Name: efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor
Uploaded: 2021-11-30T14:45:00
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Cette étude a été soutenue par le HKBU Seed Fund et la Subvention de démarrage de niveau 2 (RG-SGT2/18-19/SCI/009), le Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) à C.H.H. Hor.

Toutes les procédures liées aux animaux ont été effectuées conformément aux directives de manipulation des animaux et au protocole approuvé par le ministère de la Santé de Hong Kong. Les licences d’expérimentation animale conformément à l’ordonnance sur les animaux (contrôle des expériences) (cap. 340) ont été obtenues auprès du ministère de la Santé du gouvernement de Hong Kong. Le travail sur les animaux a été effectué conformément à l’éthique de la sécurité animale approuvée par le bu...

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	<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atoh1+controls+primary+cilia+formation+to+allow+for+SHH-triggered+granule+neuron+progenitor+proliferation.">Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation.</a> Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).</li><li>Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+signaling+is+required+for+expansion+of+granule+neuron+precursors+and+patterning+of+the+mouse+cerebellum.">Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum.</a> Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).</li><li>Bangs, F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+mammalian+Hedgehog+signaling.">Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).</li><li>Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functions+of+Rab23+on+primary+cilium-+and+Hedgehog+signaling-mediated+cerebellar+granule+cell+proliferation.">Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation.</a> Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).</li><li>Han, Y. 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A., Chiara Manzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+cerebellar+development+in+mice+overexpressing+VGF.">Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF.</a> Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+nerve+cells.">Confocal imaging of nerve cells.</a> Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).</li><li>Corbit, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Smoothened+functions+at+the+primary+cilium.">Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium.</a> Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).</li></ol>

La transfection de transgènes en culture primaire de BPC par électroporation est généralement associée à une faible viabilité cellulaire et à une faible efficacité de transfection9,10. Cet article présente un protocole d’électroporation rentable et reproductible qui a démontré une efficacité et une viabilité élevées. En outre, nous démontrons également une méthode simple d’étude de la voie de signalisation Hh dépendante du cilium primair...

Les GCP cérébelleux sont largement utilisés pour étudier la machinerie de la voie de signalisation Hh dans les types de cellules progénitrices neuronales en raison de leur grande abondance et de leur grande sensibilité à la voie de signalisation Hh in vivo1,2,3,4. Dans les GCP, le cilium primaire agit comme un pivot de transduction du signal Hh5 qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs6,7,8. La visualisation in vitro des composants de signalisation Hh sur le cil primaire est souvent difficile en raison de leurs faibles niveaux basaux endogènes. Par conséquent, la modification transgénique des niveaux d’expression des protéines et le marquage fluorophore du gène d’intérêt sont des approches utiles pour étudier la voie à résolution moléculaire. Cependant, la manipulation génétique des cultures primaires GCP à l’aide d’approches de transfection à base de liposomes entraîne souvent une faible efficacité de transfection, ce qui entrave la poursuite des investigations moléculaires9. L’électroporation augmente l’efficacité, mais nécessite généralement des réactifs d’électroporation exorbitants spécifiques au fournisseur et au type de cellule10.
Cet article présente une méthode d’électroporation à haute efficacité et rentable pour manipuler les composants de la voie de signalisation Hh dans les cultures primaires GCP. En utilisant ce protocole d’électroporation modifié, un transgène lissé marqué par une protéine fluorescente verte (GFP) (pEGFP-Smo) a été efficacement administré aux GPC et a atteint des taux élevés de survie cellulaire et de transfection (80-90%). En outre, comme en témoigne la coloration immunocytochimique, les GCP transfectés ont montré une grande sensibilité à l’activation de la voie de signalisation Hh induite par les agonistes lissés par le trafic de l’EGFP-Smo vers les cils primaires. Ce protocole est directement applicable et bénéfique pour les expériences qui impliquent une modification génétique in vitro de types cellulaires difficiles à transfecter, tels que les cultures de cellules primaires humaines et de rongeurs, ainsi que les cellules souches pluripotentes induites par l’homme.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>GCP Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14155063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamMAXTM-I ,100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain,suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11914-1</td>
			<td>Smoothened agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IF staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP-goat ab</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-101-215</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Arl13b mouse monoclonal ab</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>75-287</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CU 500 cuvette chamber</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CU500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced-serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-mSmo</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>25395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>NEPA21</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor

Le cil primaire est un organite de signalisation critique trouvé sur presque toutes les cellules qui transduit les stimuli de signalisation Hedgehog (Hh) de la surface cellulaire. Dans le précurseur des cellules granulaires (GCP), le cilium primaire agit comme un centre de signalisation pivot qui orchestre la prolifération des cellules précurseurs en modulant la voie de signalisation Hh. L’étude de la machinerie de signalisation Hh primaire dépendante du cilium est facilitée par la manipulation génétique in vitro des composants de la voie pour visualiser leur localisation dynamique vers le cilium primaire. Cependant, la transfection des transgènes dans les cultures primaires de GPC à l’aide des méthodes d’électroporation actuellement connues est généralement coûteuse et entraîne souvent une faible viabilité cellulaire et une efficacité de transfection indésirable. Cet article présente un protocole d’électroporation efficace, rentable et simple qui démontre une efficacité de transfection élevée d’environ 80 à 90% et une viabilité optimale des cellules. Il s’agit d’une méthode de modification génétique simple, reproductible et efficace qui est applicable à l’étude de la voie de signalisation primaire du hérisson dépendant du cilium dans les cultures primaires de BPC.

En utilisant l’Opti-MEM (voir le tableau des matériaux) comme réactif universel, cette méthodologie d’électroporation proposée pourrait atteindre une efficacité d’électroporation constamment élevée à ~ 80-90% (Figure 1). L’efficacité d’électroporation du vecteur Smo-EGFP a été déterminée à DIV 2 après l’électroporation par quantification du pourcentage de cellules vertes à fluorescence positive dans toutes les cellules GCP exprimant la protéi...

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Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

Nous présentons ici un protocole d’électroporation in vitro reproductible pour la manipulation génétique des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires (GCP) qui est rentable, efficace et viable. De plus, ce protocole démontre également une méthode simple pour l’étude moléculaire des voies de signalisation primaires du hérisson dépendantes du cilium dans les cellules GCP primaires.

Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cilium dans le précurseur de cellules granulaires

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Ce protocole démontre une méthode de modification génétique in vitro simple pour l’étude moléculaire de la voie de signalisation primaire dépendante du cilium dans les cultures de précurseurs de cellules granulaires primaires. En raison du coût, de la faible viabilité et de la faible efficacité de la méthode de transfection actuelle, nous introduisons une technique d’électroporation simple, rentable et efficace pour étudier la voie de signalisation dépendante du cilium dans les cultures de BPC primaires. Pour commencer, ajoutez 0,5 millilitre de milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture de 24 puits contenant des feuillets de couverture enduits et maintenez-le au chaud à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone.Pipeter le nombre requis de cellules dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre et tourner à 200x G pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres d’Opti-MEM. Répétez cette procédure deux fois pour vous assurer qu’aucun milieu de culture résiduel n’est présent dans le tube.Définissez les paramètres d’électroporation comme indiqué. Pipettez doucement la réaction d’électroporation pour bien mélanger et utilisez une longue pointe de pipette P200 pour transférer un volume exact de 100 microlitres du mélange dans la cuvette à espace de deux millimètres. Une fois que la cuvette est à l’intérieur de la chambre de la cuvette, appuyez sur le bouton oméga de l’électroporateur et notez la valeur d’impédance en adhérant à un volume précis de 100 microlitres.La plage de valeur d’impédance doit être d’environ 30 et 35. Appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer l’impulsion. Enregistrez les valeurs actuelles mesurées en joules affichées sur le cadre de lecture.Retirez la cuvette de la chambre. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de milieu de culture préchauffé dans la cuvette et remettez-la en suspension en pipetant deux à trois fois. Transférer immédiatement la suspension cellulaire dans la plaque de 24 puits préalablement préparée.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur à dioxyde de carbone. Observez les cellules au microscope à fluorescence le lendemain. Dans la présente étude, l’efficacité de l’électroporation des groupes traités par DMSO et SAG semblait comparable.L’immunocoloration du marqueur primaire du cil Arl13b démontre que le taux de ciliation du GCP à la div-2 de la culture dans les groupes traités par le véhicule et le SAG. Le taux de ciliation illustre le pourcentage de Pax6 exprimant des GCP portant un cilium primaire à la surface de la cellule à div-2 après l’électroporation. La figure montre une augmentation significative de la localisation lissée de l’EGFP sur l’axoneme primaire du cilium des cellules GCP d’expression Pax6 24 heures après le traitement SAG, indiquant une activation profonde de la voie de signalisation primaire du hérisson dépendant du cilium.Afin d’obtenir une efficacité d’électroporation plus élevée, il faut assurer une grande pureté du plasmide utilisé et aucun milieu de culture résiduel n’est présent dans le mélange d’électroporation plasmidique. Ce protocole devrait être directement applicable et bénéfique pour les expériences de modification génétique in vitro sur des cultures primaires et des types de cellules difficiles à transfecter, y compris les neurones et les cellules souches pluripotentes induites par l’homme.

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