو متعددة. يعد إنشاء جينات ومجموعات تحكم مناسبة جزءا مهما من التصميم التجريبي. علاوة على ذلك ، من المغري التكهن بأن هذا النهج يمكن استخدامه لاستهداف مسببات الأمراض أو الفيروسات الأخرى49. تم تنفيذ العمل السابق نحو تحريض الحمض النووي الريبي في البعوض في ظل ظروف تم فيها حقن الكاشف مباشرة ، لذلك لم تكن E. coli موجودة. قد توفر الإشريكية القولونية حجرة واقية تسمح بإطلاق أبطأ ل dsRNA بمرور الوقت ، مما يضمن أن التعرض مستمر إلى حد ما على مدى فترة أطول بكثير29.
وأخيرا، تظهر هذه النتائج أن آثار هذه التقنية قابلة للضبط عن طريق ضبط الإطار الزمني (الطول ويوم البدء) للتعرض وكمية الإشريكية القولونية المستخدمة. سمحت لنا هذه الميزة بدراسة وظائف الجينات الأساسية (dsx و fkh) من خلال تحديد ظروف الضربة القاضية المثلى عن طريق التجربة والخطأ. هذا يعزز إلى حد كبير من احتمال أن الجينات المستهدفة ذات الأهمية يمكن التحقيق فيها باستخدام هذه التقنية.
باختصار ، وجد أن توصيل الحمض النووي الريبي عن طريق الفم إلى البعوض البالغ يمكن أن يكون بسيطا ومتعدد الاستخدامات ونهجا قويا لدراسة وظيفة جين البعوض ولإنشاء أدوات جديدة ومرنة لمكافحة ناقلات الأمراض التي ينقلها البعوض.

تنتقل العديد من الأمراض عن طريق البعوض ، مما يجعل دراسة فسيولوجيا البعوض وعلم الوراثة مهمة مهمة. كان استخدام الحمض النووي الريبي في هذه الكائنات الحية بارزا في السنوات العشرين الماضية وسمح بالتوصيف الوظيفي للعديد من جينات البعوض1،2،3،4،5. كانت التقنية الأكثر استخداما لتوصيل dsRNA هي الحقن المجهري ، والذي له عيوب أنه يمكن أن يصيب البعوض ويتطلب وقتا وجهدا كبيرين. تم اختبار طرق التسليم عن طريق الفم ل RNAi ، ولكن بشكل رئيسي في مرحلة يرقات البعوض6،7،8،9. ولم يتم استكشاف التوصيل الفموي للحمض النووي الريبوزي المرسال عن طريق الفم في البعوض البالغ بشكل كامل ويمكن أن يكون أداة مفيدة لدراسة بيولوجيا النواقل ومكافحة النواقل.
تنتقل الملاريا عن طريق بعوض الأنوفيليس عندما تأخذ أنثى البعوضة المصابة وجبة دم من مضيف غير مصاب وتحقن اللعاب الذي يحتوي على طفيليات الملاريا10. لكي ينتقل الطفيلي في نهاية المطاف في لعاب البعوض ، يجب أن يتغلب على العديد من العقبات ، بما في ذلك التهرب من الجهاز المناعي للبعوض ، واجتياز حاجز الأمعاء الوسطى ، وغزو الغدد اللعابية11. تعد بنية الغدة اللعابية للبعوض (SG) مفتاحا لغزو الطفيليات ويتم التحكم في هذه البنية من خلال عوامل النسخ الرئيسية المعبر عنها في الغدة اللعابية وكذلك محددات إزدواج الشكل الجنسي. هناك حاجة إلى العديد من عوامل النسخ المحفوظة للغاية للمواصفات الخلوية والصيانة الاستتبابية للغدد اللعابية ولإنتاج وإفراز البروتينات اللعابية التي تعمل في تغذية الدم12،13،14. رأس الشوكة (Fkh) هو عامل نسخ حلزوني مجنح يعمل كمنظم رئيسي لبنية الحشرات SG ووظيفتها (استنادا إلى الدراسات التي أجريت على ذباب الفاكهة وعثة دودة القز)15،16،17،18،19،20. في SGs ذبابة الفاكهة ، يعمل Fkh مع Sage ، وهو عامل نسخ حلزوني حلزوني أساسي خاص ب SG (bHLH) ، لتعزيز بقاء SG وإنتاج اللعاب19. أحد المنظمين المشاركين المهمين والإيجابيين لإنتاج اللعاب في ذبابة الفاكهة هو CrebA ، وهو عامل نسخ سحاب الليوسين المدروس جيدا والذي ينظم التعبير عن جينات المسار الإفرازي21،22،23. هناك أيضا درجة قوية من التمايز المورفولوجي في الغدد اللعابية الأنثوية التي من المحتمل أن تلعب دورا رئيسيا ، ليس فقط في تغذية الدم ولكن أيضا في قدرة الطفيليات على غزو هذا النسيج24.
العديد من الجينات المشاركة في تحديد بقاء الغدة اللعابية ، والبنية ، وعلم وظائف الأعضاء ، وإزدواج الشكل الجنسي لها ملامح التعبير الزماني المكاني المعقدة25،26،27 ، وطرق التسليم التقليدية ل dsRNA لحث الحمض النووي الريبي ليست دائما فعالة في استهداف هذه الأنواع من الجينات في هذا النسيج أو غيره. ومع ذلك ، فقد تم استخدام التسليم الفموي ل dsRNA في مرحلة اليرقات الزاعجة المصرية والبعوض الغامبي بنجاح لإسكات الشكل الخاص بالإناث من جين dsx 9,28. وجدت الدراسات السابقة التي استخدمت dsRNA في الغدد اللعابية للبعوض أنه على الرغم من الحاجة إلى كميات كبيرة من dsRNA ، إلا أن تأثير إسكات الصوت كان طويل الأمد نسبيا (13 يوما على الأقل)29. هنا ، تم اختبار قدرة سلالة E. coli القاتلة بالحرارة HT115 (DE3) التي تعبر عن dsRNA الخاص بالتسلسل ل dsx أو fkh أو CrebA للحث على إسكات الحمض النووي الريبي لهذه الجينات في إناث البعوض البالغة. الإعطاء الفموي لل dsRNA الناجم عن ضربة قاضية للجين في An. gambiae ، مع تخفيضات واضحة في مستويات mRNA ومع الأنماط الظاهرية المتسقة مع فقدان وظيفة هذه الجينات. وبالتالي ، من المرجح أن يعمل هذا النهج على هدم وظيفة مجموعة متنوعة من جينات الغدة اللعابية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0440-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAPP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuStart II PCR Supermix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95137-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anopheles gambiae G3</td>
			<td>BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</td>
			<td>MRA-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>P022628181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrebA</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>CrebA Rbt-PC</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damiens diet</td>
			<td>BioServ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DSB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115 (DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JM109 Competent cells</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10855001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 2</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Muc2; 27 675-1-AP</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (mouse).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Lipid dye; 1:50 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEMT easy</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR-green PCR master MIX</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaStudio 6</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio6 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab11</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-WGA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sage</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>87128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC 
			CGGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes

كان تداخل الحمض النووي الريبي أداة تستخدم بكثافة للتحليل الجيني العكسي لمدة عقدين. في البعوض البالغ ، تم تنفيذ الحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA) في المقام الأول عن طريق الحقن ، والذي يتطلب وقتا طويلا وغير مناسب للتطبيقات الميدانية. للتغلب على هذه القيود ، نقدم هنا طريقة أكثر كفاءة للتنشيط القوي للحمض النووي الريبي عن طريق التسليم الفموي ل dsRNA إلى Anopheles gambiae للبالغين. تم إنتاج dsRNAs طويلة في سلالة الإشريكية القولونية HT115 (DE3) ، وتم تقديم تعليق مركز للبكتيريا المحتوية على dsRNA المقتولة بالحرارة في 10٪ من السكروز على كرات القطن ad-libitum للبعوض البالغ. تم استبدال كرات القطن كل 2 أيام طوال مدة العلاج. أدى استخدام هذه الطريقة لاستهداف مزدوج الجنس (جين مشارك في التمايز بين الجنسين) أو رأس الشوكة (الذي يشفر عامل نسخ الغدة اللعابية) إلى انخفاض التعبير الجيني المستهدف و / أو إشارة التألق المناعي للبروتين ، كما تم قياسها بواسطة PCR الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) أو المجهر البؤري الفلوري ، على التوالي. كما لوحظت عيوب في مورفولوجيا الغدة اللعابية. يمكن أن تكون هذه الطريقة المرنة للغاية وسهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة والفعالة من حيث الوقت لتوصيل dsRNA قابلة للتطبيق على نطاق واسع على الجينات المستهدفة المهمة لفسيولوجيا ناقلات الحشرات وما بعدها.

Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

تم تطبيق الإعطاء الفموي ل dsRNA الذي تنتجه البكتيريا ، وهي طريقة توصيل لتداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) التي تستخدم بشكل روتيني في Caenorhabditis elegans ، بنجاح هنا على البعوض البالغ. تسمح طريقتنا بإجراء دراسات قوية لعلم الوراثة العكسي ودراسات ناقلات منع انتقال العدوى دون استخدام الحقن.

