Name: effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes
Uploaded: 2022-03-01T13:00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Forfatterne ønsker at takke personalet og forskerne inden for Entomology Branch og Division of Parasitic Diseases and Malaria ved CDC og Brian Trigg og Michelle Chiu for hjælp til bakterieforberedelse på JHU og / eller nyttige diskussioner af dette arbejde. Vi takker JHMRI Insectary og manager Chris Kizito for adgang til og opdræt af An. gambiae myg. Vi takker Wei Huang (JHSPH) for hjælp til at opnå plasmider PJet GFP og pPB47 GFP til brug i denne undersøgelse. Finansiering til dette arbejde blev ydet af: NIH R21AI153588 (til DJA), et Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoc Fellowship (til MW); og ved et tilskud fra Good Ventures Foundation og Open Philanthropy Project til CDC Foundation med titlen Support cryopreservation and suppression of female development in mosquitoes to assist research for malaria, Open Philanthropy Project, 2017. Vi sætter stor pris på hjælp fra JHU Microscope Facility personale og gældende NIH tilskud støtte til det anvendte mikroskop (NIH Grant #: S10OD016374). Resultaterne og konklusionerne i dette manuskript er forfatternes og repræsenterer ikke nødvendigvis CDC's synspunkter. Brug af handelsnavne er kun til identifikation og indebærer ikke godkendelse fra Centers for Disease Control and Prevention, Public Health Service eller US Department of Health and Human Services.

