Name: effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes
Uploaded: 2022-03-01T13:00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

De auteurs willen het personeel en de wetenschappers binnen de entomologietak en de afdeling parasitaire ziekten en malaria van de CDC bedanken, en Brian Trigg en Michelle Chiu voor hulp bij de voorbereiding van bacteriën bij JHU en / of nuttige discussies over dit werk. We bedanken de JHMRI Insectary en manager Chris Kizito voor de toegang tot en het fokken van An. gambiae muggen. We danken Wei Huang (JHSPH) voor hulp bij het verkrijgen van plasmiden PJet GFP en pPB47 GFP voor gebruik in deze studie. Financiering voor dit werk werd verstrekt door: NIH R21AI153588 (aan DJA), een Johns Hopkins Malaria Research Institute Postdoctoral Fellowship (aan MW); en door een subsidie van de Good Ventures Foundation en het Open Philanthropy Project aan de CDC Foundation getiteld Support cryopreservation and suppression of female development in mosquitoes to assist research for malaria, Open Philanthropy Project, 2017. We waarderen de hulp van het personeel van de JHU Microscope Facility en de toepasselijke NIH-subsidieondersteuning voor de gebruikte microscoop (NIH Grant #: S10OD016374). De bevindingen en conclusies in dit manuscript zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de CDC. Het gebruik van handelsnamen is alleen voor identificatie en impliceert geen goedkeuring door de Centers for Disease Control and Prevention, de Public Health Service of het Amerikaanse ministerie van Volksgezondheid en Human Services.

1. DSRNA klonen tot E. coli-expressievector
<ol><li>Selecteer de doelgensequentie die u wilt invoegen in een geschikte vector voor de expressie van dsRNA. Haal de expressiewaarden op uit Vectorbase.org met behulp van de volgende methode.<ol>
<li>Zoek naar een interessant gen (bijvoorbeeld tabel 1) in het zoekvak van de startpagina.</li>
		<li>Navigeer op de resulterende genpagina naar de 8. Transcriptomics sectie.</li>
		<li>Zoek naar de vermelde relevante RNA-seq- en microarray-genexpressie-experimenten.</li>
		<li>Transcribeer interessante waarden in de spreadsheetsoftware en maak een gegevenstabel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer een in de handel verkrijgbaar plasmide met ten minste één T7-promotor die moet worden gebruikt. Als het geselecteerde plasmide slechts één T7-promotor heeft (zoals de meeste commerciële plasmiden), neem dan een tweede T7-promotor op in de omgekeerde primer die moet worden gebruikt voor de amplificatie van het dsDNA voor het betreffende gen. OPMERKING: De dsRNA-sequentie voor de doelgenen kan worden geselecteerd met behulp van de webapplicatie E-RNAi voor het ontwerp van RNAi-reagentia30. Ofwel lang dsRNA (ongeveer 400 bp) of kort haarspeld dsRNA (shRNA) kan worden ontworpen op basis van specifieke gensequenties. Deze sequenties moeten worden versterkt en gesequenced voor identiteitsbevestiging voordat ze worden gekloond. De geselecteerde gengebieden, plasmiden en promotors die in deze studie worden gebruikt, zijn opgenomen in aanvullend dossier 1.</li>
	<li>Voer het klonen uit volgens een eenvoudige procedure in één stap die eerder is beschreven 9,31. Zuiver hiervoor het PCR-product en trek het naar het gelineariseerde plasmide-DNA. Gebruik het product van de ligatie voor de hitteschoktransformatie van competente E. coli-cellen 32. Selecteer de getransformeerde cellen via blauw/wit screening. Bevestig de oriëntatie van het inzetstuk met behulp van een T7-primer PCR en bevestig de volgorde met M13-primers. OPMERKING: Wit/blauwe screenings kunnen worden gebruikt wanneer het plasmide dat is geselecteerd voor transformatie het lacZ-gen draagt dat codeert voor β-galactosidase. Witte kolonies moeten de gewenste insert in de lacZ bevatten en kunnen worden geselecteerd om de aanwezigheid en oriëntatie van de doelsequentie33 verder te bevestigen.</li>
	<li>Zuiver het plasmide vanaf de eerste transformatie en gebruik het om competente E. coli HT115 (DE3) te transformeren zoals eerder beschreven34. Na bevestiging dat het plasmide met de insert aanwezig is in de competente E. coli HT115 (DE3), maak glycerolvoorraden bacteriën voor eenmalig gebruik. OPMERKING: Een geschikt niet-gerelateerd controle-dsRNA moet worden verkregen of voorbereid om in elk experiment te gebruiken. In dit geval wordt de sequentie voor het niet-verwante gen aintegumenta (mier) van Arabidopsis thaliana gebruikt.</li>
</ol>2. Bereiding van door hitte gedode bacteriën die dsRNA tot expressie brengen
<ol><li>Kweek een cultuur uit een enkele bacteriekolonie van E. coli stam HT115 (DE3) die het dsRNA tot expressie brengt plasmide in 50 ml Luria Bouillon (LB) met 100 μg/ml ampicilline en 12,5 μg/ml tetracycline, op een platformschudder (180 rpm) bij 37 °C gedurende 12 uur.</li>
	<li>Verdun de bacteriecultuur (1:1000) in 2x gist trypton (2x YT) media met 100 μg/ml ampicilline en 12,5 μg/ml tetracycline.</li>
	<li>Induceer dsRNA-productie door toevoeging van 40 μM (eindconcentratie) isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).</li>
	<li>Wanneer de cellen een O.D.600 = 0,4 bereiken, ongeveer na 2 uur inductie bij 37 °C met agitatie bij 180 tpm, bereid dan een geconcentreerde suspensie van warmte-gedode bacteriën voor zoals beschreven door Taracena et al 9. Pellet de cellen door centrifugering (4000 x g, 4 °C, 10 min) en was de cellen in één volume natriumfosfaatbuffer (PBS).</li>
	<li>Draai opnieuw onder dezelfde omstandigheden, suspensie opnieuw in PBS tot 1/100 van het oorspronkelijke volume en plaats gedurende 1 uur bij 70 °C.</li>
	<li>Maak 400 μL aliquots van de door hitte gedode bacteriën en bewaar deze aliquots bij -20 °C tot verder gebruik (niet langer dan een week bewaren). Deze suspensie van warmtedode bacteriën bevat het specifieke dsRNA voor de RNAi-experimenten. Voer deze procedure zowel uit voor het doelgen dsRNA-bacterie als voor de niet-gerelateerde dsRNA-controle die in elk experiment moet worden gebruikt.</li>
</ol>3. Muggen voeden met hittedode bacteriën die dsRNA tot expressie brengen
<ol><li>Ontdooi één aliquot dsRNA (HT115 (DE3) bacteriesuspensie) en meng met 1,6 ml 12% suikeroplossing met 0,2% methylparaben.</li>
