Name: effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes
Uploaded: 2022-03-01T13:00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников и ученых в Отделе энтомологии и Отдела паразитарных заболеваний и малярии в CDC, а также Брайана Тригга и Мишель Чиу за помощь в подготовке бактерий в JHU и / или полезные обсуждения этой работы. Мы благодарим JHMRI Insectary и менеджера Криса Кизито за доступ к комарам An. gambiae и их выращивание . Мы благодарим Wei Huang (JHSPH) за помощь в получении плазмид PJet GFP и pPB47 GFP для использования в этом исследовании. Финансирование этой работы было предоставлено: NIH R21AI153588 (для DJA), постдокторской стипендией Научно-исследовательского института малярии Джона Хопкинса (для MW); и грантом Фонда Good Ventures и Открытого благотворительного проекта Фонду CDC под названием «Поддержка криоконсервации и подавления развития женщин у комаров» для содействия исследованиям малярии, Open Philanthropy Project, 2017. Мы высоко ценим помощь со стороны сотрудников JHU Microscope Facility и соответствующую грантовую поддержку NIH для используемого микроскопа (NIH Grant #: S10OD016374). Выводы и заключения в этой рукописи принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения CDC. Использование торговых наименований предназначено только для идентификации и не подразумевает одобрения со стороны Центров по контролю и профилактике заболеваний, Службы общественного здравоохранения или Министерства здравоохранения и социальных служб США.

