Name: effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes
Uploaded: 2022-03-01T13:00:00
Duration: 7 min 48 s
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लेखकों को कीट विज्ञान शाखा और सीडीसी में परजीवी रोगों और मलेरिया के प्रभाग के भीतर कर्मचारियों और वैज्ञानिकों को धन्यवाद देना चाहते हैं, और ब्रायन ट्रिग और मिशेल चिउ जेएचयू में बैक्टीरिया की तैयारी और / या इस काम की सहायक चर्चाओं के साथ सहायता के लिए। हम जेएचएमआरआई कीटरी और प्रबंधक क्रिस किजिटो को एन गाम्बियाई मच्छरों तक पहुंचने और पालने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम इस अध्ययन में उपयोग के लिए प्लास्मिड PJet GFP और pPB47 GFP प्राप्त करने में सहायता के लिए वेई हुआंग (JHSPH) को धन्यवाद देते हैं। इस काम के लिए धन द्वारा प्रदान किया गया था: एनआईएच R21AI153588 (DJA के लिए), एक जॉन्स हॉपकिन्स मलेरिया रिसर्च इंस्टीट्यूट पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप (मेगावाट के लिए); और गुड वेंचर्स फाउंडेशन और ओपन परोपकार परियोजना से सीडीसी फाउंडेशन को अनुदान द्वारा मलेरिया के लिए अनुसंधान में सहायता के लिए मच्छरों में महिला विकास का समर्थन क्रायोप्रिजर्वेशन और दमन, ओपन परोपकार परियोजना, 2017 शीर्षक दिया गया है। हम गहराई से JHU माइक्रोस्कोप सुविधा कर्मचारियों से सहायता और उपयोग किए गए माइक्रोस्कोप के लिए लागू एनआईएच अनुदान समर्थन की सराहना करते हैं (एनआईएच ग्रांट #: S10OD016374)। इस पांडुलिपि में निष्कर्ष और निष्कर्ष लेखकों के हैं और जरूरी नहीं कि सीडीसी के विचारों का प्रतिनिधित्व करें। व्यापार नामों का उपयोग केवल पहचान के लिए है और इसका मतलब रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र, सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा, या अमेरिकी स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग द्वारा समर्थन नहीं है।

लेखकों की रिपोर्ट है कि उनके पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