	<li>Week een klein watje in deze oplossing en plaats het geweekte watje in een kooi met 5 dagen oude muggen. Zorg ervoor dat de muggen zich voeden met deze oplossing en tegelijkertijd zowel de suiker als de dsRNA-bevattende bacteriën oppikken.</li>
	<li>Vervang het watje gedrenkt in dsRNA-suikeroplossing om de andere dag gedurende 8 opeenvolgende dagen.</li>
	<li>Houd muggenkooien onder constante omstandigheden, d.w.z. 27 °C en 80% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van 12 h:12 h licht: donkere fotocyclus, gescheiden door een 30 minuten zonsopgang en 30 min schemeringsperiode.</li>
</ol>4. Assay target genexpressie niveaus
<ol><li>Verdoving de muggen door de container een minuut op ijs te plaatsen of totdat de muggen stoppen met bewegen. Zodra de muggen zijn verdoofd, plaats je ze op een koud oppervlak om vrouwtjes te isoleren voor dissectie.</li>
	<li>Spuit 70% ethanol op de muggen en plaats ze op een glazen oppervlak met PBS. Zet met een tang de muggenkop stevig vast en trek heel langzaam aan de thorax, waardoor de speekselklieren in de PBS kunnen worden vrijgegeven.</li>
	<li>Bewaar de speekselklieren in ijskoude PBS totdat 10 personen zijn ontleed. Pool Tien SG's voor RNA-extractie met behulp van de guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform methode. Suspensie van de RNA-pellet in 30 μL RNase-vrij water.</li>
	<li>Gebruik 1 μL aliquot van het RNA geëxtraheerd uit de SG in de vorige stap, om de absorptie bij 260 en 280 nm af te lezen en bereken de RNA-concentratie van elk monster door te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor. Een 260/280 verhouding van ~2,0 duidt op RNA van goede kwaliteit.</li>
	<li>Gebruik 1 μg van het gezuiverde RNA om complementair DNA (cDNA) te synthetiseren met behulp van een commerciële reverse transcriptiekit.</li>
	<li>Maak een verdunning van 1:10 van het cDNA om een RT-PCR-reactie voor te bereiden volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Bereid voor elk monster een reactie voor het doelgen voor en stel tegelijkertijd een reactie op met het huishoudingsgen (HK). Stel elke genreactie in een technisch drievoud in om de impact van willekeurige variatie uit de methode te elimineren. OPMERKING: Hier zijn het An. gambiae ribosomale S7-gen (GeneBank: L20837.1) en actine (VectorBase: AGAP000651) gebruikt als HK-genen.</li>
	<li>Gebruik alle primers in een eindconcentratie van 300 nM, volgens de aanwijzingen van de SYBR-groene fabrikant. Versterken met standaard PCR-omstandigheden: 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van 15 s bij 95 °C en 60 s bij 60 °C. OPMERKING: Om genexpressie te kwantificeren, wordt de delta-delta-Ct-methode (ΔΔCt) gebruikt. Delta Ct (ΔCt) is het verschil tussen de Ct van het doelgen en de Ct van het huishoudgen. ΔΔCt is het verschil tussen de ΔCt van de experimentele groep en de ΔCt van de controlegroep35.</li>
</ol>5. Fenotypische evaluatie: succesvolle bloedtoevoer
<ol><li>Om het vermogen om bloed te voeden te evalueren, stelt u groepen van 15 vrouwelijke muggen in die zijn behandeld met doel- en controledrna op kleine kooien (12 cm diameter) en hongert u ze gedurende 4 uur uit.</li>
	<li>Met behulp van een circulerend waterbad ingesteld op 37 °C, bieden glazen muggenvoeders (24 mm diameter) en parafilmmembraan gedefibrined schapenbloed aan de muggen. OPMERKING: Bloed kan worden verkregen van een commerciële leverancier die het aseptisch trekt van gezonde donordieren van Amerikaanse oorsprong en handmatig defibrineert zonder anticoagulantia of additieven.</li>
	<li>Door directe observatie, tel en registreer het aantal onderzoekende pogingen om met succes een bloedmaaltijd te verkrijgen van de eerste vijf vrouwtjes om volledig gezwollen te worden in elke groep. OPMERKING: Om significante metabole veranderingen in de muggen te voorkomen, die kunnen interfereren met energiebronnen die het bloedzoekgedrag beïnvloeden, werd uithongering tot het minimum beperkt (4 uur). Als gevolg hiervan zou niet elke mug gretig op zoek gaan naar het bloedmeel en we beperkten het aantal opgezwollen vrouwtjes tot vijf (een derde van het totaal van elke groep), om het effect van tijdsvariabelen zoals blootstelling aan menselijke geur, temperatuurverandering tussen de kamers en de voedingsoppervlakken, enz. Te verminderen.</li>
</ol>6. Fenotypische evaluatie: speekselkliermorfologie en downregulatie van relevante eiwitten
<ol><li>Isoleer vers weefsel in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zoals beschreven in stap 4.2 en fixeer in ijskoude aceton gedurende 90 s. Spoel meerdere keren in 1x PBS na het verwijderen van de aceton. Incubeer met primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C met antiserum (zie Tabel met materialen) verdund tot 1x PBS. OPMERKING: Zie tabel met materialen voor de identificatie van de primaire antilichamen die worden gebruikt voor speekseleiwitten (Anopheles anti-bloedplaatjeseiwit, AAPP; Mucine 2, MUC2), SG transcriptiefactoren (Vorkkop, fkh; Salie, wijze; Cyclisch-AMP respons element-bindend eiwit A, CrebA), en een marker van secretoire blaasjes (Rab11). Deze antilichamen worden gebruikt als uitlezingen voor SG-vorm en -functie. Elk antilichaam dat geschikt is voor immunofluorescentie moet echter geschikt zijn voor dit protocol.</li>
	<li>Meerdere keren wassen in 1x PBS. Voeg secundaire antilichamen (fluorescerend) verdund in 1x PBS toe en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Voeg eventuele counterstain [zoals 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI; DNA), tarwekiem agglutinine (WGA; voor chitine), falloïdine (voor F-actine) en/of Nile Red (voor lipiden)] 30 min voor het einde van de 2 uur incubatie.</li>
	<li>Drie keer wassen in 1x PBS. Monteer vervolgens de weefsels in 100% glycerol op een standaard microscoopglaasje met een 1 mm dikke coverslip en bewaar bij -20 °C tot beeldvorming met behulp van een fluorescentie confocale microscoop. OPMERKING: Om kwantitatieve gegevens te verkrijgen, moeten de beeldinstellingen constant worden gehouden. Hier werden alleen maximale intensiteitsprojectiebeelden door het volledige 3D-volume van het weefsel opgenomen en werd alle beeldkwantificering genormaliseerd tussen behandelingen (binnen een experiment) op basis van DAPI-signaal in niet-SG-weefselresten (vetlichaam, cuticula of hoofd) die ook op de dia aanwezig waren.</li>
</ol>

De auteurs melden dat ze geen belangenconflicten te melden hebben.