1. Клонирование дцРНК в вектор экспрессии E. coli
<ol><li>Выберите последовательность генов-мишеней для вставки в соответствующий вектор для экспрессии дцРНК. Извлеките значения выражений из Vectorbase.org с помощью следующего метода.<ol>
<li>Поиск интересующего гена (например, таблица 1) в поле поиска на главной странице.</li>
		<li>На странице полученного гена перейдите к 8. Раздел транскриптомики .</li>
		<li>Ищите перечисленные соответствующие эксперименты по экспрессии генов RNA-seq и микрочипов.</li>
		<li>Транскрибируйте интересующие значения в программное обеспечение для работы с электронными таблицами и создайте таблицу данных.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Выберите коммерчески доступную плазмиду с по крайней мере одним промотором T7 для использования. Если выбранная плазмида имеет только один промотор Т7 (как это делает большинство коммерческих плазмид), включите второй промотор Т7 в обратный праймер, который будет использоваться для амплификации дцДНК для интересующего гена. ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность дцРНК для генов-мишеней может быть выбрана с помощью веб-приложения E-RNAi для проектирования реагентовRNAi 30. Либо длинная дцРНК (приблизительно 400 bp), либо короткая дцРНК (шРНК) могут быть разработаны на основе конкретных последовательностей генов. Эти последовательности должны быть усилены и секвенированы для подтверждения личности перед клонированием. Выбранные области генов, плазмиды и промоторы, используемые в этом исследовании, перечислены в дополнительном файле 1.</li>
	<li>Выполните клонирование в соответствии с простой одноэтапной процедурой, описанной ранее 9,31. Для этого очищают продукт ПЦР и связывают с линеаризованной плазмидной ДНК. Используют продукт лигирования для теплового шокового превращения компетентных клеток E. coli 32. Выделите преобразованные ячейки с помощью сине-белого экрана. Подтвердите ориентацию вкладыша с помощью Т7-праймерной ПЦР и подтвердите последовательность с помощью праймеров М13. ПРИМЕЧАНИЕ: Белые/синие скрининги могут быть использованы, когда плазмида, выбранная для трансформации, несет ген lacZ, который кодирует β-галактозидазу. Белые колонии должны содержать желаемую вставку внутри lacZ и могут быть выбраны для дальнейшего подтверждения наличия и ориентации целевой последовательности33.</li>
	<li>Очистите плазмиду от первого превращения и используйте ее для преобразования компетентной E. coli HT115 (DE3), как описано ранее34. После подтверждения того, что плазмида со вставкой присутствует в компетентной кишечной палочке HT115 (DE3), делают глицериновые запасы бактерий для одноразового применения. ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующая неродственная контрольная дцРНК должна быть приобретена или подготовлена к использованию в каждом эксперименте. В этом случае используется последовательность для неродственного гена aintegumenta (муравья) от Arabidopsis thaliana .</li>
</ol>2. Получение термоубильных бактерий, экспрессирующих дцРНК
<ol><li>Вырастите культуру из одной бактериальной колонии штамма E. coli HT115 (DE3), содержащей дцРНК-экспрессирующую плазмиду в 50 мл бульона Лурия (LB), содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 12,5 мкг/мл тетрациклина, на платформе шейкера (180 об/мин) при 37 °C в течение 12 ч.</li>
	<li>Разбавьте бактериальную культуру (1:1000) в 2x дрожжевую триптоновую (2x YT) среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 12,5 мкг/мл тетрациклина.</li>
	<li>Индуцируют продукцию дцРНК путем добавления 40 мкМ (конечная концентрация) изопропила β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG).</li>
	<li>Когда клетки достигнут O.D.600 = 0,4 , примерно через 2 ч индукции при 37 °C с перемешиванием при 180 об/мин, готовят концентрированную суспензию термоубильных бактерий, как описано Taracena et al 9. Гранулируйте клетки центрифугированием (4000 х г, 4 °C, 10 мин) и промывайте клетки в одном объеме фосфатно-натриевого буфера (PBS).</li>
	<li>Снова вращайте в тех же условиях, повторно приостанавливайте в PBS до 1/100 от исходного объема и размещайте при 70 °C в течение 1 ч.</li>
	<li>Сделайте 400 мкл аликвот термоубитных бактерий и храните эти аликвоты при -20 °C до дальнейшего использования (не храните более недели). Эта суспензия термоубильных бактерий содержит специфическую дцРНК для экспериментов RNAi. Проводят эту процедуру как для гена-мишени дцРНК-бактерий, так и для неродственного дцРНК-контроля, который будет использоваться в каждом эксперименте.</li>
</ol>3. Кормление комаров термоубийственными бактериями, экспрессирующими дцРНК
<ol><li>Разморозить одну аликвоту дцРНК (суспензия бактерий HT115 (DE3)) и смешать с 1,6 мл 12% раствора сахара, содержащего 0,2% метилпарабена.</li>
	<li>Замочите небольшой ватный тампон в этом растворе и поместите пропитанный ватный тампон в клетку, содержащую 5-дневных комаров. Убедитесь, что комары питаются этим раствором, одновременно подбирая как сахар, так и дцРНК-содержащие бактерии.</li>
	<li>Менять ватный тампон, смоченный в растворе дцРНК-сахара, через день в течение 8 дней подряд.</li>
	<li>Держите клетки от комаров в постоянных условиях, т.е. 27 °C и 80% относительной влажности при фотопериоде 12 ч:12 ч света: темный фотоцикл, разделенный 30-минутным рассветом и 30-минутным периодом сумерек.</li>
</ol>4. Анализ уровней экспрессии генов-мишеней
<ol><li>Холодный обезболивает комаров, помещая контейнер на лед на минуту или до тех пор, пока комары не перестанут двигаться. Как только комары будут обезболены, поместите их на холодную поверхность, чтобы изолировать самок для рассечения.</li>