1. Kloning af dsRNA i E. coli-ekspressionsvektor
<ol><li>Vælg den målgensekvens, der skal indsættes i en passende vektor til ekspression af dsRNA. Hent udtryksværdierne fra Vectorbase.org ved hjælp af følgende metode.<ol>
<li>Søg efter et gen af interesse (f.eks . tabel 1) i søgefeltet på hjemmesiden.</li>
		<li>På den resulterende genside skal du navigere til 8. Transcriptomics sektion.</li>
		<li>Se efter de anførte relevante RNA-seq og microarray genekspressionseksperimenter.</li>
		<li>Transskribere værdier af interesse i regnearkssoftwaren og opret en datatabel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vælg et kommercielt tilgængeligt plasmid med mindst én T7-promotor, der skal bruges. Hvis det valgte plasmid kun har en T7-promotor (som de fleste kommercielle plasmider gør), skal du inkludere en anden T7-promotor i den omvendte primer, der skal anvendes til amplifikation af dsDNA for genet af interesse. BEMÆRK: DSRNA-sekvensen for målgenerne kan vælges ved hjælp af webapplikationen E-RNAi til design af RNAi-reagenser30. Enten langt dsRNA (ca. 400 bp) eller korthåret dsRNA (shRNA) kan designes ud fra specifikke gensekvenser. Disse sekvenser bør forstærkes og sekventeres til identitetsbekræftelse inden kloning. De udvalgte genregioner, plasmider og promotorer, der anvendes i denne undersøgelse, er angivet i supplerende fil 1.</li>
	<li>Udfør kloning i henhold til en simpel et-trins procedure beskrevet tidligere 9,31. Til dette formål renses PCR-produktet og ligaten til det lineariserede plasmid-DNA. Brug ligeringsproduktet til varmechoktransformation af kompetente E. coli-celler 32. Vælg de transformerede celler gennem blå/hvid screening. Bekræft indsatsens retning ved hjælp af en T7-primer PCR, og bekræft sekvensen ved hjælp af M13-primere. BEMÆRK: Hvide / blå screeninger kan bruges, når plasmidet, der er valgt til transformation, bærer lacZ-genet, der koder for β-galactosidase. Hvide kolonier skal indeholde den ønskede indsats i lacZ og kan vælges for yderligere at bekræfte tilstedeværelsen og orienteringen af målsekvensen33.</li>
	<li>Rens plasmidet fra den første transformation og brug det til at transformere kompetent E. coli HT115 (DE3) som tidligere beskrevet34. Efter bekræftelse af, at plasmidet med indsatsen er til stede i den kompetente E. coli HT115 (DE3), skal der fremstilles glycerollagre af bakterier til engangsbrug. BEMÆRK: Et passende ikke-relateret kontrol-dsRNA bør erhverves eller forberedes til brug i hvert forsøg. I dette tilfælde anvendes sekvensen for det ikke-relaterede gen aintegumenta (myr) fra Arabidopsis thaliana .</li>
</ol>2. Fremstilling af varmedræbte bakterier, der udtrykker dsRNA
<ol><li>En kultur dyrkes fra en enkelt bakteriekoloni af E. coli-stamme HT115 (DE3), der indeholder dsRNA-ekspressionen plasmid i 50 ml Luria Broth (LB) indeholdende 100 μg/ml ampicillin og 12,5 μg/ml tetracyclin, på en platformsryster (180 o/min.) ved 37 °C i 12 timer.</li>
	<li>Bakteriekulturen (1:1000) fortyndes til 2x gærprøveptonmedier (2x YT) indeholdende 100 μg/ml ampicillin og 12,5 μg/ml tetracyklin.</li>
	<li>Inducer dsRNA-produktion ved tilsætning af 40 μM (endelig koncentration) isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG).</li>
	<li>Når cellerne når en O.D.600 = 0,4 , ca. efter 2 timers induktion ved 37 °C med omrøring ved 180 o / min, fremstilles en koncentreret suspension af varmeredræbte bakterier som beskrevet af Taracena et al 9. Pellet cellerne ved centrifugering (4000 x g, 4 ° C, 10 min) og vask celler i et volumen natriumphosphatbuffer (PBS).</li>
	<li>Spin igen under de samme betingelser, ophæng igen i PBS til 1/100 af det oprindelige volumen og anbring ved 70 °C i 1 time.</li>
	<li>Lav 400 μL alikvoter af de varmedræbte bakterier og opbevar disse alikvoter ved -20 °C indtil videre brug (opbevar ikke i mere end en uge). Denne suspension af varedræbte bakterier indeholder det specifikke dsRNA til RNAi-eksperimenterne. Udfør denne procedure både for målgenet dsRNA-bakterier og for den ikke-relaterede dsRNA-kontrol, der skal anvendes i hvert forsøg.</li>
</ol>3. Fodring af myg med varmedræbte bakterier, der udtrykker dsRNA
<ol><li>Optø en alikvote dsRNA (HT115 (DE3) bakteriesuspension) og bland med 1,6 ml 12% sukkeropløsning indeholdende 0,2% methylparaben.</li>
	<li>Sug en lille vatpind i blød i denne opløsning og læg den gennemblødte bomuldskugle inde i et bur, der indeholder 5 dage gamle myg. Sørg for, at myggene lever af denne opløsning og opfanger både sukker og dsRNA-holdige bakterier samtidigt.</li>
	<li>Skift bomuldskuglen gennemblødt i dsRNA-sukkeropløsning hver anden dag i 8 på hinanden følgende dage.</li>
	<li>Hold myggebure under konstante forhold, dvs. 27 ° C og 80% relativ luftfugtighed med en fotoperiode på 12 timer: 12 timer lys: mørk fotocyklus, adskilt af en 30 minutters daggry og 30 min skumringsperiode.</li>
</ol>4. Assay målrette genekspressionsniveauer
<ol><li>Koldavende myggene ved at placere beholderen på is i et minut, eller indtil myggene holder op med at bevæge sig. Når myggene er anæstesi, skal du placere dem på en kold overflade for at isolere kvinder til dissektion.</li>