Het vermogen om dsRNA effectief af te leveren aan An. gambiae muggen door orale voeding heeft brede implicaties voor studies van vectorbiologie, zowel in het laboratorium als in het veld. Micro-injectie is al lang geaccepteerd als de voorkeursmethode voor afgifte van chemicaliën, antilichamen, RNAi en genetische modificatiestrategieën bij muggen43,44. Het gevolg van aanzienlijke fysieke manipulatie, cellulaire schade en stress kan worden vermeden door het gebruik van orale toediening, die mogelijk ook geschikt kan zijn voor grootschalige of veldtoepassingen. Eerder werk heeft gesuggereerd dat RNAi alomtegenwoordig werkt in een individuele volwassen mug29, waardoor effecten in alle weefsels, inclusief speekselklieren, mogelijk zijn. Door muggen te voeden met grote aantallen dsRNA-tot expressie brengende E. coli die asynchroon worden verteerd gedurende een lange periode, kan men mogelijk een consistente en uniforme blootstelling aan de RNAi bereiken voor alle individuen in een kooi. Deze methode maakt het mogelijk om grote aantallen muggen te voeden en de potentiële variabiliteit van de resulterende fenotypen te analyseren, afhankelijk van het doelgen. Een belangrijke overweging is echter de mogelijkheid van heterogene verdeling van de bacteriën, en dus dsRNA, in de katoenvezel. De 400 μL bacteriën die dagelijks worden gebruikt voor muggensuikervoeding zou ongeveer ≤4,6 μg dsRNA bevatten, zoals eerder beschreven en berekend9, maar de hoeveelheid dsRNA die door elke mug werd ingenomen, werd niet individueel bepaald. Als het bouwen van dsRNA-constructies routine wordt, zorgt dit eenvoudige behandelingsprotocol voor een snelle assimilatie van deze techniek door elke muggenonderzoeker. A priori is de tijdsbesteding tijdens de behandeling (30 min per dag) triviaal in vergelijking met de tijd die nodig is om te leren en micro-injectie toe te passen op vergelijkbare steekproefgroottes.
Het voeden van dsRNA wordt routinematig gebruikt voor omgekeerde geneticastudies in het modelorganisme Caenorhabditis elegans45. Dit zware gebruiksniveau onderstreept de waarde van de orale toedieningsbenadering. De bouw van een An. gambiae genoombrede bibliotheek in getransformeerde E. coli, vergelijkbaar met die in C. elegans46,47, zou een snelle omgekeerde genetische screening bij muggen op grotere schaal mogelijk maken. Het is echter belangrijk op te merken dat de efficiëntie van de methode in grote mate afhangt van de endogene niveaus van transcriptie en of de expressie niet beperkt is tot het doelweefsel, maar meer in het algemeen wordt uitgedrukt 4,8,44. Bovendien zijn er aanwijzingen dat sommige insecticiden gedragsvermijding van muggen kunnen veroorzaken48, en voeding met bacteriën die mogelijk nadelige effecten bij hen veroorzaken, kan vergelijkbare patronen van vermijding veroorzaken. In de gecontroleerde omgeving van het laboratorium, waar de muggen geen alternatieve voedselbron hadden, hadden ze geen keuze om het suikerwater met E. coli te vermijden en de behoefte aan een voedzame bron zou waarschijnlijk het instinct om de bacteriën te vermijden overschrijven. Dit moet echter worden overwogen als de strategie bedoeld was om te worden gebruikt in minder gecontroleerde omgevingen.
Het kan mogelijk zijn om meerdere genen tegelijkertijd te targeten (met behulp van één construct, meerdere constructen of een mengsel van getransformeerde bacteriële isolaten), maar verdere studies zijn nodig om de effectiviteit te beoordelen. Een andere belangrijke overweging op dit punt is de evaluatie van mogelijke off-target of synergetische effecten bij het gebruik van enkele of meerdere doelen. Het vaststellen van geschikte controlegenen en -groepen is een belangrijk onderdeel van het experimentele ontwerp. Verder is het verleidelijk om te speculeren dat deze aanpak kan worden gebruikt om andere pathogenen of virussen aan tepakken 49. Eerder werk in de richting van RNAi-inductie bij muggen werd uitgevoerd onder omstandigheden waarin het reagens direct werd geïnjecteerd, dus E. coli waren niet aanwezig. De E. coli kan een beschermend compartiment bieden dat de langzamere afgifte van dsRNA in de loop van de tijd mogelijk maakt, waardoor de blootstelling min of meer continu is over een veel langere periode29.