	<li>Распылите 70% этанола на комаров и поместите их на стеклянную поверхность с PBS. С помощью пары щипцов закрепите голову комара устойчиво и очень медленно потяните грудную клетку, позволяя слюнным железам высвобождаться в PBS.</li>
	<li>Держите слюнные железы в ледяном PBS до тех пор, пока 10 особей не будут рассечены. Пул десять SGs для экстракции РНК с использованием метода гуанидиниум тиоцианат-фенол-хлороформ. Суспендировать гранулу РНК в 30 мкл воды, не содержащей РНКазы.</li>
	<li>Используйте 1 мкл аликвоты РНК, извлеченной из SG на предыдущем этапе, чтобы считывать абсорбцию при 260 и 280 нм и рассчитывать концентрацию РНК в каждом образце путем умножения на коэффициент разбавления. Соотношение 260/280 ~ 2,0 указывает на хорошее качество РНК.</li>
	<li>Используйте 1 мкг очищенной РНК для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) с использованием коммерческого набора обратной транскрипции.</li>
	<li>Сделайте разбавление кДНК 1:10 для получения реакции ОТ-ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя. Для каждого образца подготовьте реакцию на ген-мишень и параллельно настройте реакцию с геном ведения хозяйства (HK). Установите каждую реакцию гена в техническое утроение, чтобы исключить влияние случайной вариации из метода. ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь рибосомный ген An. gambiae S7 (GeneBank: L20837.1) и актин (VectorBase: AGAP000651) были использованы в качестве генов HK.</li>
	<li>Используйте все грунтовки в конечной концентрации 300 нМ, следуя показаниям производителя SYBR-green. Амплификация со стандартными условиями ПЦР: 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов по 15 с при 95 °C и 60 с при 60 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки экспрессии генов используется метод дельта-дельта-Ct (ΔΔCt). Дельта Ct (ΔCt) - это разница между Ct гена-мишени и Ct гена домашнего хозяйства. ΔΔCt — разница между ΔCt экспериментальной группы и ΔCt контрольной группы35.</li>
</ol>5. Фенотипическая оценка: успешное кровоснабжение
<ol><li>Для оценки способности к кровоснабжению устанавливают группы из 15 самок комаров, обработанных мишенью и контрольной дцРНК на небольших клетках (диаметром 12 см) и голодают их в течение 4 ч.</li>
	<li>Используя циркуляционную водяную баню, установленную на 37 ° C, стеклянные кормушки для комаров (диаметр 24 мм) и парапленочную мембрану, предлагают дефибринированную овечью кровь комарам. ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь может быть получена у коммерческого поставщика, который асептически извлекает ее из здоровых животных-доноров американского происхождения и вручную дефибринирует без антикоагулянтов или добавок.</li>
	<li>Путем непосредственного наблюдения подсчитайте и запишите количество попыток зондирования, чтобы успешно получить кровяную муку от первых пяти самок, чтобы стать полностью набухшими в каждой группе. ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать значительных метаболических изменений у комаров, которые могли бы помешать энергетическим ресурсам, влияющим на поведение в поисках крови, голодание было сведено к минимуму (4 ч). В результате не каждый комар будет жадно искать кровяную муку, и мы ограничили количество набухших самок до пяти (треть от общего числа в каждой группе), чтобы уменьшить влияние временных переменных, таких как воздействие человеческого запаха, изменение температуры между камерами и поверхностями кормления и т. Д.</li>
</ol>6. Фенотипическая оценка: морфология слюнных желез и понижающая регуляция соответствующих белков
<ol><li>Выделяют свежую ткань в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), как описано на этапе 4.2, и фиксируют в ледяном ацетоне в течение 90 с. Промыть несколько раз в 1x PBS после удаления ацетона. Инкубировать с первичными антителами в течение ночи при 4 °C с антисывороткой (см. Таблицу материалов), разведенной в 1x PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для идентификации первичных антител, используемых для белков слюны (антитромбоцитарный белок Anopheles , AAPP; Mucin 2, MUC2), факторы транскрипции SG (Fork Head, fkh; Шалфей, шалфей; Циклический ответ АМФ-элемент-связывающий белок А, CrebA) и маркер секреторных везикул (Rab11). Эти антитела используются в качестве показаний для формы и функции SG. Однако любое антитело, подходящее для иммунофлуоресценции, должно подходить для этого протокола.</li>
	<li>Вымойте в 1x PBS несколько раз. Добавляют вторичные антитела (флуоресцентные), разведенные в 1x PBS, и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч. Добавьте любое встречное пятно [например, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; ДНК), агглютинин зародышей пшеницы (WGA; для хитина), фаллоидин (для F-актина) и/или Красный Нил (для липидов)] за 30 мин до окончания инкубации за 2 ч.</li>
	<li>Мойте три раза в 1x PBS. Затем установите ткани в 100% глицерине на стандартный слайд микроскопа с крышкой толщиной 1 мм и храните при -20 °C до получения изображения с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа. ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения количественных данных настройки изображения должны быть постоянными. Здесь были включены только проекционные изображения максимальной интенсивности через весь 3D-объем ткани, и вся количественная оценка изображения была нормализована между процедурами (в рамках эксперимента) на основе сигнала DAPI в остатках ткани, не относящихся к SG (жировое тело, кутикула или голова), также присутствующих на слайде.</li>
</ol>