	<li>Sprøjt 70% ethanol til myggene og læg dem på en glasoverflade med PBS. Med et par tang skal du fastgøre myggehovedet stabilt og trække thoraxen meget langsomt, så spytkirtlerne kan frigives i PBS.</li>
	<li>Opbevar spytkirtlerne i iskold PBS, indtil 10 personer er blevet dissekeret. Pool Ten SGs til RNA-ekstraktion ved anvendelse af guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform-metoden. Suspender RNA-pelleten i 30 μL RNase-frit vand.</li>
	<li>Brug 1 μL alikvote af RNA'et ekstraheret fra SG i det foregående trin til at læse absorbans ved 260 og 280 nm og beregne RNA-koncentrationen af hver prøve ved at multiplicere med fortyndingsfaktoren. Et 260/280-forhold på ~ 2,0 indikerer RNA af god kvalitet.</li>
	<li>Brug 1 μg af det rensede RNA til at syntetisere komplementært DNA (cDNA) ved hjælp af et kommercielt omvendt transkriptionssæt.</li>
	<li>Lav en 1:10 fortynding af cDNA'et for at forberede en RT-PCR-reaktion i henhold til producentens anbefalinger. For hver prøve skal du forberede en reaktion for målgenet og parallelt oprette en reaktion med husholdningsgenet (HK). Indstil hver genreaktion i et teknisk triplikat for at eliminere virkningen af tilfældig variation fra metoden. BEMÆRK: Her er An. gambiae ribosomal S7-genet (GeneBank: L20837.1) og actin (VectorBase: AGAP000651) blevet brugt som HK-gener.</li>
	<li>Brug alle primere i en endelig koncentration på 300 nM efter SYBR-grøn producentens indikationer. Forstærkes med standard PCR-betingelser: 95 °C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser på 15 s ved 95 °C og 60 s ved 60 °C. BEMÆRK: For at kvantificere genekspression anvendes delta-delta-Ct-metoden (ΔΔCt). Delta Ct (ΔCt) er forskellen mellem Ct af målgenet og Ct af husholdningsgenet. ΔΔCt er forskellen mellem ΔCt for den eksperimentelle gruppe og ΔCt for kontrolgruppe35.</li>
</ol>5. Fænotypisk evaluering: vellykket blodfodring
<ol><li>For at evaluere evnen til blodfoder skal du indstille grupper på 15 kvindelige myg behandlet med mål og kontrollere dsRNA på små bure (12 cm diameter) og sulte dem i 4 timer.</li>
	<li>Ved hjælp af et cirkulerende vandbad, der er indstillet til 37 °C, tilbyder glasmyggefodere (24 mm diameter) og parafilmmembran defibrineret fåreblod til myggene. BEMÆRK: Blod kan erhverves fra en kommerciel leverandør, der aseptisk trækker det fra sunde donordyr af amerikansk oprindelse og manuelt defibrinerer uden antikoagulantia eller tilsætningsstoffer.</li>
	<li>Ved direkte observation tælles og registreres antallet af sonderende forsøg på med succes at erhverve et blodmåltid fra de første fem kvinder for at blive fuldt opslugt i hver gruppe. BEMÆRK: For at undgå betydelige metaboliske ændringer i myggene, der kunne forstyrre energiressourcer, der påvirker blodsøgende adfærd, blev sult holdt på minimum (4 timer). Som følge heraf ville ikke alle myg ivrigt søge blodmåltidet, og vi begrænsede antallet af de opsvulmede hunner til fem (en tredjedel af hver gruppes samlede antal) for at reducere effekten af tidsvariabler såsom udsættelse for menneskelig lugt, temperaturændring mellem kamrene og fodringsfladerne osv.</li>
</ol>6. Fænotypisk evaluering: Spytkirtelmorfologi og nedregulering af relevante proteiner
<ol><li>Frisk væv isoleres i 1x fosfatbufret saltvand (PBS) som beskrevet i trin 4.2 og fastgøres i iskold acetone i 90 s. Skyl flere gange i 1x PBS efter fjernelse af acetonen. Inkuber med primære antistoffer natten over ved 4 °C med antiserum (se materialetabel) fortyndet til 1x PBS. BEMÆRK: Se tabel over materialer til identifikation af de primære antistoffer, der anvendes til spytproteiner (Anopheles anti-blodpladeprotein, AAPP; Mucin 2, MUC2), SG transkriptionsfaktorer (Gaffelhoved, fkh; Salvie, salvie; Cyklisk-AMP respons elementbindende protein A, CrebA) og en markør for sekretoriske vesikler (Rab11). Disse antistoffer anvendes som udlæsninger til SG-form og -funktion. Ethvert antistof, der er egnet til immunofluorescens, bør dog være egnet til denne protokol.</li>
	<li>Vask i 1x PBS flere gange. Tilsæt sekundære antistoffer (fluorescerende) fortyndet i 1x PBS, og inkuber i mørke ved stuetemperatur i 2 timer. Tilsæt eventuel modplet [såsom 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; DNA), hvedekim agglutinin (WGA; for chitin), phalloidin (for F-actin) og/eller Nilrød (for lipider)] 30 minutter før afslutningen af 2 timers inkubationen.</li>
	<li>Vask tre gange i 1x PBS. Monter derefter vævene i 100% glycerol på et standard mikroskop dias med en 1 mm tyk dækslip og opbevar ved -20 ° C indtil billeddannelse ved hjælp af et fluorescenskonfokalmikroskop. BEMÆRK: For at opnå kvantitative data skal billedbehandlingsindstillingerne holdes konstante. Her blev kun maksimal intensitetsprojektionsbilleder gennem hele vævets 3D-volumen inkluderet, og al billedkvantificering blev normaliseret mellem behandlinger (inden for et eksperiment) baseret på DAPI-signal i ikke-SG-vævsrester (fedtlegeme, neglebånd eller hoved), der også var til stede på diaset.</li>
</ol>