Ten slotte tonen deze resultaten aan dat de effecten van deze techniek niet mogelijk zijn door het tijdsbestek (lengte en startdag) van blootstelling en de gebruikte hoeveelheid E. coli aan te passen. Deze functie stelde ons in staat om de functies van essentiële genen (dsx en fkh) te bestuderen door optimale knockdown-omstandigheden te identificeren met vallen en opstaan. Dit vergroot de kans aanzienlijk dat doelgenen van belang kunnen worden onderzocht met behulp van deze techniek.
Samenvattend bleek dat orale toediening van RNAi aan volwassen muggen eenvoudig, veelzijdig en een krachtige benadering kan zijn voor het bestuderen van de functie van muggengenen en voor het creëren van nieuwe en kneedbare hulpmiddelen voor vectorcontrole van door muggen overgedragen ziekten.

Veel ziekten worden overgedragen door muggen, waardoor de studie van muggenfysiologie en genetica een belangrijke onderneming is. Het gebruik van RNAi in deze organismen is de afgelopen 20 jaar prominent geweest en heeft de functionele karakterisering van veel muggengenenmogelijk gemaakt 1,2,3,4,5. De meest gebruikte techniek voor dsRNA-afgifte is micro-injectie, wat de nadelen heeft dat het de muggen kan verwonden en veel tijd en moeite kost. Orale toedieningsmethoden voor RNAi zijn getest, maar voornamelijk in het larvale stadium van de muggen 6,7,8,9. Orale toediening van dsRNA bij volwassen muggen is nog niet volledig onderzocht en zou een nuttig hulpmiddel kunnen zijn voor de studie van vectorbiologie en vectorcontrole.
Malaria wordt overgedragen door Anopheles-muggen wanneer een geïnfecteerde vrouwelijke mug een bloedmaaltijd van een niet-geïnfecteerde gastheer neemt en speeksel injecteert dat malariaparasieten bevat10. Om uiteindelijk in het speeksel van een mug te worden overgedragen, moet de parasiet veel hindernissen overwinnen, waaronder het ontwijken van het immuunsysteem van de mug, het doorkruisen van de midgutbarrière en invasie van de speekselklieren11. Mosquito speekselklier (SG) architectuur is de sleutel tot parasiet invasie en die architectuur wordt gecontroleerd door zowel belangrijke speekselklier-uitgedrukt transcriptie factoren als determinanten van seksueel dimorfisme. Verschillende sterk geconserveerde transcriptiefactoren zijn vereist voor cellulaire specificatie en homeostatisch onderhoud van de speekselklieren en voor de productie en secretie van speekseleiwitten die functioneren in bloedvoeding 12,13,14. Vorkkop (Fkh) is een gevleugelde helixtranscriptiefactor die functioneert als een belangrijke regulator van de structuur en functie van insecten-SG (gebaseerd op studies in fruitvliegen en de zijderupsenmot)15,16,17,18,19,20. In de Drosophila SG's functioneert Fkh met Sage, een SG-specifieke basis helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactor, om SG-overleving en speekselproductie te bevorderen19. Een belangrijke, positieve co-regulator van speekselproductie in Drosophila is CrebA, een goed bestudeerde leucine rits transcriptiefactor die de expressie van secretoire pathway genen upreguleert 21,22,23. Er is ook een sterke mate van morfologische differentiatie in vrouwelijke speekselklieren die waarschijnlijk een sleutelrol speelt, niet alleen bij bloedtoevoer, maar ook bij het vermogen van parasieten om dit weefsel binnen te dringen24.
Veel van de genen die betrokken zijn bij het bepalen van speekselklieroverleving, structuur, fysiologie en seksueel dimorfisme hebben complexe spatiotemporale expressieprofielen 25,26,27, en de traditionele toedieningsmethoden van dsRNA om RNAi te induceren zijn niet altijd efficiënt in het richten op dit soort genen in dit of andere weefsels. Orale toediening van dsRNA in het larvale stadium Aedes aegypti en An. gambiae muggen is echter met succes gebruikt om de vrouwspecifieke vorm van het dsx-gen 9,28 het zwijgen op te leggen. Eerdere studies met dsRNA in speekselklieren van muggen vonden dat, hoewel grote hoeveelheden dsRNA nodig waren, het uitschakelingseffect relatief langdurig was (ten minste 13 dagen)29. Hier werd het vermogen van hitte-gedode E. coli-stam HT115 (DE3) die sequentiespecifiek dsRNA tot expressie brengt voor dsx, fkh of CrebA om RNAi-uitschakeling van deze genen in volwassen vrouwelijke muggen te induceren, getest. Orale toediening van dsRNA veroorzaakte gen knockdown in An. gambiae, met duidelijke verlagingen van de mRNA-niveaus en met fenotypes die consistent zijn met het functieverlies van deze genen. Deze aanpak zal dus waarschijnlijk werken om de functie van een verscheidenheid aan speekselkliergenen neer te halen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0440-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAPP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuStart II PCR Supermix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95137-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anopheles gambiae G3</td>
			<td>BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</td>
			<td>MRA-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>P022628181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrebA</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>CrebA Rbt-PC</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damiens diet</td>
			<td>BioServ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DSB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115 (DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JM109 Competent cells</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10855001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 2</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Muc2; 27 675-1-AP</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (mouse).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Lipid dye; 1:50 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEMT easy</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR-green PCR master MIX</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaStudio 6</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio6 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab11</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-WGA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sage</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>87128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC 
			CGGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes

RNA-interferentie is al twee decennia een intensief gebruikt hulpmiddel voor omgekeerde genetische analyse. Bij volwassen muggen is dubbelstrengs toediening van RNA (dsRNA ) voornamelijk via injectie uitgevoerd, wat veel tijd kost en niet geschikt is voor veldtoepassingen. Om deze beperkingen te overwinnen, presenteren we hier een efficiëntere methode voor robuuste activering van RNAi door orale toediening van dsRNA aan volwassen Anopheles gambiae. Lange dsRNA's werden geproduceerd in Escherichia coli stam HT115 (DE3), en een geconcentreerde suspensie van hitte-gedode dsRNA-bevattende bacteriën in 10% sucrose werd aangeboden op wattenbollen ad-libitum aan volwassen muggen. Wattenbollen werden om de 2 dagen vervangen voor de duur van de behandeling. Het gebruik van deze methode om doublesex (een gen dat betrokken is bij geslachtsdifferentiatie) of vorkkop (die codeert voor een speekselkliertranscriptiefactor) te targeten, resulteerde in een verminderd doelgenexpressie en / of eiwitimmunofluorescentiesignaal, zoals gemeten door respectievelijk kwantitatieve Real-Time PCR (qRT-PCR) of fluorescentie confocale microscopie. Defecten in speekselkliermorfologie werden ook waargenomen. Deze zeer flexibele, gebruiksvriendelijke, goedkope, tijdsefficiënte methode van dsRNA-afgifte zou breed toepasbaar kunnen zijn op doelgenen die belangrijk zijn voor de fysiologie van insectenvectoren en daarbuiten.