Авторы сообщают, что у них нет конфликта интересов для раскрытия.

Способность эффективно доставлять дцРНК комарам An. gambiae путем перорального кормления имеет широкие последствия для исследований векторной биологии как в лаборатории, так и в полевых условиях. Микроинъекция уже давно принята в качестве предпочтительного способа доставки химических веществ, антител, РНКi и стратегий генетической модификации у комаров43,44. Последствий существенных физических манипуляций, повреждения клеток и стресса можно избежать с помощью пероральной доставки, которая также может быть потенциально пригодна для крупномасштабных или полевых применений. Предыдущая работа предполагала, что РНКи действует повсеместно в пределах отдельного взрослого комара29, допуская эффекты во всех тканях, включая слюнные железы. Кормя комаров большим количеством дцРНК-экспрессирующей E. coli, которые перевариваются асинхронно в течение длительного периода времени, можно потенциально достичь последовательного и равномерного воздействия РНКИ на всех особей в клетке. Этот метод позволяет кормить большое количество комаров и анализировать потенциальную изменчивость полученных фенотипов в зависимости от гена-мишени. Однако одним из важных соображений является возможность гетерогенного распределения бактерий и, следовательно, дцРНК в хлопковом волокне. 400 мкл бактерий, используемых ежедневно для кормления комаров сахаром, будут содержать примерно ≤4,6 мкг дцРНК, как описано и рассчитано ранее9, но количество дцРНК, проглоченного каждым комаром, не было индивидуально определено. Если построение конструкций дцРНК становится рутиной, этот простой протокол лечения позволяет быстро усвоить этот метод любому исследователю комаров. Априори затраты времени во время лечения (30 мин в день) тривиальны по сравнению со временем, затрачиваемым на изучение и применение микроинъекции к аналогичным размерам выборки.
Питание дцРНК обычно используется для обратных генетических исследований в модельном организме Caenorhabditis elegans45. Такой высокий уровень использования подчеркивает ценность подхода к устной доставке. Построение общегеномной библиотеки An. gambiae в трансформированной кишечной палочке, аналогичной той, которая существует у C. elegans46,47, позволило бы проводить быстрый обратный генетический скрининг у комаров в увеличенном масштабе. Однако важно отметить, что эффективность метода в значительной степени зависит от эндогенных уровней транскрипта и от того, ограничивается ли экспрессия тканью-мишенью, а экспрессируется более широко 4,8,44. Кроме того, есть доказательства того, что некоторые инсектициды могут вызывать поведенческое избегание у комаров48, а кормление бактериями, которые потенциально вызывают у них неблагоприятные эффекты, может вызвать аналогичные модели избегания. В контролируемых условиях лаборатории, где у комаров не было альтернативного источника пищи, у них не было выбора, чтобы избежать сахарной воды с кишечной палочкой, и потребность в питательном источнике, вероятно, перевесила бы инстинкт избегать бактерий. Однако это следует учитывать, если стратегия предназначена для использования в менее контролируемых условиях.
Может быть возможно нацеливаться на несколько генов одновременно (используя одну конструкцию, несколько конструкций или смесь трансформированных бактериальных изолятов), но для оценки эффективности необходимы дальнейшие исследования. Другим важным соображением на этот момент является оценка возможных нецелевых или синергетических эффектов при использовании одной или нескольких целей. Создание соответствующих контрольных генов и групп является важной частью экспериментального проекта. Кроме того, заманчиво предположить, что этот подход может быть использован для нацеливания на другие патогены или вирусы49. Предыдущая работа по индукции РНКи у комаров проводилась в условиях, когда реагент вводился непосредственно, поэтому E. coli отсутствовала . E. coli может обеспечивать защитный отсек, позволяющий медленнее высвобождать дцРНК с течением времени, гарантируя, что воздействие будет более или менее непрерывным в течение гораздо более длительного периода29.
Наконец, эти результаты показывают, что эффекты этого метода можно настроить путем корректировки временных рамок (продолжительности и начального дня) воздействия и количества используемой кишечной палочки . Эта особенность позволила изучить функции эссенциальных генов (dsx и fkh) путем определения оптимальных условий нокдауна методом проб и ошибок. Это значительно повышает вероятность того, что гены-мишени, представляющие интерес, могут быть исследованы с использованием этой техники.
Таким образом, было обнаружено, что пероральная доставка РНКи взрослым комарам может быть простой, универсальной и мощным подходом к изучению функции генов комаров и созданию новых и податливых инструментов для борьбы с переносчиками болезней, переносимых комарами.