الإدارة الفعالة لتداخل الحمض النووي الريبي عن طريق الفم (RNAi) للبعوض الأنوفيلة الغامبية البالغة

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

يعد تداخل الحمض النووي الريبي أحد الأدوات الرئيسية المستخدمة في عكس علم الوراثة في البعوض ويسمح لنا التسليم الفموي بالحث والحفاظ على إسكات الجينات في البعوض البالغ دون الحاجة إلى الحقن الدقيق. إن التسليم الفموي للحمض النووي الريبي المزدوج إلى البعوض البالغ هو طريقة تداخل الحمض النووي الريبي منخفضة التكلفة ومتعددة الاستخدامات مما يقلل بشكل كبير من العمل والوقت والجهد لدراسة وظيفة الجينات. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة ليس فقط الجينات المستهدفة الأخرى في Anopheles gambiae ، ولكن أيضا في أنوفيلات أخرى ذات أهمية مثل Anopheles albinamus.للبدء ، قم بزراعة ثقافة من مستعمرة بكتيرية واحدة من سلالة الإشريكية القولونية HT115 (DE3) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل والذي يعبر عن البلازميد في خمسة ملليلتر من الرطل الذي يحتوي على الأمبيسلين والتتراسيكلين على شاكر المنصة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة. بعد 12 ساعة ، خذ 0.5 ملليلتر من الثقافة البكتيرية المزروعة بين عشية وضحاها وقم بإجراء واحد من كل 1000 تخفيف في وسائط تريبتون الخميرة 2X التي تحتوي على الأمبيسلين والتتراسيكلين. للحث على إنتاج الحمض النووي الريبي المزدوج ، أضف IPDG عند التركيز النهائي ل 40 ميكرومولار.ثم احتضان الثقافة لمدة ساعتين في ظروف تهتز كما هو موضح. في نهاية الحضانة عندما تصل الكثافة البصرية للثقافة إلى 0.4 عند 600 نانومتر ، قم بتكسير الخلايا البكتيرية عن طريق التركيز عند 4،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ثم غسل الخلايا في حجم واحد من PBS. بعد تدوير الخلايا مرة أخرى ، أعد تعليق الخلايا في PBS واحتضنها عند 70 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.بعد قتل الحرارة للبكتيريا ، اصنع أليكوتس بحجم 400 ميكرولتر وخزنها عند 20 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. امزج 400 ميكرولتر من البكتيريا المقتولة بالحرارة الذائبة التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج مع 1.6 ملليلتر من محلول السكر 12٪ الذي يحتوي على 0.2٪ ميثيل بارابين. انقع كرة قطنية صغيرة في هذا المحلول وضعها داخل قفص يحتوي على بعوض عمره خمسة أيام وتأكد من أن البعوض يتغذى على هذا المحلول.قم بتغيير الكرة القطنية المنقوعة في محلول سكر الحمض النووي الريبي المزدوج كل يومين لمدة ثمانية أيام متتالية ، مما يضمن الحفاظ على القفص في ظل ظروف ثابتة. لتخدير البعوض بالبرد ، ضع الحاوية على الجليد حتى يتوقف البعوض عن الحركة ، ثم ضع البعوض على سطح بارد لعزل الإناث للتشريح. بعد رش البعوض بالإيثانول ، ضعه على سطح زجاجي باستخدام PBS.باستخدام زوج من الملقط ، قم بتأمين رأس البعوض واسحب الصدر ببطء شديد مما يسمح بإطلاق الغدد اللعابية في PBS. بمجرد تشريح الغدد اللعابية من 10 بعوض ، اسحب الغدد لاستخراج الحمض النووي الريبي. عند الانتهاء من استخراج الحمض النووي الريبي ، قم بتعليق بيليه الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي.قياس الامتصاص وحساب تركيز الحمض النووي الريبي كما هو موضح في مخطوطة النص. باستخدام مجموعة نسخ عكسي تجارية ، قم بتوليف cDNA من ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي. قم بتخفيف cDNA 10 مرات وقم بإعداد تفاعلات RTPCR في ثلاثة أضعاف للجينات المستهدفة والتدبير المنزلي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.قم بتضخيم CDNA مع ظروف PCR القياسية في الوقت الفعلي. لتقييم القدرة على تغذية الدم ، ضع مجموعات من 15 أنثى البعوض تعامل مع الحمض النووي الريبي المزدوج المستهدف والمتحكم فيه في أقفاص صغيرة وتجويعها لمدة أربع ساعات. توفير دم رخيص مزيل الرجفان للبعوض باستخدام حمام مائي متداول مضبوط على 37 درجة مئوية ، ومغذيات زجاجية للبعوض وغشاء peryfill .مراقبة وإحصاء وتسجيل عدد محاولات التحقيق للحصول بنجاح على وجبة دم من الإناث الخمس الأولى لتصبح محتقنة بالكامل في كل مجموعة. بعد عزل الأنسجة الطازجة وقد أظهرت PBS سابقا ، قم بإصلاحها في الأسيتون البارد المثلج لمدة 90 ثانية. ثم شطف الأنسجة عدة مرات في PBS وحضانت مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية مع مصل مضاد مخفف في PBS.