Name: efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor
Uploaded: 2021-11-30T14:45:00
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この研究は、HKBUシードファンドとティア2スタートアップグラント(RG-SGT2/18-19/SCI/009)、研究助成金協議会共同研究基金(CRF-C2103-20GF)からC.H.H.Horに支援されました。

すべての動物関連の手順は、動物の取り扱いガイドラインと香港保健省によって承認されたプロトコルに従って行われました。動物実験免許(実験管理)条例(キャップ340)は、香港保健省から取得した。動物の仕事はHKBUの調査事務所および実験室安全委員会によって承認された動物の安全倫理に従って行われた。このプロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 資料表</strong...

<ol>
	<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atoh1+controls+primary+cilia+formation+to+allow+for+SHH-triggered+granule+neuron+progenitor+proliferation.">Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation.</a> Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).</li><li>Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+signaling+is+required+for+expansion+of+granule+neuron+precursors+and+patterning+of+the+mouse+cerebellum.">Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum.</a> Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).</li><li>Bangs, F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+mammalian+Hedgehog+signaling.">Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).</li><li>Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functions+of+Rab23+on+primary+cilium-+and+Hedgehog+signaling-mediated+cerebellar+granule+cell+proliferation.">Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation.</a> Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).</li><li>Han, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+and+opposing+roles+of+primary+cilia+in+medulloblastoma+development.">Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+required+for+cerebellar+development+and+Shh-dependent+expansion+of+progenitor+pool.">Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool.</a> Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).</li><li>Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+screening+of+commonly+used+commercial+transfection+reagents+towards+efficient+transfection+of+single-stranded+oligonucleotides.">Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), 2564 (2018).</li><li>Chicaybam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+electroporation+protocol+for+the+genetic+modification+of+mammalian+cells.">An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+cerebellar+development+in+mice+overexpressing+VGF.">Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF.</a> Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+nerve+cells.">Confocal imaging of nerve cells.</a> Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).</li><li>Corbit, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Smoothened+functions+at+the+primary+cilium.">Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium.</a> Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).</li></ol>

エレクトロポレーション法による原発GCP培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、典型的には低い細胞生存率と低いトランスフェクション効率9,10と関連している。この論文では、高効率と生存率を実証した、費用対効果が高く、再現性の高いエレクトロポレーションプロトコルを紹介する。また、一次GCP細胞における一次シリウ?...

小脳GCPは、生体内のHhシグナル伝達経路に対する高い存在量と高感度性のために、ニューロン前駆細胞型におけるHhシグナル伝達経路の機械を研究するために広く使用されています。GCPにおいて、一次シリウムは、前駆細胞6,7,8の増殖を調整する極めて重要なHhシグナル伝達ハブ5として機能する。一次シリウム上のHhシグナル伝達成分のインビジュアライゼーションは、内因性の基底レベルが低いため、しばしば困難です。したがって、目的の遺伝子のタンパク質発現レベルおよびフルオロフォアタグ付けの遺伝子導入修飾は、分子分解能で経路を研究するのに有用なアプローチである。しかし、リポソームベースのトランスフェクションアプローチを用いたGCP一次培養の遺伝子操作は、トランスフェクション効率が低いことが多く、さらなる分子調査を妨げる9。エレクトロポレーションは効率を高めるが、一般的には法外なベンダー固有および細胞型制限型エレクトロポレーション試薬10を必要とする。
本論文では、GCP一次培養におけるHhシグナル伝達経路成分を操作するための高効率かつ費用対効果の高いエレクトロポレーション法を紹介する。この改変エレクトロポレーションプロトコルを用いて、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きスムージングトランスジーン(pEGFP-Smo)をGCPに効率よく送達し、高い細胞生存率とトランスフェクション率(80~90%)を達成しました。さらに、免疫細胞化学的染色によって証明されるように、トランスフェクトGCPは、EGFP-Smoをプライマリ繊毛に密売することによってHhシグナル伝達経路のSmoothedアゴニスト誘発活性化に対して高い感受性を示した。このプロトコルは、ヒトおよびげっ歯類の一次細胞培養、ならびにヒト人工多能性幹細胞など、トランスフェクトが困難な細胞型の インビトロ 遺伝子改変を伴う実験に対して直接的に適用され、有益である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GCP Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14155063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamMAXTM-I ,100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain,suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11914-1</td>
			<td>Smoothened agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IF staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP-goat ab</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-101-215</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Arl13b mouse monoclonal ab</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>75-287</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CU 500 cuvette chamber</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CU500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced-serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-mSmo</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>25395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>NEPA21</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor

一次シリウムは、ヘッジホッグ(Hh)シグナル伝達刺激を細胞表面から伝達するほぼすべての細胞に見られる重要なシグナル伝達オルガネラである。顆粒細胞前駆体(GCP)において、一次シリウムはHhシグナル伝達経路を調節することによって前駆細胞増殖を調整する極めて重要なシグナル伝達センターとして機能する。一次シリウム依存性Hhシグナル伝達機械の調査は、経路成分の インビトロ 遺伝子操作によって促進され、一次シリウムへの動的局在化を可視化する。しかし、現在知られているエレクトロポレーション法を用いたGCPの一次培養におけるトランスフェインのトランスフェクションは、一般にコストがかかり、しばしば低い細胞生存率および望ましくないトランスフェクション効率をもたらす。この論文では、高いトランスフェクション効率が80~90%、最適な細胞生存率を実証する、効率的で費用対効果の高いシンプルなエレクトロポレーションプロトコルを紹介します。これは、一次GCP培養における主要なシリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の研究に適用可能な、単純で再現性のある効率的な遺伝子改変方法である。

この提案されたエレクトロポレーション方法論は、オプティ-MEM( 材料表参照)を汎用試薬として用い、一貫して80~90%で高いエレクトロポレーション効率を達成できる(図1)。Smo-EGFPベクターのエレクトロポレーション効率は、全てのペアドボックスタンパク質-6(Pax6)発現GCP細胞における緑色蛍光陽性細胞の割合を定量することにより、DIV2ポストエレクトロポレ?...

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Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

ここでは、費用対効果が高く、効率的で実行可能な一次小脳顆粒細胞前駆体(GCP)の遺伝子操作のための再現性のある インビトロ エレクトロポレーションプロトコルを提示する。さらに、このプロトコルはまた、一次GCP細胞における一次シリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の分子的研究のための簡単な方法を示す。

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

本プロトコルは、一次顆粒細胞前駆体培養における一次シリウム依存シグナル伝達経路の分子的研究のための簡単なインビトロ遺伝子改変法を示す。コスト、低生存率、そして現在のトランスフェクション法の効率が悪いため、GCP培養のシリウム依存性シグナル伝達経路を調査するためのシンプルで費用対効果の高い効率的なエレクトロポレーション技術を導入しています。まず、コーティングされたカバースリップを含む24ウェル培養プレートの各ウェルに0.5ミリリットルの培養培地を加え、二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で暖かく保ちます。必要な数の細胞を無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにピペットし、室温で5分間200x Gでスピンする。上清を捨て、細胞ペレットを200マイクロリットルのOpti-MEMで再懸濁します。チューブ内に残留培養培地が存在しないように、この手順を2回繰り返す。エレクトロポレーションのパラメータをリストに記載されているように設定します。エレクトロポレーション反応を穏やかに混合し、長いP200ピペットチップを使用して、混合物の正確な体積を2ミリメートルギャップキュベットに移します。キュベットがキュベットチャンバー内に入ったら、エレクトロポレーターのオメガボタンを押し、100マイクロリットルの正確な体積に従ってインピーダンス値を確認します。インピーダンス値の範囲は、約 30 と 35 である必要があります。開始ボタンを押してパルスを開始します。読み取りフレームに表示されるジュールに、計測された電流値を記録します。チャンバーからキュベットを取り外します。すぐに100マイクロリットルの予温培養培地をキュベットに加え、2~3回上下にピペットで再懸濁する。すぐに、細胞懸濁液を、前に準備した24ウェルプレートに移す。二酸化炭素インキュベーターで37°Cで細胞をインキュベートします。翌日、蛍光顕微鏡下で細胞を観察します。本研究では、DMSO及びSAG処理群のエレクトロポレーション効率が同等に見えた。一次シリウムマーカーArl13bの免疫染色は、車両およびSAG処理群の両方における培養物のdiv-2におけるGCPの毛型化率を示す。この毛様化速度は、div-2ポストエレクトロポレーションで細胞表面に第一のシリウムを有するGCPを発現するPax6の割合を示す。この図は、SAG後24時間の処理におけるPax6発現GCP細胞の一次シリウム軸根に対する平滑化EGFP局在化の有意な増加を示し、一次シリウム依存性ヘッジホッグシグナル伝達経路の深い活性化を示す。より高いエレクトロポレーション効率を達成するためには、使用されるプラスミドの純度が高く、プラスミドエレクトロポレーション混合物に残留培養培地が存在しない必要があります。このプロトコルは、ニューロンやヒトが誘発する多能性幹細胞を含む、トランスフェクトが困難な一次培養および細胞タイプに関するインビトロ遺伝子改変実験に直接適用され、有益であるべきである。

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