Om te beginnen werden microarray-expressiegegevens van VectorBase gebruikt om potentiële doelen in ontwikkelingsstadia36,37 te scannen om de expressiestatus van alle genen die relevant zijn voor de huidige studie te bepalen (tabel 1). Zoals verwacht vertoonden al onze gekozen doelgenen expressie in volwassen SG's. De niveaus van aapp en salie waren bijzonder hoog (tabel 1). Ook van belang waren de hoge niveaus van expressie van f-Agdsx bij volwassen vrouwelijke SGs9.
Specifieke segmenten van elk gen werden geëvalueerd voor gebruik als dsRNA met behulp van de webapplicatie E-RNAi voor het ontwerp van RNAi-reagentia30. De ~ 400 bp-regio's met sequenties die uniek zijn voor elk doelgen, werden vervolgens gekloond (figuur 1A), omgezet in de juiste bacteriestammen en gebruikt om suspensies van warmte-gedode bacteriën te bereiden, die werden geïnduceerd om dsRNA te produceren. Volwassen muggen werden gedurende 8 dagen gevoed met de met sucrose doordrenkte wattenbollen met de bacteriële suspensies van dsRNA voor f-Agdsx, fkh of mier (de niet-gerelateerde negatieve controle).
Voor de analyse van RNAi-voeding van vrouwelijke muggen werd eerst bepaald of f-Agdsx- of fkh dsRNA-voedingen gen-uitschakeling veroorzaakten. Een reductie van 98,8% (±2,1) in fkh-transcriptniveaus werd waargenomen in de groep gevoed met fkh-dsRNA (figuur 1B), wat aangeeft dat het dsRNA zeer effectief de overvloed aan fkh-transcripten in SG's verminderde. Verrassend genoeg werden fkh-mRNA-niveaus met 82,0% (±18,9) verlaagd in de muggen die werden behandeld met dsRNA voor f-Agdsx, die een 89,86% (±4,48) f-Agdsx-reductie hadden, wat suggereert dat fkh een doelwit zou kunnen zijn van F-Dsx in de speekselklier. Gelijktijdig met de significante vermindering van fkh-expressieniveaus vertoonden de fkh-knockdown-muggen een significante toename van het aantal tasterpogingen dat nodig is om bloed te voeden. Deze muggen vertoonden gemiddeld vijf keer meer voedingspogingen dan de controlegroep of f-Agdsx dsRNA gevoede muggen om volledig te worden volgepropt met bloed (figuur 1C). Dit leidde tot de vraag of de fkh knockdown RNAi-behandelingen veranderingen veroorzaakten in lokalisatie en / of distributie van belangrijke transcriptionele regulatoren (SG TF's Salie en CrebA) (figuur 2), uitgescheiden eiwitten (AAPP en mucine) (figuur 3) en secretoire machines [Nile Red (lipiden) en Rab11 (secretoire blaasjes)] (figuur 4). Belangrijk is dat substantiële verschillen in kleuringsintensiteit werden waargenomen in verschillende lobbenregio's, lobben en individuele SG's.
Zoals voorspeld, waren de niveaus van salie- en CrebA-kleuring aanzienlijk verminderd in alle SG-lobben na fkh RNAi (figuur 2B) in vergelijking met mierenbestrijding RNAi (figuur 2A). Verlagingen van zowel de hoogste maximale intensiteitswaarden (rode stippellijnen en numerieke labels) als de laagste maximale intensiteitswaarden (blauwe stippellijnen en numerieke labels) in lijnscanprofielen suggereerden verminderingen in gebieden met zowel hoog als laag signaal in het weefsel (figuren 2A,B). Deze gegevens suggereren dat An. gambiae fkh RNAi effectief is en dat fkh de productie en/of stabiliteit van de SG TFs Sage en CrebA in An. gambiae reguleert, analoog aan hun genetische verwantschap in Drosophila SGs 19,38,39.
Bij het overwegen van zeer overvloedige speekselcomponenteneiwitten waren de niveaus van Anopheles anti-bloedplaatjeseiwit (AAPP)40,41 verlaagd in alle drie de SG-lobben na fkh RNAi, vergeleken met controle RNAi-behandeling (Figuur 3A,B; groen). Aan de andere kant werden geen veranderingen in de niveaus van Mucine waargenomen (figuur 3A, B; paars). Deze gegevens suggereren dat Fkh anders bijdraagt aan de expressie van verschillende speekseleiwitgenen.
Ten slotte werden twee markers van secretie waargenomen (figuren 4A,B): Rab11 (blaasjes geassocieerd met apicale recycling-endosomen)42 en Nile Red (lipiden). Verminderde Rab11-fluorescentie werd waargenomen in distale laterale (DL) lobben na behandeling met fkh RNAi (figuur 4A v vs. 4B v; groen). Er trad echter ook een verhoogd Rab11-signaal in de mediale (M) en proximale laterale (PL) kwabben (figuur 4A vii, ix vs. 4B vii, ix; groen) op. Er werd geen waarneembaar verschil waargenomen in het Nijlroodsignaal (figuren 4A,B; paars) na fkh RNAi in vergelijking met de controlebehandeling met RNAi. Deze gegevens suggereren dat fkh-reductie sommige secretoire machine-actie kan veranderen op een complexe manier die verschilt tussen SG-lobben.