في نهاية الحضانة ، اغسل الأنسجة عدة مرات باستخدام PBS. أضف الأجسام المضادة الثانوية الفلورية المخففة في PBS ، واحتضنها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. أضف أي بقعة مضادة قبل 30 دقيقة من نهاية الحضانة لمدة ساعتين.بعد ساعتين ، اغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم قم بتركيب الأنسجة في الجلسرين بنسبة 100٪ على شريحة مجهر قياسية مع انزلاق غطاء بسمك ملليمتر واحد وتخزينها عند 20 درجة مئوية حتى التصوير. أظهرت بيانات التعبير عن الآراي الجزئي التعبير عن جميع الجينات المستهدفة المختارة في الغدد اللعابية البالغة وكانت مستويات AAPP والمريمية مرتفعة بشكل خاص. الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل قلل بشكل فعال من وفرة نسخ رأس الشوكة في الغدة اللعابية.أظهر البعوض الذي يتغذى على الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل برأس الشوكة خمس مرات محاولات تغذية أكثر من المجموعة الضابطة أو FEG مزدوج الجنس المزدوج الذي تقطعت به السبل بالحمض النووي الريبي الذي يتغذى على البعوض ليتم احتقانه بالكامل بالدم. تم تخفيض مستويات تلطيخ المريمية و CrebA بشكل ملحوظ في جميع فصوص الغدة اللعابية بعد تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة مقارنة بتداخل الحمض النووي الريبي للتحكم في النمل. عند النظر في بروتينات مكونات اللعاب الوفيرة للغاية ، تم تقليل مستويات AAPP في جميع فصوص الغدد اللعابية الثلاثة بعد تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة مقارنة بمعالجة تداخل الحمض النووي الريبي للتحكم في الحمض النووي الريبي.من ناحية أخرى ، لم يلاحظ أي تغييرات في مستويات الميوسين. تشير هذه البيانات إلى أن رأس الشوكة يساهم بشكل مختلف في التعبير عن جينات بروتين اللعاب المختلفة. لوحظ انخفاض تألق Rab11 في الفصوص الجانبية البعيدة بعد علاج تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة ، ومع ذلك ، حدثت أيضا زيادة في إشارة Rab11 في الفصوص الجانبية الإنسية والقريبة.لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في إشارة النيل الحمراء بعد تداخل الحمض النووي الريبي لرأس الشوكة مقارنة بمعالجة تداخل الحمض النووي الريبي الضابط. بعض ردود فعل آلة السكرتارية بطريقة معقدة تختلف بين فصوص الغدة اللعابية. يمكن أن تسمح هذه التقنية للباحثين بإسكات الجينات التي يمكن تقليل التعبير عنها عن طريق حقنة واحدة من الحمض النووي الريبي المزدوج الخيط واستكشاف التسليم الفموي للحمض النووي الريبي المزدوج الخيط لاستخدام الحمض النووي الريبي كوسيلة محتملة لمكافحة النواقل.

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

بناء عالم أفضل البعوض : تحديد الجينات تمكين الملاريا وحمى الضنك حمى المقاومة في الغامبية ألف وألف البعوض بعوض

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

البكتيرية تسليم المستجيبات رني : Transkingdom رني

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

رني التدخل عن طريق الحقن في الرنا المزدوج الجديلة ذبابة الفاكهة الأجنة

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

رني ضربة قاضية بوساطة الجينات و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; فحص إدرار البول في الإناث البالغات<em&gt; الزاعجة المصرية</em&gt; البعوض

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

التدخل RNA اليرقات في الأحمر خنفساء الدقيق،<em&gt; كونفيوسم كاستانيم</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

رني الزناد تسليم إلى<em&gt; بعوض الملاريا</em&gt; شرانق

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

الاستخدام العملي لتدخل الجيش الملكي النيبالي: التسليم الشفوي من الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل في ناقلات الحويصلية للصراصير

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-تكس: أداه تكامل البيانات المفتوحة المصدر لنسخ البيانات الكبيرة المصممة لمكافحه ناقلات الملاريا

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

جرثومية عن طريق الفم الرضاعة مع البعوض المعالجة بالمضادات الحيوية

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...