Многие болезни передаются комарами, что делает изучение физиологии и генетики комаров важным делом. Использование РНКи в этих организмах было заметным в последние 20 лет и позволило функционально охарактеризовать многие гены комаров 1,2,3,4,5. Наиболее часто используемым методом доставки дцРНК была микроинъекция, которая имеет недостатки, заключающиеся в том, что она может повредить комаров и требует значительного времени и усилий. Были опробованы методы пероральной доставки для РНКи, но в основном в личиночной стадии комаров 6,7,8,9. Пероральная доставка дцРНК у взрослых комаров не была полностью изучена и может быть полезным инструментом для изучения векторной биологии и борьбы с переносчиками.
Малярия передается комарами Anopheles, когда инфицированная самка комара берет кровавую пищу от неинфицированного хозяина и вводит слюну, содержащую малярийных паразитов10. Чтобы в конечном итоге передаваться в слюне комара, паразит должен преодолеть многие препятствия, включая уклонение от иммунной системы комара, пересечение барьера средней кишки и вторжение в слюнные железы11. Архитектура слюнной железы комара (SG) является ключом к инвазии паразитов, и эта архитектура контролируется как ключевыми факторами транскрипции, выраженными слюнной железой, так и детерминантами полового диморфизма. Несколько высококонсервативных факторов транскрипции необходимы для клеточной спецификации и гомеостатического поддержания слюнных желез, а также для производства и секреции слюнных белков, которые функционируют при питании кровью 12,13,14. Головка вилки (Fkh) является фактором транскрипции крылатой спирали, который функционирует как основной регулятор структуры и функции SG насекомых (на основе исследований на плодовых мухах и шелкопрядной моли)15,16,17,18,19,20. В Drosophila SGs Fkh функционирует с Sage, SG-специфическим основным фактором транскрипции спирали-петли-спирали (bHLH), чтобы способствовать выживанию SG и выработке слюны19. Важным, положительным корегулятором выработки слюны у дрозофилы является CrebA, хорошо изученный лейциновый фактор транскрипции молнии, который повышает экспрессию генов секреторного пути 21,22,23. Существует также сильная степень морфологической дифференцировки в женских слюнных железах, которая, вероятно, играет ключевую роль не только в кровоснабжении, но и в способности паразитов вторгаться в эту ткань24.
Многие из генов, участвующих в определении выживаемости, структуры, физиологии и полового диморфизма слюнных желез, имеют сложные профили пространственно-временной экспрессии 25,26,27, и традиционные методы доставки дцРНК для индуцирования РНК Не всегда эффективны для нацеливания на эти виды генов в той или иной ткани. Тем не менее, пероральная доставка дцРНК в личиночной стадии комаров Aedes aegypti и An. gambiae была успешно использована для подавления специфической для женщин формы гена dsx 9,28. Предыдущие исследования с использованием дцРНК в слюнных железах комаров показали, что, хотя требовалось большое количество дцРНК, эффект глушения был относительно длительным (не менее 13 дней)29. Здесь была проверена способность термоубитого штамма E. coli HT115 (DE3), экспрессирующего последовательно-специфическую дцРНК для dsx, fkh или CrebA, индуцировать глушение РНКи этих генов у взрослых самок комаров. Пероральное введение нокдауна гена, индуцированного дцРНК, у An. gambiae, с явным снижением уровней мРНК и с фенотипами, соответствующими потере функции этих генов. Таким образом, этот подход, вероятно, будет работать, чтобы сбить функцию различных генов слюнных желез.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) Medium</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>DF0440-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAPP</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); gift from Fabrizio Lombardo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuStart II PCR Supermix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>95137-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A5354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anopheles gambiae G3</td>
			<td>BioDefense and Emerging Infections (BEI) Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4)</td>
			<td>MRA-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugDorm</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>1452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>P022628181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrebA</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>CrebA Rbt-PC</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Damiens diet</td>
			<td>BioServ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>n/a</td>
			<td>4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole; 1:200 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated sheep blood</td>
			<td>HemoStat</td>
			<td>DSB050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115 (DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JM109 Competent cells</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth Media</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10855001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 2</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>Muc2; 27 675-1-AP</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (mouse).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Lipid dye; 1:50 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Owl EasyCast B2 Mini Gel Horizontal Electrophoresis</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Model B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEMT easy</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power SYBR-green PCR master MIX</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink PCR purification kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K31001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaStudio 6</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio6 Real Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rab11</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:100 dilution (rabbit); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rh-WGA</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Rhodamine-conjugated wheat germ agglutinin (chitin, O-GlcNAcylation dye); 1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sage</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Antisera. 1:50 dilution (rat); generated by the Andrew Lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>87128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM700 fluorescence confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTIBODIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A28181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG (H+L) Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIMERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-2f: TACAACTCGATCATGAAGTGCGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACT-3r: CCCGGGTACATGGTGGTACCGC 
			CGGA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_F: GCCGACTTATGCTTAGCCCA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FKH_RNAi_R: TAGCCGTCAATTCCTCCTGC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-f: AGAGGGCGGGGAAATTCTAGT</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>newDSX-r: GGGCTTGTGGCAGTACGAATA</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qf1: AGAACCAGCAGACCACCATC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S7qr1: GCTGCAAACTTCGGCTATTC</td>
			<td>CDC Biotechnology Core Facility Branch</td>
			<td>n/a</td>
			<td>qRT-PCR primer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effective oral rna interference (rnai) administration to adult anopheles gambiae mosquitoes