<table fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>Dataset:</td>
			<td>Goltsev</td>
			<td>Neira Oviedo</td>
			<td>Neira Oviedo</td>
			<td>Bakker</td>
			<td>Bakker</td>
			<td>Bakker</td>
			<td>Bakker</td>
		</tr>
<tr>
<td>gen symbool</td>
			<td>functie</td>
			<td>AGAP-id</td>
			<td>embryo (25 uur)</td>
			<td>L3 larven</td>
			<td>L3 SG</td>
			<td>volwassen vrouw lichaam (3 dagen)</td>
			<td>volwassen man lichaam (3 dagen)</td>
			<td>volwassen vrouw SG (3 dagen)</td>
			<td>volwassen man SG (3 dagen)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AAPP</td>
			<td>speeksel eiwit</td>
			<td>AGAP009974</td>
			<td>3.92</td>
			<td>4.38</td>
			<td>4.33</td>
			<td>3.81</td>
			<td>2.46</td>
			<td>11.92</td>
			<td>2.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>CrebA</td>
			<td>TXN-factor</td>
			<td>AGAP001464</td>
			<td>6.28</td>
			<td>5.22</td>
			<td>5.92</td>
			<td>2.99</td>
			<td>2.96</td>
			<td>3.27</td>
			<td>3.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>"</td>
			<td>TXN-factor</td>
			<td>AGAP011038</td>
			<td>4.50</td>
			<td>4.46</td>
			<td>5.23</td>
			<td>2.96</td>
			<td>2.86</td>
			<td>3.05</td>
			<td>2.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>DSX</td>
			<td>TXN-factor</td>
			<td>AGAP004050</td>
			<td>4.91</td>
			<td>5.39</td>
			<td>5.55</td>
			<td>3.72</td>
			<td>4.00</td>
			<td>4.57</td>
			<td>4.01</td>
		</tr>
<tr>
<td>FKH</td>
			<td>TXN-factor</td>
			<td>AGAP001671</td>
			<td>5.18</td>
			<td>4.67</td>
			<td>5.25</td>
			<td>2.99</td>
			<td>3.09</td>
			<td>3.21</td>
			<td>3.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>MUC2</td>
			<td>speeksel eiwit</td>
			<td>AGAP012020</td>
			<td>4.59</td>
			<td>5.53</td>
			<td>5.63</td>
			<td>2.96</td>
			<td>3.07</td>
			<td>3.08</td>
			<td>3.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rab11</td>
			<td>vesiculaire handel</td>
			<td>AGAP004559</td>
			<td>10.21</td>
			<td>7.47</td>
			<td>8.60</td>
			<td>4.90</td>
			<td>3.79</td>
			<td>3.38</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>salie</td>
			<td>TXN-factor</td>
			<td>AGAP013335</td>
			<td>5.32</td>
			<td>5.96</td>
			<td>8.89</td>
			<td>3.40</td>
			<td>3.33</td>
			<td>7.37</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Gemiddelde log2 microarray expressieprofielen voor An. Gambiae genen van belang. Getoond worden gennamen, functionele categorie, Vectorbase (AGAP) identifiers en gemiddelde log2 microarray expressie gegevens verzameld uit Vectorbase. Deze gegevens geven aan dat onze genen van belang (betrokken bij speekselklier (SG) celbiologie en secretie) worden uitgedrukt en verrijkt in larvale stadium 3 (L3) en volwassen SG's, in vergelijking met hele individuen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig1v3.jpg"> Figuur 1: f-Agdsx en fkh knockdown bij volwassen An. gambiae verlaagt het fkh mRNA-gehalte in de SG's en beïnvloedt het vrouwelijke vermogen om bloed te voeden. (A) Representatief beeld van het plasmideontwerp dat in deze methodologie wordt gebruikt voor dsRNA-productie. De tweede T7-promotorsequentie wordt aan het plasmide toegevoegd door het op te nemen in de 3'-primer die wordt gebruikt om de insert te versterken die in het pGEMT-plasmide moet worden gekloond. Het plasmide wordt vervolgens omgezet in E. coli HT115 (DE3) bacteriën en een voedingsoplossing wordt gemaakt van een suspensie van geïnduceerde warmte-gedood bacteriën in 10% suikerwater. (B) Dieren gevoed met een dsRNA-voedingsoplossing voor f-Agdsx of fkh, vertoonden significant lagere niveaus van fkh-transcripten (eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen; n = 15). Alleen de groep gevoed met fkh dsRNA (C) vertoonde echter een significant verschil in het aantal bijtpogingen dat nodig was om een bloedmaaltijd te verkrijgen. Muggen in deze groep hadden gemiddeld vijf keer zoveel indringende pogingen nodig om een succesvolle bloedmaaltijd te verkrijgen dan nodig was door de controle- of dsx-dsRNA-gevoede groepen (eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen; n = 15). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) aan. Elk experiment werd uitgevoerd in drie afzonderlijke biologische replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig2v2.jpg"> Figuur 2: fkh knockdown bij volwassen An. gambiae speekselklieren vermindert SG transcriptiefactor niveaus. Getoond worden representatieve beelden getoond van dag 13 volwassen vrouwelijke An. gambiae SG's na 8 dagen (dagen 5-13) van orale blootstelling aan ofwel (A) niet-gerelateerde dsRNA-controle (mier) of (B) dsRNA gericht op de SG TF-vorkkop (fkh, AGAP001671) in 10% sucrose gekleurd met de kleurstoffen DAPI (DNA; rood), gelabeld tarwekiem agglutinine (WGA, chitine / O-GlcNAcylatie; blauw), antisera tegen de SG TF's Salie (groen) en CrebA (paars). De getoonde lengtes van de schaalbalken zijn micron. SG's (i) zijn omlijnd met witte streepjes. Gele lijnen in ingezoomde lobafbeeldingen (van de gebieden omsloten door gele vakjes en gelabeld als "inzet") geven aan waar de lijnscans van de signaalintensiteit werden uitgevoerd. Groene en paarse kanaalintensiteiten die overeenkomen met lijnscans voor elke ingezoomde lob worden uitgezet (altijd van links naar rechts in de SG) in de grafieken onder de afbeeldingen; X-as = afstand (in pixels) en Y-as = grijze eenheid (pixelintensiteit). Het dynamisch bereik van de pixelintensiteit wordt begrensd door rode (maximum) en blauwe (minimum) stippellijnen en de bijbehorende waarden