मौखिक भोजन द्वारा एक गाम्बियाई मच्छरों को प्रभावी ढंग से डीएसआरएनए वितरित करने की क्षमता प्रयोगशाला और क्षेत्र दोनों में वेक्टर जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए व्यापक निहितार्थ है। माइक्रोइंजेक्शन को लंबे समय से रसायनों, एंटीबॉडी, आरएनएआई और मच्छरों में आनुवंशिक संशोधन रणनीतियों के वितरण के पसंदीदा मोड के रूप में स्वीकार किया गया है 43,44। पर्याप्त शारीरिक हेरफेर, सेलुलर क्षति और तनाव के परिणाम को मौखिक वितरण के उपयोग से टाला जा सकता है, जो बड़े पैमाने पर या क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए संभावित रूप से उपयुक्त हो सकता है। पिछले काम ने सुझाव दिया है कि आरएनएआई एक व्यक्तिगत वयस्क मच्छर29 के भीतर सर्वव्यापी रूप से कार्य करता है, जिससे लार ग्रंथियों सहित सभी ऊतकों में प्रभाव पड़ता है। बड़ी संख्या में डीएसआरएनए-व्यक्त ई कोलाई के साथ मच्छरों को खिलाकर जो एक लंबी समय सीमा में अतुल्यकालिक रूप से पच जाते हैं, कोई संभावित रूप से पिंजरे में सभी व्यक्तियों में आरएनएआई के लिए सुसंगत और समान जोखिम प्राप्त कर सकता है। यह विधि बड़ी संख्या में मच्छरों को खिलाने और लक्ष्य जीन के आधार पर परिणामी फेनोटाइप की संभावित परिवर्तनशीलता का विश्लेषण करने की अनुमति देती है। हालांकि, एक महत्वपूर्ण विचार बैक्टीरिया के विषम वितरण की संभावना है, और इसलिए कपास फाइबर में डीएसआरएनए। मच्छर चीनी-फीडिंग के लिए दैनिक रूप से उपयोग किए जाने वाले बैक्टीरिया के 400 μL में लगभग ≤4.6 μg dsRNA होगा, जैसा कि पहले वर्णित और गणना की गईथी 9 लेकिन प्रत्येक मच्छर द्वारा निगला गया dsRNA की मात्रा व्यक्तिगत रूप से निर्धारित नहीं की गई थी। यदि dsRNA निर्माण नियमित हो जाता है, तो यह सरल उपचार प्रोटोकॉल किसी भी मच्छर शोधकर्ता द्वारा इस तकनीक के तेजी से आत्मसात करने की अनुमति देता है। एक प्राथमिकता, उपचार के दौरान समय व्यय (प्रति दिन 30 मिनट) सीखने और समान नमूना आकारों के लिए माइक्रोइंजेक्शन लागू करने में लगने वाले समय की तुलना में तुच्छ है।
डीएसआरएनए को खिलाने का उपयोग नियमित रूप से मॉडल जीव Caenorhabditis elegans45 में रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययन के लिए किया जाता है। उपयोग का यह भारी स्तर मौखिक वितरण दृष्टिकोण के मूल्य को रेखांकित करता है। परिवर्तित ई कोलाई में एक ए. गाम्बिया जीनोम-वाइड लाइब्रेरी का निर्माण, जो सी. एलिगेंस46,47 में मौजूद है, के समान, बढ़े हुए पैमाने पर मच्छरों में तेजी से रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीनिंग की अनुमति देगा। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विधि की दक्षता प्रतिलेख के अंतर्जात स्तरों पर बहुत अधिक निर्भर करती है और यदि अभिव्यक्ति लक्ष्य ऊतक तक सीमित नहीं है, लेकिन अधिक व्यापक रूप से4,8,44 व्यक्त की गई है। इसके अतिरिक्त, इस बात के सबूत हैं कि कुछ कीटनाशक मच्छरों से व्यवहारिक परिहार को प्रेरित कर सकते हैं48, और बैक्टीरिया के साथ खिलाना जो संभावित रूप से उनमें प्रतिकूल प्रभाव पैदा करते हैं, परिहार के समान पैटर्न को ट्रिगर कर सकते हैं। प्रयोगशाला की नियंत्रित सेटिंग में, जहां मच्छरों के पास एक वैकल्पिक खाद्य स्रोत नहीं था, उनके पास ई कोलाई के साथ चीनी पानी से बचने का विकल्प नहीं था और एक पौष्टिक स्रोत की आवश्यकता शायद बैक्टीरिया से बचने के लिए वृत्ति को ओवरराइड करेगी। हालांकि, इस पर विचार किया जाना चाहिए यदि रणनीति का उपयोग कम नियंत्रित सेटिंग्स में किया जाना था।
एक साथ कई जीनों को लक्षित करना संभव हो सकता है (एक निर्माण, कई निर्माणों, या परिवर्तित जीवाणु आइसोलेट्स के मिश्रण का उपयोग करके), लेकिन प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है। इस बिंदु के लिए एक और महत्वपूर्ण विचार एकल या एकाधिक लक्ष्यों का उपयोग करते समय संभावित ऑफ-टारगेट या सहक्रियात्मक प्रभावों का मूल्यांकन है। उपयुक्त नियंत्रण जीन और समूहों की स्थापना प्रयोगात्मक डिजाइन का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है। इसके अलावा, यह अनुमान लगाने के लिए मोहक है कि इस दृष्टिकोण का उपयोग अन्य रोगजनकों या वायरस को लक्षित करने के लिए किया जा सकताहै। मच्छरों में आरएनएआई प्रेरण की ओर पिछला काम उन परिस्थितियों में किया गया था जहां अभिकर्मक को सीधे इंजेक्ट किया गया था, इसलिए ई कोलाई मौजूद नहीं थे। ई कोलाई एक सुरक्षात्मक डिब्बे प्रदान कर सकता है जो समय के साथ डीएसआरएनए की धीमी रिहाई के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करता है कि एक्सपोजर बहुत लंबी अवधिमें कम या ज्यादा निरंतर है।
अंत में, इन परिणामों से पता चलता है कि इस तकनीक के प्रभाव एक्सपोजर के समय सीमा (लंबाई और शुरुआती दिन) और उपयोग किए जाने वाले ई कोलाई की मात्रा को समायोजित करके ट्यूनेबल हैं। इस सुविधा ने हमें परीक्षण और त्रुटि द्वारा इष्टतम नॉकडाउन स्थितियों की पहचान करके आवश्यक जीन (डीएसएक्स और एफकेएच) के कार्यों का अध्ययन करने की अनुमति दी। यह इस संभावना को बहुत बढ़ाता है कि इस तकनीक का उपयोग करके ब्याज के लक्षित जीन की जांच की जा सकती है।
संक्षेप में, यह पाया गया कि वयस्क मच्छरों के लिए आरएनएआई का मौखिक वितरण सरल, बहुमुखी और मच्छर जीन समारोह का अध्ययन करने और मच्छर जनित बीमारियों के वेक्टर नियंत्रण के लिए उपन्यास और निंदनीय उपकरणों के निर्माण के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण हो सकता है।