РНК-интерференция была широко используемым инструментом для обратного генетического анализа в течение двух десятилетий. У взрослых комаров введение двухцепочечной РНК (дцРНК) осуществлялось в основном путем инъекций, что требует значительного времени и не подходит для полевых применений. Чтобы преодолеть эти ограничения, здесь мы представляем более эффективный метод надежной активации РНКi путем пероральной доставки дцРНК взрослому Anopheles gambiae. Длинные дцРНК были получены в штамме Escherichia coli HT115 (DE3), а концентрированная суспензия термоубитых дцРНК-содержащих бактерий в 10% сахарозе была предложена на ватных шариках ad-libitum взрослым комарам . Ватные шарики заменялись каждые 2 дня на время лечения. Использование этого метода для нацеливания на двойной секс (ген, участвующий в дифференцировке пола) или головку вилки (которая кодирует фактор транскрипции слюнной железы) привело к снижению экспрессии гена-мишени и / или сигнала иммунофлуоресценции белка, измеренного количественной ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) или флуоресцентной конфокальной микроскопии, соответственно. Также наблюдались дефекты морфологии слюнных желез. Этот очень гибкий, удобный для пользователя, недорогой, эффективный по времени метод доставки дцРНК может быть широко применим к генам-мишеням, важным для физиологии насекомых-переносчиков и за ее пределами.

Watch this Scientific Journal Video about Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes at JoVE.com

Effective Oral RNA Interference RNAi Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Пероральное введение дцРНК, продуцируемой бактериями, метод доставки РНК-интерференции (РНКи), который обычно используется в Caenorhabditis elegans, было успешно применено здесь к взрослым комарам. Наш метод позволяет проводить надежные исследования обратной генетики и векторные исследования, блокирующие передачу, без использования инъекций.

Эффективное пероральное введение РНК-интерференции (РНКи) взрослым комарам Anopheles gambiae

RNA interference has been a heavily utilized tool for reverse genetic analysis for two decades. In adult mosquitoes, double-stranded RNA (dsRNA) ...