worden in elke grafiek weergegeven. MIP = maximale intensiteit 3D-projectie over de gehele SG-diepte. DL: distale laterale kwab; M: mediale kwab; PL: proximale laterale kwab; SD: speekselkanaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig3v2.jpg"> Figuur 3: fkh knockdown bij volwassen An. gambiae speekselklieren vermindert SG uitgescheiden eiwitgehalte. Getoond worden representatieve beelden getoond van dag 13 volwassen vrouwelijke An. gambiae SG's na 8 dagen (dagen 5-13) van orale blootstelling aan ofwel (A) niet-gerelateerde dsRNA-controle (mier), of (B) dsRNA gericht op de SG TF vorkkop (fkh, AGAP001671) in 10% sucrose gekleurd met de kleurstoffen DAPI (DNA; rood), gelabeld tarwekiem agglutinine (WGA, chitine / O-GlcNAcylatie; blauw), en de speekseleiwitten AAPP (groen) en Mucine (MUC2, paars). De getoonde lengtes van de schaalbalken zijn micron. SG's (i) zijn omlijnd met witte streepjes. Gele lijnen in ingezoomde lobafbeeldingen (van de gebieden omsloten door gele vakken) geven aan waar de lijnscans van de signaalintensiteit zijn uitgevoerd. Groene en paarse kanaalintensiteiten die overeenkomen met lijnscans voor elke lob worden uitgezet (altijd van links naar rechts in de SG) in de grafieken onder de afbeeldingen; X-as = afstand (in pixels) en Y-as = grijze eenheid (pixelintensiteit). Het dynamisch bereik van de pixelintensiteit wordt begrensd door rode (maximum) en blauwe (minimum) stippellijnen en de bijbehorende waarden worden in elke grafiek weergegeven. MIP = maximale intensiteit 3D-projectie over de gehele SG-diepte. DL: distale laterale kwab; M: mediale kwab; PL: proximale laterale kwab; SD: speekselkanaal. Cursieve "DL"-labels (Bi) geven twee zichtbare gebieden van dezelfde DL-kwab aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63266/63266fig4v2.jpg"> Figuur 4: fkh knockdown bij volwassen An. gambiae speekselklieren vermindert SG secretie markers. Getoond worden representatieve beelden getoond van dag 13 volwassen vrouwelijke An. gambiae SG's na 8 dagen (dagen 5-13) van orale blootstelling aan ofwel (A) niet-gerelateerde dsRNA-controle (mier), of (B) dsRNA gericht op de SG TF-vorkkop (fkh, AGAP001671) in 10% sucrose gekleurd met de kleurstoffen DAPI (DNA; rood), gelabeld tarwekiem agglutinine (WGA, chitine / O-GlcNAcylatie; blauw), Nile Red (lipiden; paars), en antisera tegen de recycling endosome vesicle marker Rab11 (groen). De getoonde lengtes van de schaalbalken zijn micron. SG's (i) zijn omlijnd met witte streepjes. Gele lijnen in ingezoomde lobafbeeldingen (van de gebieden omsloten door gele vakken) geven aan waar de lijnscans van de signaalintensiteit zijn uitgevoerd. Groene en paarse kanaalintensiteiten die overeenkomen met lijnscans voor elke lob zijn uitgezet (altijd van links naar rechts in de SG) in de grafieken onder de afbeeldingen; X-as = afstand (in pixels) en Y-as = grijze eenheid (pixelintensiteit). Het dynamisch bereik van de pixelintensiteit wordt begrensd door rode (maximum) en blauwe (minimum) stippellijnen en de bijbehorende waarden worden in elke grafiek weergegeven. MIP = maximale intensiteit 3D-projectie over de gehele SG-diepte. DL: distale laterale kwab; M: mediale kwab; PL: proximale laterale kwab; SD: speekselkanaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/63266fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend dossier 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63266/SF%20sequences%20and%20promoters.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

RNA-interferentie is een van de belangrijkste hulpmiddelen die worden gebruikt voor omgekeerde genetica bij muggen en orale toediening stelt ons in staat om gen-uitschakeling bij volwassen muggen te induceren en te behouden zonder dat micro-injectie nodig is. De orale afgifte van dubbelstrengs RNA aan volwassen muggen is een goedkope en veelzijdige RNA-interferentiemethode die het werk en de tijd en moeite om de genfunctie te bestuderen aanzienlijk vermindert. Deze methode kan worden gebruikt om niet alleen andere doelgenen in Anopheles gambiae te bestuderen, maar ook in andere interessante anopheles zoals Anopheles albinamus.Kweek om te beginnen een cultuur uit een enkele bacteriële kolonie Escherichia coli-stam HT115 (DE3) met het dubbelstrengs RNA dat plasmide tot expressie brengt in vijf milliliter lb met ampicilline en tetracycline op een platform shaker gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius en 180 RPM. Neem na 12 uur 0,5 milliliter van de 's nachts gekweekte bacteriecultuur en maak een verdunning van één op 1000 in 2X gist tryptonmedia die ampicilline en tetracycline bevatten. Om de dubbelstrengs RNA-productie te induceren, voegt u IPDG toe bij de uiteindelijke concentratie van 40 micromolair.Incubeer vervolgens de cultuur gedurende twee uur in trillende omstandigheden zoals aangetoond. Aan het einde van de incubatie, wanneer de optische dichtheid van de cultuur 0,4 bij 600 nanometer bereikt, pelleteert u de bacteriële cellen door centrificatie op 4.