Forfatterne rapporterer, at de ikke har nogen interessekonflikter at afsløre.

Evnen til effektivt at levere dsRNA til An. gambiae myg ved oral fodring har brede konsekvenser for studier af vektorbiologi både i laboratoriet og i marken. Mikroinjektion har længe været accepteret som den foretrukne leveringsmåde for kemikalier, antistoffer, RNAi og genetiske modifikationsstrategier i myg43,44. Konsekvensen af betydelig fysisk manipulation, cellulær skade og stress kan undgås ved brug af oral levering, som også potentielt kan være egnet til store eller feltapplikationer. Tidligere arbejde har antydet, at RNAi virker allestedsnærværende inden for en individuel voksen myg29, hvilket giver mulighed for virkninger i alle væv, herunder spytkirtler. Ved at fodre myg med et stort antal dsRNA-ekspresserende E. coli, der fordøjes asynkront over en lang tidsramme, kan man potentielt opnå ensartet og ensartet eksponering for RNAi på tværs af alle individer i et bur. Denne metode gør det muligt at fodre et stort antal myg og analysere potentiel variabilitet af de resulterende fænotyper afhængigt af målgenet. En vigtig overvejelse er imidlertid muligheden for heterogen fordeling af bakterierne og dermed dsRNA i bomuldsfiberen. De 400 μL bakterier, der dagligt anvendes til myggesukkerfodring, ville indeholde ca. ≤4,6 μg dsRNA, som beskrevet og beregnet tidligere9, men mængden af dsRNA, der indtages af hver myg, blev ikke individuelt bestemt. Hvis opbygning af dsRNA-konstruktioner bliver rutine, giver denne enkle behandlingsprotokol mulighed for hurtig assimilering af denne teknik af enhver mygforsker. A priori er tidsforbruget under behandlingen (30 min om dagen) trivielt sammenlignet med den tid, det tager at lære og anvende mikroinjektion på lignende prøvestørrelser.
Feeding dsRNA anvendes rutinemæssigt til reverse genetics studier i modelorganismen Caenorhabditis elegans45. Dette tunge brugsniveau understreger værdien af den mundtlige leveringsmetode. Konstruktion af et An. gambiae genom-dækkende bibliotek i transformeret E. coli, svarende til det, der findes i C. elegans46,47, ville muliggøre hurtig omvendt genetisk screening i myg i øget skala. Det er dog vigtigt at bemærke, at metodens effektivitet i høj grad afhænger af de endogene niveauer af transkript, og om ekspressionen ikke er begrænset til målvævet, men udtrykt mere bredt 4,8,44. Derudover er der tegn på, at nogle insekticider kan fremkalde adfærdsmæssig undgåelse fra myg48, og fodring med bakterier, der potentielt fremkalder negative virkninger i dem, kan udløse lignende mønstre af undgåelse. I laboratoriets kontrollerede omgivelser, hvor myggene ikke havde en alternativ fødekilde, havde de ikke et valg om at undgå sukkervandet med E. coli, og behovet for en nærende kilde ville sandsynligvis tilsidesætte instinktet for at undgå bakterierne. Dette bør dog overvejes, hvis strategien var beregnet til at blive brugt i mindre kontrollerede omgivelser.
Det kan være muligt at målrette mod flere gener samtidigt (ved hjælp af en konstruktion, flere konstruktioner eller en blanding af transformerede bakterieisolater), men yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere effektiviteten. En anden vigtig overvejelse på dette punkt er evalueringen af mulige off-target eller synergistiske virkninger ved anvendelse af enkelte eller flere mål. Etablering af passende kontrolgener og -grupper er en vigtig del af forsøgsdesignet. Desuden er det fristende at spekulere i, at denne tilgang kan bruges til at målrette mod andre patogener eller vira49. Tidligere arbejde hen imod RNAi-induktion i myg blev udført under forhold, hvor reagenset blev injiceret direkte, så E. coli ikke var til stede. E. coli kan give et beskyttende rum, der muliggør langsommere frigivelse af dsRNA over tid, hvilket sikrer, at eksponeringen er mere eller mindre kontinuerlig over en meget længere periode29.
Endelig viser disse resultater, at virkningerne af denne teknik kan indstilles ved at justere tidsrammen (længde og startdag) for eksponeringen og den anvendte mængde E. coli . Denne funktion gjorde det muligt for os at studere funktionerne i essentielle gener (dsx og fkh) ved at identificere optimale knockdown-betingelser ved forsøg og fejl. Dette øger i høj grad sandsynligheden for, at målgener af interesse kan undersøges ved hjælp af denne teknik.
Sammenfattende blev det konstateret, at oral levering af RNAi til voksne myg kan være enkel, alsidig og en stærk tilgang til at studere myggenfunktion og til oprettelse af nye og formbare værktøjer til vektorkontrol af myggebårne sygdomme.