मच्छरों द्वारा कई बीमारियां फैलती हैं, जिससे मच्छर शरीर विज्ञान और आनुवंशिकी का अध्ययन एक महत्वपूर्ण उपक्रम बन जाता है। इन जीवों में आरएनएआई का उपयोग पिछले 20 वर्षों में प्रमुख रहा है और कई मच्छर जीनों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी गई है 1,2,3,4,5। DSRNA वितरण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक माइक्रोइंजेक्शन रही है, जिसमें कमियां हैं कि यह मच्छरों को घायल कर सकती है और इसके लिए महत्वपूर्ण समय और प्रयास की आवश्यकता होती है। आरएनएआई के लिए मौखिक वितरण विधियों का परीक्षण किया गया है, लेकिन मुख्य रूप से मच्छरों के लार्वा चरण में 6,7,8,9। वयस्क मच्छरों में dsRNA के मौखिक वितरण का पूरी तरह से पता नहीं लगाया गया है और वेक्टर जीव विज्ञान और वेक्टर नियंत्रण के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।
मलेरिया एनोफिलीज मच्छरों द्वारा प्रेषित किया जाता है जब एक संक्रमित मादा मच्छर एक असंक्रमित मेजबान से रक्त भोजन लेती है और मलेरिया परजीवीयुक्त लार इंजेक्ट करती है। अंततः एक मच्छर की लार में प्रेषित होने के लिए, परजीवी को कई बाधाओं को दूर करना चाहिए, जिसमें मच्छर प्रतिरक्षा प्रणाली से बचना, मिडगट बाधा का ट्रैवर्सल, और लार ग्रंथियों का आक्रमणशामिल है। मच्छर लार ग्रंथि (एसजी) वास्तुकला परजीवी आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण है और यह वास्तुकला प्रमुख लार ग्रंथि-व्यक्त प्रतिलेखन कारकों के साथ-साथ यौन द्विरूपता के निर्धारकों दोनों द्वारा नियंत्रित की जाती है। लार ग्रंथियों के सेलुलर विनिर्देश और होमोस्टेटिक रखरखाव के लिए और लार प्रोटीन के उत्पादन और स्राव के लिए कई अत्यधिक संरक्षित प्रतिलेखन कारकों की आवश्यकता होती है जो रक्त-आहार 12,13,14 में कार्य करते हैं। फोर्क हेड (एफकेएच) एक पंखों वाला हेलिक्स प्रतिलेखन कारक है जो कीट एसजी संरचना और कार्य के एक प्रमुख नियामक के रूप में कार्य करता है (फल मक्खियों और रेशम कीट कीट में अध्ययन के आधार पर)15,16,17,18,19,20। ड्रोसोफिला एसजी में, एफकेएच ऋषि के साथ कार्य करता है, एक एसजी-विशिष्ट बुनियादी हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (बीएचएलएच) प्रतिलेखन कारक, एसजी अस्तित्व और लार उत्पादन को बढ़ावा देनेके लिए 19। ड्रोसोफिला में लार उत्पादन का एक महत्वपूर्ण, सकारात्मक सह-नियामक क्रेबा है, जो एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया ल्यूसीन जिपर ट्रांसक्रिप्शन कारक है जो स्रावी मार्ग जीन21,22,23 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। मादा लार ग्रंथियों में रूपात्मक भेदभाव की एक मजबूत डिग्री भी है जो संभवतः एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है, न केवल रक्त-भोजन में, बल्कि इस ऊतकपर आक्रमण करने के लिए परजीवियों की क्षमता में भी।
लार ग्रंथि अस्तित्व, संरचना, शरीर विज्ञान, और यौन द्विरूपता को निर्धारित करने में शामिल जीनों में से कई में जटिल स्पैटिओटेम्पोरल अभिव्यक्ति प्रोफाइल 25,26,27 है, और आरएनएआई को प्रेरित करने के लिए डीएसआरएनए के पारंपरिक वितरण के तरीके हमेशा इस या अन्य ऊतकों में इन प्रकार के जीनों को लक्षित करने में कुशल नहीं होते हैं। हालांकि, लार्वा चरण एडीज एजिप्टी और एन गैम्बियाई मच्छरों में डीएसआरएनए के मौखिक वितरण का उपयोग डीएसएक्स जीन 9,28 के मादा-विशिष्ट रूप को चुप करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। मच्छर लार ग्रंथियों में dsRNA का उपयोग करके पिछले अध्ययनों में पाया गया कि, हालांकि बड़ी मात्रा में dsRNA की आवश्यकता थी, मौन प्रभाव अपेक्षाकृत लंबे समय तक चलने वाला था (कम से कम 13 दिन)29। यहां, वयस्क मादा मच्छरों में इन जीनों के आरएनएआई को शांत करने के लिए डीएसएक्स, एफकेएच, या क्रेबा के लिए अनुक्रम-विशिष्ट डीएसआरएनए व्यक्त करने वाले गर्मी से मारे गए ई कोलाई स्ट्रेन एचटी 115 (डीई 3) की क्षमता का परीक्षण किया गया था। DSRNA प्रेरित जीन नॉकडाउन का मौखिक प्रशासन An. gambiae में, mRNA के स्तर में स्पष्ट कटौती के साथ और इन जीनों के नुकसान के कार्य के अनुरूप फेनोटाइप के साथ। इस प्रकार, यह दृष्टिकोण संभवतः विभिन्न प्रकार के लार ग्रंथि जीन के कार्य को खटखटाने के लिए काम करेगा।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0440-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAPP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuStart II PCR Supermix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95137-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anopheles gambiae G3</td>
			<td>BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</td>
			<td>MRA-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>P022628181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrebA</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>CrebA Rbt-PC</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damiens diet</td>
			<td>BioServ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DSB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115 (DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JM109 Competent cells</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10855001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 2</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Muc2; 27 675-1-AP</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (mouse).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Lipid dye; 1:50 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEMT easy</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR-green PCR master MIX</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaStudio 6</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio6 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab11</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-WGA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sage</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>87128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC 
			CGGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes

आरएनए हस्तक्षेप दो दशकों के लिए रिवर्स आनुवंशिक विश्लेषण के लिए एक भारी उपयोग किया जाने वाला उपकरण रहा है। वयस्क मच्छरों में, डबल-फंसे हुए आरएनए (डीएसआरएनए) प्रशासन को मुख्य रूप से इंजेक्शन के माध्यम से पूरा किया गया है, जिसके लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता होती है और क्षेत्र अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यहां हम वयस्क एनोफिल्स गाम्बिया को डीएसआरएनए के मौखिक वितरण द्वारा आरएनएआई के मजबूत सक्रियण के लिए एक अधिक कुशल विधि प्रस्तुत करते हैं। लंबे dsRNAs Escherichia कोलाई तनाव HT115 (DE3) में उत्पादित किया गया था, और 10% सुक्रोज में गर्मी से मारे गए dsRNA युक्त बैक्टीरिया का एक केंद्रित निलंबन कपास गेंदों पर वयस्क मच्छरों के लिए विज्ञापन-libitum की पेशकश की गई थी। कपास की गेंदों को उपचार की अवधि के लिए हर 2 दिनों में बदल दिया गया था। डबल्सेक्स (सेक्स भेदभाव में शामिल एक जीन) या कांटा सिर (जो लार ग्रंथि प्रतिलेखन कारक को एन्कोड करता है) को लक्षित करने के लिए इस विधि का उपयोग करने के परिणामस्वरूप क्रमशः मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) या प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है, जैसा कि क्रमशः मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) या प्रतिदीप्ति कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मापा जाता है। लार ग्रंथि आकृति विज्ञान में दोष भी देखे गए थे। यह अत्यधिक लचीला, उपयोगकर्ता के अनुकूल, कम लागत, dsRNA वितरण के समय-कुशल तरीका मोटे तौर पर कीट वेक्टर फिजियोलॉजी और उससे परे के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य जीन पर लागू हो सकता है।