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en wast u de cellen vervolgens in één volume PBS. Nadat je de cellen nog een keer hebt laten draaien, resuspend de cellen in PBS en incubeer je gedurende een uur bij 70 graden Celsius.Nadat de bacteriën door hitte zijn gedood, maak je aliquots van 400 microliter volume en bewaar je ze bij 20 graden Celsius tot verder gebruik. Meng een aliquot van 400 microliter dooiwarmte gedood bacteriën die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen met 1,6 milliliter 12% suikeroplossing met 0,2% methylparaben. Week een klein watje in deze oplossing en plaats het in een kooi met vijf dagen oude muggen en zorg ervoor dat de muggen zich voeden met deze oplossing.Vervang het watje gedrenkt in dubbelstrengs RNA-suikeroplossing om de dag gedurende acht opeenvolgende dagen, zodat de kooi onder constante omstandigheden wordt gehandhaafd. Om de muggen met kou te verdoven, plaatst u de container op ijs totdat muggen stoppen met bewegen en plaatst u de muggen vervolgens op een koud oppervlak om vrouwtjes te isoleren voor dissectie. Nadat je de muggen met ethanol hebt besproeid, plaats je ze op een glazen oppervlak met PBS.Zet met een tang de muggenkop vast en trek heel langzaam aan de thorax waardoor de speekselklieren in PBS kunnen worden vrijgegeven. Zodra de speekselklieren zijn ontleed van 10 muggen, trek je de klieren voor RNA-extractie. Na voltooiing van de RNA-extractie suspensie de RNA-pellet in 30 microliter RNA-vrij water.Meet de absorptie en bereken de RNA-concentratie zoals beschreven in het teksthandschrift. Met behulp van een commerciële reverse transcriptie kit, synthetiseren cDNA uit één microgram RNA. Verdun het cDNA 10 keer en stel de RTPCR-reacties in drievoud in voor doel- en huishoudgenen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.Versterk de CDNA met standaard real-time PCR-omstandigheden. Om het vermogen om bloed te voeden te evalueren, plaatst u groepen van 15 vrouwelijke muggen die zijn behandeld met doel- en gecontroleerd dubbelstrengs RNA in kleine kooien en honger ze vier uur lang uit. Geef gedefibrilleerd goedkoop bloed aan de muggen met behulp van een circulerend waterbad ingesteld op 37 graden Celsius, glazen muggenvoeders en peryfill-membraan.Observeer, tel en registreer het aantal indringende pogingen om met succes een bloedmaaltijd van de eerste vijf vrouwtjes te verkrijgen om volledig opgezwollen te raken in elke groep. Na het isoleren van vers weefsel en PBS heeft eerder aangetoond, fixeer het in ijskoude aceton gedurende 90 seconden. Spoel het weefsel vervolgens meerdere keren in PBS en incubeer met primaire antilichamen 's nachts bij vier graden Celsius met antiserum verdund in PBS.Aan het einde van de incubatie, was het weefsel meerdere keren met PBS. Voeg fluorescerende secundaire antilichamen verdund in PBS toe en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Voeg eventuele tegenvlek 30 minuten voor het einde van de incubatietijd van twee uur toe.Was het weefsel na twee uur drie keer met PBS, monteer de weefsels vervolgens in 100% glycerol op een standaard microscoopglaasje met een afdekslip van één millimeter dik en bewaar bij 20 graden Celsius tot beeldvorming. De micro-aray-expressiegegevens toonden de expressie van alle gekozen gerichte genen in volwassen speekselklieren en de niveaus van AAPP en salie waren bijzonder hoog. Het dubbelstrengs RNA verminderde effectief de overvloed aan vorkkoptranscripten in de speekselklier.De vorkkop dubbelstrengs RNA gevoede muggen vertoonden vijf keer meer voedingspogingen dan de controlegroep of FEG dubbelstrengs dubbelstrengs RNA gevoede muggen om volledig te worden volgepropt met bloed. De niveaus van salie- en CrebA-kleuring waren aanzienlijk verminderd in alle speekselklierlobben na forkkop RNA-interferentie in vergelijking met mierencontrole-RNA-interferentie. Bij het overwegen van zeer overvloedige speekselcomponenteiwitten, waren de niveaus van AAPP verlaagd in alle drie de speekselklierlobben na forkkop RNA-interferentie in vergelijking met controle-RNA-interferentiebehandeling.Aan de andere kant werden geen veranderingen in mucinespiegels waargenomen. Deze gegevens suggereren dat vorkkop anders bijdraagt aan de expressie van verschillende speekseleiwitgenen. Verminderde Rab11-fluorescentie werd waargenomen in distale laterale kwabben na behandeling met vorkkop-RNA-interferentie, maar er trad ook een verhoogd Rab11-signaal in de mediale en proximale laterale kwabben op.Er werd geen waarneembaar verschil waargenomen in het Nijlrood-signaal na vorkkop-RNA-interferentie in vergelijking met de controle-RNA-interferentiebehandeling. sommige secretaressemachine reageren op een complexe manier die verschilt tussen speekselklierkwabben. Deze techniek zou onderzoekers in staat kunnen stellen om genen te de mond te snoeren waarvoor expressie kan worden verminderd door een enkele injectie van dubbelstrengs RNA en om orale afgifte van dubbelstrengs RNA te onderzoeken om RNAi te gebruiken als een potentiële vectorcontrolemethode.

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protocol voor RNAi Testen in volwassen muggen (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

Bouwen aan een betere Mosquito: Het identificeren van de genen Enabling malaria en knokkelkoorts verzet in A. gambiae en A. aegypti muggen

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Bacteriële Levering van RNAi effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo&#39;s

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-gemedieerde Gene Knockdown en<em&gt; In Vivo</em&gt; Urineproductie Assay in het volwassenenonderwijs Vrouw<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Muggen

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larvale RNA interferentie in de Rode Bloem Kever,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: een open source data-integratie tool voor Big Data transcriptomics ontworpen voor de malaria vector Anopheles gambiae

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...