РНК-интерференция является одним из основных инструментов, используемых для обратной генетики у комаров, а оральная доставка позволяет нам индуцировать и поддерживать глушение генов у взрослых комаров без необходимости микроинъекции. Пероральная доставка двухцепочечной РНК взрослым комарам является недорогим и универсальным методом интерференции РНК, который значительно сокращает работу, время и усилия по изучению функции генов. Этот метод может быть использован для изучения не только других генов-мишеней в Anopheles gambiae, но и в других анофелях, представляющих интерес, таких как Anopheles albinamus.Для начала вырастите культуру из одной бактериальной колонии штамма Escherichia coli HT115(DE3), содержащую двухцепочечную РНК-экспрессирующую плазмиду в пяти миллилитрах фунта, содержащего ампициллин и тетрациклин, на платформенном шейкере в течение 12 часов при 37 градусах Цельсия и 180 об/мин. Через 12 часов возьмите 0,5 миллилитра выращенной на ночь бактериальной культуры и сделайте одно из 1000 разведения в 2X дрожжевой триптоновой среде, содержащей ампициллин и тетрациклин. Чтобы индуцировать двухцепочечную продукцию РНК, добавляют IPDG в конечной концентрации 40 микромоляров.Затем инкубируйте культуру в течение двух часов в условиях встряхивания, как показано. В конце инкубации, когда оптическая плотность культуры достигает 0,4 при 600 нанометрах, гранулируют бактериальные клетки путем центрификации в 4000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и затем промывают клетки в одном объеме PBS. После еще одного вращения клеток повторно суспендируют клетки в PBS и инкубируют при 70 градусах Цельсия в течение одного часа.После того, как тепло убивает бактерии, сделайте аликвоты объемом 400 микролитров и храните их при 20 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Смешайте одну 400-микролитровую аликвоту оттаивающих тепло убитых бактерий, экспрессирующих двухцепочечную РНК, с 1,6 миллилитрами 12%-го раствора сахара, содержащего 0,2%метилпарабена. Замочите небольшой ватный тампон в этом растворе и поместите его в клетку, содержащую пятидневных комаров, и убедитесь, что комары питаются этим раствором.Меняйте ватный тампон, смоченный в двухцепочечном растворе РНК-сахара, через день в течение восьми дней подряд, гарантируя, что клетка поддерживается в постоянных условиях. Чтобы обезболить комаров холодом, поместите контейнер на лед до тех пор, пока комары не перестанут двигаться, а затем поместите комаров на холодную поверхность, чтобы изолировать самок для рассечения. После опрыскивания комаров этанолом поместите их на стеклянную поверхность с PBS.С помощью пары щипцов закрепите голову комара и очень медленно потяните грудную клетку, позволяя слюнным железам высвобождаться в PBS. Как только слюнные железы будут рассечены от 10 комаров, вытяните железы для извлечения РНК. По завершении экстракции РНК приостановить гранулу РНК в 30 микролитрах свободной воды РНК.Измерьте поглощение и рассчитайте концентрацию РНК, как описано в тексте рукописи. Используя коммерческий набор обратной транскрипции, синтезируйте кДНК из одного микрограмма РНК. Разбавьте кДНК в 10 раз и настройте реакции RTPCR в трех экземплярах для генов-мишеней и ведения хозяйства в соответствии с рекомендациями производителя.Амплируйте CDNA стандартными условиями ПЦР в режиме реального времени. Чтобы оценить способность к кровавому питанию, поместите группы из 15 самок комаров, обработанных целевой и контролируемой двухцепочечной РНК, в небольшие клетки и морите их голодом в течение четырех часов. Обеспечьте дефибрилированную дешевую кровь комарам с помощью циркуляционной водяной бани, установленной до 37 градусов по Цельсию, стеклянных кормушек для комаров и мембраны для заполнения.Наблюдайте, подсчитывайте и записывайте количество пробных попыток успешно получить кровяную муку от первых пяти самок, чтобы полностью набухнуть в каждой группе. После выделения свежей ткани, которую PBS продемонстрировал ранее, зафиксируйте ее в ледяном ацетоне в течение 90 секунд. Затем промыть ткань несколько раз в PBS и инкубировать с первичными антителами в течение ночи при четырех градусах Цельсия с антисывороткой, разведенной в PBS.В конце инкубации промыть ткань несколько раз ПБС. Добавляют флуоресцентные вторичные антитела, разведенные в PBS, и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение двух часов. Добавьте любое встречное пятно за 30 минут до окончания двухчасовой инкубации.Через два часа промыть ткань три раза PBS, затем установить ткани в 100% глицерине на стандартный слайд микроскопа с крышкой толщиной в один миллиметр и хранить при 20 градусах Цельсия до получения изображения. Данные экспрессии микроарай показали экспрессию всех выбранных целевых генов во взрослых слюнных железах, а уровни AAPP и шалфея были особенно высокими. Двухцепочечная РНК эффективно уменьшала обилие транскриптов головки вилки в слюнной железе.Двухцепочечные РНК-комары, питаемые вилочной головкой, демонстрировали в пять раз больше попыток кормления, чем контрольная группа или двухцепочечная РНК FEG, которых кормили комаров, чтобы они были полностью нагружены кровью. Уровни окрашивания шалфея и CrebA были заметно снижены во всех долях слюнных желез после интерференции РНК головки вилки по сравнению с интерференцией РНК контроля муравьев. При рассмотрении высокообильных белков компонентов слюны уровни AAPP были снижены во всех трех долях слюнных желез после интерференции РНК головки вилки по сравнению с контрольной РНК-интерференцией.С другой стороны, никаких изменений в уровнях муцина не наблюдалось. Эти данные свидетельствуют о том, что головка вилки по-разному способствует экспрессии различных генов белка слюны. Снижение флуоресценции Rab11 наблюдалось в дистальных боковых долях после интерференции РНК головки вилки, однако также наблюдалось увеличение сигнала Rab11 в медиальной и проксимальной боковых долях.Не наблюдалось заметной разницы в сигнале Nile Red после РНК-интерференции головки вилки по сравнению с контрольной РНК-интерференцией. некоторые секретари машинной реакции сложным образом, который отличается между долями слюнных желез. Этот метод может позволить исследователям заставить замолчать гены, экспрессия которых может быть уменьшена путем одной инъекции двухцепочечной РНК, и исследовать пероральную доставку двухцепочечной РНК для использования РНК в качестве потенциального метода борьбы с переносчиками.