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Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित डीएसआरएनए का मौखिक प्रशासन, आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के लिए एक वितरण विधि जो नियमित रूप से केनोरहाबिडिटिस एलिगेंस में उपयोग की जाती है, यहां वयस्क मच्छरों पर सफलतापूर्वक लागू की गई थी। हमारी विधि इंजेक्शन के उपयोग के बिना मजबूत रिवर्स जेनेटिक्स अध्ययन और संचरण-अवरुद्ध वेक्टर अध्ययन के लिए अनुमति देती है।

प्रभावी मौखिक आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) वयस्क एनोफिलीज़ गाम्बिया मच्छरों के लिए प्रशासन

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

आरएनए हस्तक्षेप मच्छरों में रिवर्स आनुवांशिकी के लिए उपयोग किए जाने वाले मुख्य उपकरणों में से एक है और मौखिक प्रसव हमें माइक्रो इंजेक्शन की आवश्यकता के बिना वयस्क मच्छरों में जीन को शांत करने और बनाए रखने की अनुमति देता है। वयस्क मच्छरों के लिए डबल स्ट्रैंड आरएनए का मौखिक वितरण एक कम लागत और बहुमुखी आरएनए हस्तक्षेप विधि है जो जीन फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए काम और समय और प्रयास को काफी कम कर देता है। इस विधि का उपयोग न केवल एनोफिलीज़ गाम्बिया में अन्य लक्ष्य जीनों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि एनोफिलीज़ अल्बिनामस जैसे ब्याज के एक और एनोफिल में भी किया जा सकता है।शुरू करने के लिए, Escherichia कोलाई तनाव HT115 (DE3) के एक एकल जीवाणु कॉलोनी से एक संस्कृति विकसित करें जिसमें डबल फंसे हुए आरएनए 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर 12 घंटे के लिए एक प्लेटफ़ॉर्म शेकर पर एम्पीसिलिन और टेट्रासाइक्लिन युक्त एलबी के पांच मिलीलीटर में प्लास्मिड व्यक्त करते हैं। 12 घंटे के बाद, रात भर उगाए गए जीवाणु संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर लें और एम्पिसिलिन और टेट्रासाइक्लिन युक्त 2एक्स खमीर ट्रिपटोन मीडिया में 1000 कमजोर पड़ने में से एक बनाएं। डबल फंसे हुए आरएनए उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, 40 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता पर आईपीडीजी जोड़ें।फिर दो घंटे के लिए संस्कृति को हिलाने की स्थिति में इनक्यूबेट करें जैसा कि दिखाया गया है। इनक्यूबेशन के अंत में जब संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व 600 नैनोमीटर पर 0.4 तक पहुंच जाता है, तो चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4, 000 बार जी पर सेंट्रीफिकेशन द्वारा जीवाणु कोशिकाओं को गोली मारें और फिर पीबीएस की एक मात्रा में कोशिकाओं को धोएं। कोशिकाओं को एक और बार कताई करने के बाद, पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और एक घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।बैक्टीरिया को मारने वाली गर्मी के बाद, 400 माइक्रोलीटर वॉल्यूम के ऐलीकोट बनाएं और उन्हें आगे के उपयोग तक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। पिघलने वाली गर्मी के एक 400 माइक्रोलीटर एलीकोट को मिलाएं, जो 0.2% मिथाइलपैराबेन युक्त 12% चीनी समाधान के 1.6 मिलीलीटर के साथ डबल फंसे हुए आरएनए को व्यक्त करते हुए बैक्टीरिया को मार दिया। इस घोल में एक छोटी सी कपास की गेंद को भिगोएं और इसे पांच दिन पुराने मच्छरों वाले पिंजरे के अंदर रखें और सुनिश्चित करें कि मच्छर इस समाधान पर फ़ीड करें।लगातार आठ दिनों के लिए हर दूसरे दिन डबल फंसे हुए आरएनए चीनी समाधान में भिगोई गई कपास की गेंद को बदलें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पिंजरे को निरंतर परिस्थितियों में बनाए रखा जाए। ठंड के साथ मच्छरों को बेहोश करने के लिए, कंटेनर को बर्फ पर रखें जब तक कि मच्छर हिलना बंद न कर दें, और फिर विच्छेदन के लिए मादाओं को अलग करने के लिए मच्छरों को ठंडी सतह पर रखें। इथेनॉल के साथ मच्छरों का छिड़काव करने के बाद, उन्हें पीबीएस के साथ एक कांच की सतह पर रखें।