Mange sygdomme overføres af myg, hvilket gør undersøgelsen af mygfysiologi og genetik til en vigtig opgave. Anvendelsen af RNAi i disse organismer har været fremtrædende i de sidste 20 år og har muliggjort den funktionelle karakterisering af mange myggegener 1,2,3,4,5. Den mest almindeligt anvendte teknik til dsRNA-levering har været mikroinjektion, som har de ulemper, at det kan skade myggene og kræver betydelig tid og kræfter. Orale leveringsmetoder for RNAi er blevet testet, men hovedsageligt i larvestadiet af myggene 6,7,8,9. Oral levering af dsRNA i voksne myg er ikke blevet udforsket fuldt ud og kan være et nyttigt redskab til undersøgelse af vektorbiologi og vektorkontrol.
Malaria overføres af Anopheles myg, når en inficeret kvindelig myg tager et blodmåltid fra en uinficeret vært og injicerer spyt indeholdende malariaparasitter10. For i sidste ende at blive overført i spyt fra en myg skal parasitten overvinde mange forhindringer, herunder undvige myggens immunsystem, krydsning af midgutbarrieren og invasion af spytkirtlerne11. Myg spytkirtel (SG) arkitektur er nøglen til parasit invasion, og at arkitektur styres både af vigtige spytkirtel-udtrykt transkriptionsfaktorer samt determinanter for seksuel dimorfisme. Flere stærkt bevarede transkriptionsfaktorer er nødvendige for cellulær specifikation og homeostatisk vedligeholdelse af spytkirtlerne og for produktion og sekretion af spytproteiner, der fungerer i blodfodring 12,13,14. Gaffelhoved (Fkh) er en vinget helix transkriptionsfaktor, der fungerer som en vigtig regulator af insekt SG struktur og funktion (baseret på undersøgelser i frugtfluer og silkeorm møl)15,16,17,18,19,20. I Drosophila SG'erne fungerer Fkh med Sage, en SG-specifik grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktor, for at fremme SG-overlevelse og spytproduktion19. En vigtig, positiv co-regulator af spytproduktion i Drosophila er CrebA, en velunderstuderet leucinlynlåstranskriptionsfaktor, der opregulerer ekspressionen af sekretoriske vejgener 21,22,23. Der er også en stærk grad af morfologisk differentiering i kvindelige spytkirtler, der sandsynligvis spiller en nøglerolle, ikke kun i blodfodring, men også i parasitternes evne til at invadere dette væv24.
Mange af de gener, der er involveret i bestemmelsen af spytkirteloverlevelse, struktur, fysiologi og seksuel dimorfisme, har komplekse spatiotemporale ekspressionsprofiler 25,26,27, og de traditionelle leveringsmetoder for dsRNA til at inducere RNAi er ikke altid effektive til at målrette mod denne slags gener i dette eller andre væv. Imidlertid er oral levering af dsRNA i larvestadiet Aedes aegypti og An. gambiae myg blevet brugt med succes til at tavse den kvindespecifikke form af dsx-genet 9,28. Tidligere undersøgelser med dsRNA i myggespytkirtler viste, at selv om der var behov for store mængder dsRNA, var dæmpningseffekten relativt langvarig (mindst 13 dage)29. Her blev evnen hos den varmedræbte E. coli-stamme HT115 (DE3), der udtrykker sekvensspecifikt dsRNA for dsx, fkh eller CrebA, til at inducere RNAi-hæmning af disse gener hos voksne kvindelige myg testet. Oral administration af dsRNA-induceret gen knockdown i An. gambiae, med klare reduktioner i mRNA-niveauer og med fænotyper i overensstemmelse med tab af funktion af disse gener. Således vil denne tilgang sandsynligvis arbejde for at slå ned funktionen af en række spytkirtelgener.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0440-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAPP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuStart II PCR Supermix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95137-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anopheles gambiae G3</td>
			<td>BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</td>
			<td>MRA-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>P022628181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrebA</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>CrebA Rbt-PC</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damiens diet</td>
			<td>BioServ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DSB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115 (DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JM109 Competent cells</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10855001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 2</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Muc2; 27 675-1-AP</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (mouse).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Lipid dye; 1:50 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEMT easy</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR-green PCR master MIX</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaStudio 6</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio6 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab11</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-WGA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sage</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>87128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC 
			CGGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes

RNA-interferens har været et stærkt anvendt værktøj til omvendt genetisk analyse i to årtier. Hos voksne myg er dobbeltstrenget RNA (dsRNA) administration primært opnået via injektion, hvilket kræver betydelig tid og ikke er egnet til feltapplikationer. For at overvinde disse begrænsninger præsenterer vi her en mere effektiv metode til robust aktivering af RNAi ved oral levering af dsRNA til voksne Anopheles gambiae. Lange dsRNA'er blev produceret i Escherichia coli stamme HT115 (DE3), og en koncentreret suspension af varmedræbte dsRNA-holdige bakterier i 10% saccharose blev tilbudt på bomuldskugler ad-libitum til voksne myg. Bomuldskugler blev udskiftet hver anden dag i løbet af behandlingen. Anvendelse af denne metode til at målrette mod doublesex (et gen involveret i kønsdifferentiering) eller gaffelhoved (som koder for en spytkirteltranskriptionsfaktor) resulterede i reduceret målgenekspression og/eller proteinimmunfluorescenssignal målt ved henholdsvis kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR) eller fluorescenskonfokalmikroskopi. Defekter i spytkirtelmorfologi blev også observeret. Denne meget fleksible, brugervenlige, billige og tidseffektive metode til dsRNA-levering kan være bredt anvendelig på målgener, der er vigtige for insektvektorfysiologi og videre.