Research

JoVE Journal

Biology

Effective Oral RNA Interference (RNAi) Administration to Adult Anopheles gambiae Mosquitoes

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Протокол Анализы RNAi у взрослых комаров (А. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

Строительство Лучше Mosquito: Идентификация генов Включение малярия и лихорадка денге Сопротивления в gambiae А. и А. aegypti комаров

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

Бактериальные Доставка RNAi создания эффектов: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

RNAi Вмешательство инъекций в дсРНК Drosophila Эмбрионы

Genetic screening is one of the most powerful methods available for gaining insights into complex biological process 1. Over the years many improvements ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

RNAi-опосредованной Нокдаун гена и<em&gt; В Vivo</em&gt; Анализ Диурез в взрослых женщин<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Комары

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Larval RNA Interference in the Red Flour Beetle, Tribolium castaneum

Личинок РНК-интерференция в Red мучного жука<em&gt; Tribolium castaneum</em

The red flour beetle, Tribolium&#160;castaneum, offers a repertoire of experimental tools for genetic and developmental studies, including a fully ...

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae

RNAi Trigger поставки в<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Куколки

RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

Практического использования РНК-интерференции: устные доставка двуцепочечной РНК в липосомы перевозчиков для тараканов

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: An Open Source Data Integration Tool for Big Data Transcriptomics Designed for the Malaria Vector Anopheles gambiae

IR-TEx: Инструмент интеграции данных с открытым исходным кодом для транскриптомики больших данных, предназначенный для гамбии переносчика малярии Anopheles

IR-TEx is an application written in Shiny (an R package) that allows exploration of the expression of (as well as assigning functions to) transcripts ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

Бактериальная устная кормление с помощью антибиотико-обработанных комаров

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...