संदंश की एक जोड़ी के साथ, मच्छर के सिर को सुरक्षित करें और लार ग्रंथियों को पीबीएस में जारी करने की अनुमति देते हुए वक्ष को बहुत धीरे-धीरे खींचें। एक बार लार ग्रंथियों को 10 मच्छरों से विच्छेदित करने के बाद, आरएनए निष्कर्षण के लिए ग्रंथियों को खींचें। आरएनए निष्कर्षण के पूरा होने पर, आरएनए मुक्त पानी के 30 माइक्रोलीटर में आरएनए गोली को निलंबित करें।अवशोषण को मापें और पाठ पांडुलिपि में वर्णित आरएनए एकाग्रता की गणना करें। एक वाणिज्यिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके, आरएनए के एक माइक्रोग्राम से सीडीएनए को संश्लेषित करें। सीडीएनए को 10 बार पतला करें और निर्माता की सिफारिशों के अनुसार लक्ष्य और हाउसकीपिंग जीन के लिए तीन प्रतियों में आरटीपीसीआर प्रतिक्रियाओं को स्थापित करें।मानक वास्तविक समय पीसीआर स्थितियों के साथ CDNA को बढ़ाना। रक्त फ़ीड करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, लक्ष्य के साथ इलाज किए गए 15 मादा मच्छरों के समूहों को रखें और छोटे पिंजरों में डबल फंसे हुए आरएनए को नियंत्रित करें और उन्हें चार घंटे तक भूखा रखें। 37 डिग्री सेल्सियस, ग्लास मच्छर फीडर और पेरिफिल झिल्ली के लिए सेट एक परिसंचारी पानी स्नान का उपयोग कर मच्छरों को defibrillated सस्ता रक्त प्रदान करें।प्रत्येक समूह में पूरी तरह से engorged बनने के लिए पहली पांच महिलाओं से सफलतापूर्वक एक रक्त भोजन प्राप्त करने के लिए जांच प्रयासों की संख्या का निरीक्षण, गणना और रिकॉर्ड करें। ताजा ऊतक और पीबीएस को अलग करने के बाद पहले प्रदर्शन किया गया है, इसे 90 सेकंड के लिए बर्फ के ठंडे एसीटोन में ठीक करें। फिर पीबीएस में ऊतक को कई बार कुल्ला करें और पीबीएस में पतला एंटी-सीरम के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के अंत में, पीबीएस के साथ ऊतक को कई बार धोएं। पीबीएस में पतला फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें, और दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन दो घंटे के अंत से 30 मिनट पहले किसी भी काउंटर दाग जोड़ें।दो घंटे के बाद, पीबीएस के साथ ऊतक को तीन बार धोएं, फिर एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक मिलीमीटर मोटी कवर स्लिप के साथ 100% ग्लिसरॉल में ऊतकों को माउंट करें और इमेजिंग तक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। माइक्रो एरे अभिव्यक्ति डेटा ने वयस्क लार ग्रंथियों में सभी चुने गए लक्षित जीनों की अभिव्यक्ति को दिखाया और एएपीपी और ऋषि के स्तर विशेष रूप से उच्च थे। डबल फंसे हुए आरएनए ने लार ग्रंथि में कांटा सिर टेपों की बहुतायत को प्रभावी ढंग से कम कर दिया।कांटा सिर डबल फंसे हुए आरएनए खिलाए गए मच्छरों ने नियंत्रण समूह या एफईजी डबल सेक्स डबल फंसे हुए आरएनए फीड किए गए मच्छरों की तुलना में पांच गुना अधिक खिलाने के प्रयासों का प्रदर्शन किया ताकि रक्त के साथ पूरी तरह से संक्रमित किया जा सके। चींटी नियंत्रण आरएनए हस्तक्षेप की तुलना में कांटा सिर आरएनए हस्तक्षेप के बाद सभी लार ग्रंथि लोब में ऋषि और क्रेबा धुंधला होने के स्तर को स्पष्ट रूप से कम कर दिया गया था। अत्यधिक प्रचुर मात्रा में लार घटक प्रोटीन पर विचार करते समय, नियंत्रण आरएनए हस्तक्षेप उपचार की तुलना में कांटा सिर आरएनए हस्तक्षेप के बाद सभी तीन लार ग्रंथि लोब में एएपीपी के स्तर को कम कर दिया गया था।दूसरी ओर, म्यूसिन के स्तर में कोई बदलाव नहीं देखा गया था। इन आंकड़ों से पता चलता है कि कांटा सिर विभिन्न लार प्रोटीन जीन की अभिव्यक्ति में अलग-अलग योगदान देता है। कम Rab11 प्रतिदीप्ति कांटा सिर आरएनए हस्तक्षेप उपचार के बाद डिस्टल पार्श्व लोब में देखा गया था, हालांकि, औसत दर्जे का और समीपस्थ पार्श्व लोब में Rab11 संकेत में वृद्धि भी हुई।नियंत्रण आरएनए हस्तक्षेप उपचार की तुलना में कांटा सिर आरएनए हस्तक्षेप के बाद नील लाल संकेत में कोई स्पष्ट अंतर नहीं देखा गया था। कुछ सचिव मशीन प्रतिक्रिया एक जटिल तरीके से जो लार ग्रंथि लोब के बीच भिन्न होती है। यह तकनीक शोधकर्ताओं को जीन को चुप करने की अनुमति दे सकती है जिसके लिए अभिव्यक्ति को डबल स्ट्रैंड आरएनए के एक इंजेक्शन द्वारा कम किया जा सकता है और संभावित वेक्टर नियंत्रण विधि के रूप में आरएनएआई का उपयोग करने के लिए डबल स्ट्रैंड आरएनए के मौखिक वितरण का पता लगाने के लिए।