Til at begynde med blev mikroarray-ekspressionsdata fra VectorBase brugt til at scanne potentielle mål på tværs af udviklingsstadier36,37 for at bestemme ekspressionsstatus for alle gener, der er relevante for den aktuelle undersøgelse (tabel 1). Som forventet viste alle vores valgte målgener ekspression i voksne SG'er. Niveauerne af aapp og salvie var særligt høje (tabel 1). Også af note var de høje niveauer af ekspression af f-Agdsx hos voksne kvindelige SG'er9.
Specifikke segmenter fra hvert gen blev evalueret til brug som dsRNA ved hjælp af webapplikationen E-RNAi til design af RNAi-reagenser30. De ~ 400 bp-regioner, der indeholder sekvenser, der er unikke for hvert målgen, blev derefter klonet (figur 1A), omdannet til de relevante bakteriestammer og brugt til at forberede suspensioner af varmedræbte bakterier, som blev induceret til at producere dsRNA. Voksne myg blev fodret i 8 dage på de saccharose-gennemblødte bomuldskugler indeholdende de bakterielle suspensioner af dsRNA for f-Agdsx, fkh eller myre (den uafhængige negative kontrol).
Til analyse af RNAi-fodring af kvindelige myg blev det først bestemt, om f-Agdsx eller fkh dsRNA-fodringer inducerede genhæmning. En reduktion på 98,8% (±2,1) i fkh-transkriptionsniveauer blev observeret i gruppen fodret med fkh-dsRNA (figur 1B), hvilket indikerer, at dsRNA meget effektivt reducerede overfloden af fkh-transkripter i SG'er. Overraskende nok blev fkh mRNA-niveauerne reduceret med 82,0% (±18,9) i myggene behandlet med dsRNA for f-Agdsx, som havde en 89,86% (±4,48) af f-Agdsx-reduktion, tyder på, at fkh kunne være et mål for F-Dsx i spytkirtlen. Samtidig med den signifikante reduktion i fkh-ekspressionsniveauer udviste fkh-knockdown-myggene en signifikant stigning i antallet af sondeforsøg, der var nødvendige for at blodfodre. Disse myg udviste i gennemsnit fem gange flere fodringsforsøg end kontrolgruppen eller f-Agdsx dsRNA fodrede myg, der skulle være fuldstændig opslugt af blod (figur 1C). Dette førte til at spørge, om fkh knockdown RNAi-behandlingerne forårsagede ændringer i lokalisering og / eller distribution af centrale transkriptionsregulatorer (SG TF'er Sage og CrebA) (figur 2), udskillede proteiner (AAPP og mucin) (figur 3) og sekretoriske maskiner [Nile Red (lipider) og Rab11 (sekretoriske vesikler)] (figur 4). Det er vigtigt, at der blev observeret betydelige forskelle i farvningsintensitet på tværs af forskellige loberegioner, lobes og individuelle SG'er.
Som forudsagt blev niveauerne af salvie og CrebA-farvning markant reduceret i alle SG-lobes efter fkh RNAi (figur 2B) sammenlignet med myrekontrol-RNAi (figur 2A). Reduktioner i både de højeste maksimale intensitetsværdier (røde stiplede linjer og numeriske etiketter) og laveste maksimale intensitetsværdier (blå stiplede linjer og numeriske etiketter) i linjescanningsprofiler foreslog reduktioner i områder med både højt og lavt signal i vævet (figur 2A, B). Disse data tyder på, at An. gambiae fkh RNAi er effektiv, og at fkh regulerer produktionen og / eller stabiliteten af SG TF'erne Sage og CrebA i An. gambiae, analogt med deres genetiske forhold i Drosophila SG'er 19,38,39.
Når man overvejer meget rigelige spytkomponentproteiner, blev niveauerne af Anopheles anti-blodpladeprotein (AAPP)40,41 reduceret i alle tre SG-lobes efter fkh RNAi sammenlignet med kontrol RNAi-behandling (figur 3A, B; grøn). På den anden side blev der ikke observeret nogen ændringer i niveauet af Mucin (figur 3A,B; lilla). Disse data tyder på, at Fkh bidrager forskelligt til ekspressionen af forskellige spytproteingener.
Endelig blev der observeret to markører for sekretion (figur 4A,B): Rab11 (vesikler forbundet med apikale genbrugsendosomer)42 og Nilrød (lipider). Reduceret Rab11-fluorescens blev observeret i distale laterale (DL) lobes efter fkh RNAi-behandling (figur 4A v vs. 4B v; grøn). Imidlertid forekom der også øget Rab11-signal i de mediale (M) og proksimale laterale (PL) lobes (figur 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; grøn). Der blev ikke observeret nogen mærkbar forskel i Nilens røde signal (figur 4A,B; lilla) efter fkh RNAi sammenlignet med kontrol-RNAi-behandlingen. Disse data tyder på, at fkh-reduktion kan ændre nogle sekretoriske maskinhandlinger på en kompleks måde, der adskiller sig mellem SG-lapper.
<table fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Datasæt:</td>
			<td>Goltsev</td>
			<td>Neira Oviedo</td>
			<td>Neira Oviedo</td>
			<td>Bager</td>
			<td>Bager</td>
			<td>Bager</td>
			<td>Bager</td>
		</tr>
<tr>
<td>gen symbol</td>
			<td>funktion</td>
			<td>AGAP ID</td>
			<td>embryo (25 timer.)</td>
			<td>L3 larver</td>
			<td>L3 SG</td>
			<td>voksen kvinde krop (3 dage)</td>
			<td>voksen mand krop (3 dage)</td>
			<td>voksen kvinde SG (3 dage)</td>
			<td>voksen mand SG (3 dage)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AAPP</td>
			<td>spyt protein</td>
			<td>Svendborg, Svendborg , Svendborg</td>
			<td>3.92</td>
			<td>4.38</td>
			<td>4.33</td>
			<td>3.81</td>
			<td>2.46</td>
			<td>11.92</td>
			<td>2.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>CrebA</td>
			<td>txn faktor</td>
			<td>4464 KR.</td>
			<td>6.28</td>
			<td>5.22</td>
			<td>5.92</td>
			<td>2.99</td>
			<td>2.96</td>
			<td>3.27</td>
			<td>3.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>"</td>
			<td>txn faktor</td>
			<td>Svendborg, Svendborg , Svendborg</td>
			<td>4.50</td>
			<td>4.46</td>
			<td>5.23</td>
			<td>2.96</td>
			<td>2.86</td>
			<td>3.05</td>
			<td>2.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>dsx</td>
			<td>txn faktor</td>
			<td>AGAP004050</td>
			<td>4.91</td>
			<td>5.39</td>
			<td>5.55</td>
			<td>3.72</td>
			<td>4.00</td>
			<td>4.57</td>
			<td>4.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>fkh</td>
			<td>txn faktor</td>
			<td>4001671</td>
			<td>5.18</td>
			<td>4.67</td>
			<td>5.25</td>
			<td>2.99</td>
			<td>3.09</td>
			<td>3.21</td>
			<td>3.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>MUC2</td>
			<td>spyt protein</td>
			<td>40. nu, hvor man har en have en anden</td>
			<td>4.59</td>
			<td>5.53</td>
			<td>5.63</td>
			<td>2.96</td>
			<td>3.07</td>
			<td>3.08</td>
			<td>3.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rab11</td>
			<td>vesikulær handel</td>
			<td>400459</td>
			<td>10.21</td>
			<td>7.47</td>
			<td>8.60</td>
			<td>4.90</td>
			<td>3.79</td>
			<td>3.38</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>Salvie</td>
			<td>txn faktor</td>
			<td>Svendborg, Der er gratis brug for en af de bedste 3-i-201333</td>