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

वयस्क मच्छरों (ए gambiae) में आरएनएआई Assays के लिए प्रोटोकॉल

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

बिल्डिंग एक बेहतर मच्छर: ए gambiae और ए aegypti मच्छरों में मलेरिया और डेंगू बुखार प्रतिरोध सक्रिय जीन की पहचान

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

आरएनएआई effectors के बैक्टीरियल डिलिवरी: Transkingdom आरएनएआई

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

DsRNA इंजेक्शन द्वारा हस्तक्षेप आरएनएआई में ड्रोसोफिला भ्रूण

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

आरएनएआई की मध्यस्थता जीन मारकर गिरा दिया और<em&gt; Vivo में</emवयस्क महिला में diuresis परख<em&gt; एडीज aegypti</em&gt; मच्छरों

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

लाल आटा बीटल में लार्वा आरएनए हस्तक्षेप,<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

में आरएनएआई उत्प्रेरक प्रसव<em&gt; एनोफ़ेलीज़ gambiae</em&gt; Pupae

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

आरएनए हस्तक्षेप के व्यावहारिक उपयोग: तिलचट्टे के लिए Liposome वाहक में डबल कतरा आरएनए के मौखिक वितरण

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

आईआर-टीएक्स: मलेरिया वेक्टर एनोफेल्स गैम्बिया के लिए डिज़ाइन किए गए बिग डेटा ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए एक ओपन सोर्स डेटा इंटीग्रेशन टूल

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

एंटीबायोटिक-इलाज मच्छरों के साथ एक बैक्टीरियल ओरल फीडिंग परख

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...