			<td>5.32</td>
			<td>5.96</td>
			<td>8.89</td>
			<td>3.40</td>
			<td>3.33</td>
			<td>7.37</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Gennemsnitlige log2-mikroarray-udtryksprofiler for An. gambiae gener af interesse. Vist er gennavne, funktionel kategori, Vectorbase (AGAP) identifikatorer og gennemsnitlige log2 mikroarray ekspressionsdata indsamlet fra Vectorbase. Disse data indikerer, at vores gener af interesse (involveret i spytkirtel (SG) cellebiologi og sekretion) udtrykkes og beriges i larvestadium 3 (L3) og voksne SG'er sammenlignet med hele individer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig1v3.jpg"> Figur 1: f-Agdsx og fkh knockdown hos voksne An. gambiae reducerer fkh mRNA-niveauer i SG'erne og påvirker den kvindelige evne til blodfoder. (A) Repræsentativt billede af plasmiddesignet, der anvendes til dsRNA-produktion i denne metode. Den anden T7-promotorsekvens tilsættes plasmidet ved at inkludere det i 3'-primeren, der bruges til at forstærke indsatsen, der skal klones i pGEMT-plasmidet. Plasmidet omdannes derefter til E. coli HT115 (DE3) bakterier, og en fodringsopløsning fremstilles af en suspension af inducerede varmedræbte bakterier i 10% sukkervand. (B) Dyr, der blev fodret med en dsRNA-fodringsopløsning til enten f-Agdsx eller fkh, viste signifikant lavere niveauer af fkh-transkripter (envejs ANOVA med flere sammenligninger; n = 15). Imidlertid viste kun gruppen fodret med fkh dsRNA (C) en signifikant forskel i antallet af bidforsøg, der var nødvendige for at erhverve et blodmåltid. Myg i denne gruppe havde i gennemsnit brug for fem gange så mange sonderende forsøg på at opnå et vellykket blodmåltid end nødvendigt af kontrollen eller dsx-dsRNA-fodrede grupper (envejs ANOVA med flere sammenligninger; n = 15). Fejllinjer angiver standardfejlen i middelværdien (SEM). Hvert eksperiment blev udført i tre separate biologiske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig2v2.jpg"> Figur 2: fkh knockdown hos voksne An. gambiae spytkirtler reducerer SG transkriptionsfaktorniveauer. Vist er repræsentative billeder fra dag 13 voksne kvindelige An. gambiae SG'er efter 8 dage (dag 5-13) med oral eksponering for enten (A) ikke-relateret dsRNA-kontrol (myre) eller (B) dsRNA rettet mod SG TF-gaffelhovedet (fkh, AGAP001671) i 10% saccharose farvet med farvestofferne DAPI (DNA; rød), mærket hvedekimaglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), antisera mod SG TF'erne Sage (grøn) og CrebA (lilla). De viste skalastanglængder er mikron. SG'er (i) er skitseret med hvide bindestreger. Gule linjer i zoomede lapbilleder (af de områder, der er omgivet af gule felter og mærket "indsat") angiver, hvor linjescanningerne af signalintensiteten blev udført. Grønne og lilla kanalintensiteter svarende til linjescanninger for hver zoomet lap afbildes (altid fra venstre mod højre i SG) i graferne under billederne; X-akse = afstand (i pixels) og Y-akse = grå enhed (pixelintensitet). Pixelintensitetens dynamiske område er afgrænset af røde (maksimum) og blå (minimum) prikkede linjer, og de tilsvarende værdier vises på hver graf. MIP = maksimal intensitet 3D-projektion gennem hele SG-dybden. DL: distal lateral lobe; M: medial lap; PL: proksimal lateral lobe; SD: spytkanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig3v2.jpg"> Figur 3: fkh knockdown hos voksne An. gambiae spytkirtler reducerer SG-udskillede proteinniveauer. Vist er repræsentative billeder fra dag 13 voksne kvindelige An. gambiae SG'er efter 8 dage (dag 5-13) med oral eksponering for enten (A) ikke-relateret dsRNA-kontrol (myre) eller (B) dsRNA rettet mod SG TF-gaffelhovedet (fkh, AGAP001671) i 10% saccharose farvet med farvestofferne DAPI (DNA; rød), mærket hvedekimaglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), og spytproteinerne AAPP (grøn) og Mucin (MUC2, lilla). De viste skalastanglængder er mikron. SG'er (i) er skitseret med hvide bindestreger. Gule linjer i zoomede lapbilleder (af de områder, der er omgivet af gule felter) angiver, hvor linjescanningerne af signalintensiteten blev udført. Grønne og lilla kanalintensiteter svarende til linjescanninger for hver lap er afbildet (altid fra venstre mod højre i SG) i graferne under billederne; X-akse = afstand (i pixels) og Y-akse = grå enhed (pixelintensitet). Pixelintensitetens dynamiske område er afgrænset af røde (maksimum) og blå (minimum) stiplede linjer, og de tilsvarende værdier vises på hver graf. MIP = maksimal intensitet 3D-projektion gennem hele SG-dybden. DL: distal lateral lobe; M: medial lap; PL: proksimal lateral lobe; SD: spytkanal. Kursiv "DL" -etiketter (Bi) angiver to synlige områder af den samme DL-lap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig4v2.jpg"> Figur 4: fkh knockdown hos voksne An. gambiae spytkirtler reducerer SG-sekretionsmarkører. Vist er repræsentative billeder fra dag 13 voksne kvindelige An. gambiae SG'er efter 8 dage (dag 5-13) med oral eksponering for enten (A) ikke-relateret dsRNA-kontrol (myre) eller (B) dsRNA rettet mod SG TF-gaffelhovedet (fkh, AGAP001671) i 10% saccharose farvet med farvestofferne DAPI (DNA; rød), mærket hvedekimaglutinin (WGA, chitin / O-GlcNAcylation; blå), Nilrød (lipider; lilla) og antisera mod genbrugsendosomvesikelmarkøren Rab11 (grøn). De viste skalastanglængder er mikron. SG'er (i) er skitseret med hvide bindestreger. Gule linjer i zoomede lapbilleder (af de områder, der er omgivet af gule felter) angiver, hvor linjescanningerne af signalintensiteten blev udført. Grønne og lilla kanalintensiteter svarende til linjescanninger for hver lap er afbildet (altid fra venstre mod højre i SG) i graferne under billederne; X-akse = afstand (i pixels) og Y-akse = grå enhed (pixelintensitet). Pixelintensitetens dynamiske område er afgrænset af røde (maksimum) og blå (minimum) stiplede linjer, og de tilsvarende værdier vises på hver graf. MIP = maksimal intensitet 3D-projektion gennem hele SG-dybden. DL: distal lateral lobe; M: medial lap; PL: proksimal lateral lobe; SD: spytkanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Supplerende sagsmappe 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/SF%20sequences%20and%20promoters.docx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Den orale administration af dsRNA produceret af bakterier, en leveringsmetode til RNA-interferens (RNAi), der rutinemæssigt anvendes i Caenorhabditis elegans, blev med succes anvendt her på voksne myg. Vores metode giver mulighed for robuste reverse genetics-undersøgelser og transmissionsblokerende vektorstudier uden brug af injektion.

Effektiv oral RNA interferens (RNAi) administration til voksne anopheles gambiae myg

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

RNA-interferens er et af de vigtigste værktøjer, der anvendes til omvendt genetik i myg, og oral levering giver os mulighed for at inducere og opretholde genhæmning hos voksne myg uden behov for mikroinjektion. Den orale levering af dobbeltstrenget RNA til voksne myg er en billig og alsidig RNA-interferensmetode, som signifikant reducerer arbejde og tid og kræfter til at studere genfunktion. Denne metode kan bruges til at studere ikke kun andre målgener i Anopheles gambiae, men også i en anden anopheles af interesse, såsom Anopheles albinamus.Til at begynde med dyrkes en kultur fra en enkelt bakteriekoloni af Escherichia coli-stamme HT115 (DE3), der indeholder det dobbeltstrengede RNA, der udtrykker plasmid i fem milliliter lb indeholdende ampicillin og tetracyclin på en platformryster i 12 timer ved 37 grader Celsius og 180 o / min. Efter 12 timer skal du tage 0,5 ml af den natlige dyrkede bakteriekultur og lave en ud af 1000 fortynding i 2X gær tryptonmedier indeholdende ampicillin og tetracyclin. For at inducere den dobbeltstrengede RNA-produktion tilsættes IPDG ved den endelige koncentration på 40 mikromolære.Derefter inkuberes kulturen i to timer under rystende forhold som demonstreret. Ved afslutningen af inkubationen, når den optiske tæthed af kulturen når 0,4 ved 600 nanometer, pelleteres bakteriecellerne ved centrificering ved 4.000 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius og vaskes derefter cellerne i et volumen PBS. Efter at have spindet cellerne endnu en gang, skal du suspendere cellerne i PBS igen og inkubere ved 70 grader Celsius i en time.Efter at varme har dræbt bakterierne, lav alikvoter på 400 mikroliter volumen og opbevar dem ved 20 grader Celsius indtil videre brug. Bland en 400 mikroliter alikvot optøningsvarmedræbte bakterier, der udtrykker dobbeltstrenget RNA, med 1,6 ml 12% sukkeropløsning indeholdende 0,2% methylparaben. Sug en lille bomuldskugle i denne opløsning og læg den inde i et bur, der indeholder fem dage gamle myg og sørg for, at myggene lever af denne opløsning.Skift bomuldskuglen gennemblødt i dobbeltstrenget RNA-sukkeropløsning hver anden dag i otte på hinanden følgende dage, hvilket sikrer, at buret opretholdes under konstante forhold. For at bedøvende myggene med kulde skal du placere beholderen på is, indtil myg holder op med at bevæge sig, og derefter placere myggene på en kold overflade for at isolere kvinder til dissektion. Efter sprøjtning af myggene med ethanol skal du placere dem på en glasoverflade med PBS.Fastgør myggehovedet med et par tang og træk meget langsomt i brystkassen, så spytkirtlerne kan frigives til PBS. Når spytkirtlerne er dissekeret fra 10 myg, skal du trække kirtlerne til RNA-ekstraktion. Efter afslutning af RNA-ekstraktion suspenderes RNA-pelleten i 30 mikroliter RNA-frit vand.Mål absorbansen og beregn RNA-koncentrationen som beskrevet i tekstmanuskriptet. Ved hjælp af et kommercielt omvendt transkriptionssæt syntetiseres cDNA fra et mikrogram RNA. Fortynd cDNA'et 10 gange, og opsæt RTPCR-reaktionerne i triplikater for mål- og husholdningsgener i henhold til producentens anbefalinger.Forstærk CDNA med standard PCR-forhold i realtid. For at evaluere evnen til blodfoder skal du placere grupper på 15 kvindelige myg behandlet med mål og kontrolleret dobbeltstrenget RNA i små bure og sulte dem i fire timer. Giv defibrilleret billigt blod til myggene ved hjælp af et cirkulerende vandbad indstillet til 37 grader Celsius, glas myg feeders og peryfill membran.Overhold, tæl og registrer antallet af sonderende forsøg på med succes at erhverve et blodmåltid fra de første fem kvinder for at blive fuldt opslugt i hver gruppe. Efter isolering af frisk væv og PBS har demonstreret tidligere, skal du rette det i iskold acetone i 90 sekunder. Skyl derefter vævet flere gange i PBS og inkuber med primære antistoffer natten over ved fire grader Celsius med anti-serum fortyndet i PBS.Ved afslutningen af inkubationen vaskes vævet flere gange med PBS. Tilsæt fluorescerende sekundære antistoffer fortyndet i PBS, og inkuber i mørke ved stuetemperatur i to timer. Tilsæt enhver tællerplet 30 minutter før afslutningen af de to timers inkubation.Efter to timer skal du vaske vævet tre gange med PBS, derefter montere vævene i 100% glycerol på et standard mikroskop dias med en en millimeter tyk dækseddel og opbevare ved 20 grader Celsius indtil billeddannelse. Mikro-aray-ekspressionsdataene viste ekspressionen af alle udvalgte målrettede gener i voksne spytkirtler, og niveauerne af AAPP og salvie var særligt høje. Det dobbeltstrengede RNA reducerede effektivt overflod af gaffelhovedtranskripter i spytkirtlen.Gaffelhovedet dobbeltstrenget RNA-fodrede myg udviste fem gange flere fodringsforsøg end kontrolgruppen eller FEG dobbeltkøn dobbeltstrenget RNA-fodrede myg, der skulle være fuldstændig opslugt af blod. Niveauerne af salvie og CrebA farvning blev markant reduceret i alle spytkirtellober efter gaffelhoved RNA-interferens sammenlignet med myrekontrol RNA-interferens. Når man overvejer meget rigelige spytkomponentproteiner, blev niveauerne af AAPP reduceret i alle tre spytkirtellapper efter gaffelhoved RNA-interferens sammenlignet med kontrol RNA-interferensbehandling.På den anden side blev der ikke observeret nogen ændringer i niveauet af mucin. Disse data tyder på, at gaffelhovedet bidrager forskelligt til ekspressionen af forskellige spytproteingener. Reduceret Rab11-fluorescens blev observeret i distale laterale lobes efter gaffelhoved RNA-interferensbehandling, men øget Rab11-signal i de mediale og proksimale laterale lobes forekom også.Der blev ikke observeret nogen mærkbar forskel i Nilens røde signal efter gaffelhovedets RNA-interferens sammenlignet med kontrol-RNA-interferensbehandlingen. nogle sekretær maskine reaktion på en kompleks måde, der adskiller sig mellem spytkirtel lobes. Denne teknik kan gøre det muligt for forskere at tavse gener, for hvilke ekspression kan reduceres ved en enkelt injektion af dobbeltstrenget RNA og at udforske oral levering af dobbeltstrenget RNA for at anvende RNAi som en potentiel vektorkontrolmetode.

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-medieret Gene Knockdown og<em&gt; In Vivo</em&gt; Diurese Assay i Voksen Kvinde<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Myg

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larve RNA-interferens i Den Røde rismelbille,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Levering ind<em&gt; Malariamyg</em&gt; Pupper

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Praktisk brug af RNA-interferens: Oral levering af dobbelt-strenget RNA i Liposom bærere af kakerlakker

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: en open source data integration værktøj til Big data transkriptomics designet til malaria vektor Anopheles malariamyg

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

En bakteriel oral fodring assay med antibiotika-behandlede myg

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...