Name: efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor
Uploaded: 2021-11-30T14:45:00
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이 연구는 HKBU 시드 펀드와 Tier-2 스타트업 그랜트 (RG-SGT2/18-19/SCI/SCI/009), 연구 보조금 위원회-협력 연구 기금 (CRF-C2103-20GF)에서 C.H.H. Hor에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 관련 절차는 동물 취급 지침과 홍콩 보건부에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 동물 실험 면허 (실험 의 제어) 조례 (캡. 340) 보건부에서 취득되었다, 홍콩 정부. 동물 작업은 HKBU 연구실 및 실험실 안전 위원회가 승인한 동물 안전 윤리에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
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	<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atoh1+controls+primary+cilia+formation+to+allow+for+SHH-triggered+granule+neuron+progenitor+proliferation.">Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation.</a> Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).</li><li>Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+signaling+is+required+for+expansion+of+granule+neuron+precursors+and+patterning+of+the+mouse+cerebellum.">Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum.</a> Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).</li><li>Bangs, F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+and+mammalian+Hedgehog+signaling.">Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).</li><li>Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+functions+of+Rab23+on+primary+cilium-+and+Hedgehog+signaling-mediated+cerebellar+granule+cell+proliferation.">Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation.</a> Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).</li><li>Han, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+and+opposing+roles+of+primary+cilia+in+medulloblastoma+development.">Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+cilia+are+required+for+cerebellar+development+and+Shh-dependent+expansion+of+progenitor+pool.">Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool.</a> Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).</li><li>Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+screening+of+commonly+used+commercial+transfection+reagents+towards+efficient+transfection+of+single-stranded+oligonucleotides.">Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides.</a> Molecules. 23 (10), 2564 (2018).</li><li>Chicaybam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+electroporation+protocol+for+the+genetic+modification+of+mammalian+cells.">An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).</li><li>Mizoguchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+cerebellar+development+in+mice+overexpressing+VGF.">Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF.</a> Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+nerve+cells.">Confocal imaging of nerve cells.</a> Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , 235-247 (2014).</li><li>Corbit, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+Smoothened+functions+at+the+primary+cilium.">Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium.</a> Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).</li></ol>

전기기화 방법에 의한 1차 GCP 배양에서 의 전형적 트랜스펙트(transfection)는 전형적으로 낮은 세포 생존력 및 불량한 형질 효율9,10과 연관된다. 이 백서는 고효율과 생존력을 입증한 비용 효율적이고 재현 가능한 전기 화 프로토콜을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 cilium 의존적인 Hh 신호 통로를 공부하는 간단한 방법을 ?...

소뇌GCP는 생체 내에서 Hh 신호 경로에 대한 높은 풍부함과 높은 민감성으로 인해 뉴런 전구 세포 유형의 Hh 신호 경로의 기계를 연구하는 데 널리 사용됩니다. GCP에서, 1차 실슘은 전구체 세포의 증식을 조율하는 중추적인 Hh 신호 변환 허브5로서 작용한다6,7,8. 1차 실륨에서 Hh 신호 성분의 체외 시각화는 낮은 내인성 기저 수준으로 인해 종종 도전적입니다. 따라서, 관심 유전자의 단백질 발현 수준 및 형광소 태깅의 유전자 변형은 분자 해상도에서 경로를 연구하는 유용한 접근이다. 그러나, 지방성 기지를 둔 transfection 접근을 사용하여 GCP 1 차적인 배양을 유전 조작은 수시로 더 분자 조사를 방해하는 낮은 transfection 효율성 귀착됩니다9. 전기기화는 효율성을 증가하지만 일반적으로 엄청난 공급 업체 별 및 세포 유형 제한 전기 기리 작용10이 필요합니다.
이 논문은 GCP 1차 배양에서 Hh 신호 경로 구성 요소를 조작하는 고효율 및 비용 효율적인 전기 포기법을 소개합니다. 이러한 변형된 전기기화 프로토콜을 사용하여, 녹색 형광 단백질(GFP)-태그된 스무텐 트랜스진(pEGFP-Smo)은 GCP에 효율적으로 전달되었고 높은 세포 생존율(80-90%)을 달성하였다. 더욱이, 면역세포화학 염색에 의해 입증된 바와 같이, 감염된 GCP는 EGFP-Smo를 1차 섬모로 인신매매함으로써 Hh 신호 경로의 편평한 작용제 유도 활성화에 높은 민감성을 보였다. 이 프로토콜은 인간 및 설치류 1차 세포 배양뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포와 같이 트랜스펙트하기 어려운 세포 유형의 체외 유전자 변형을 포함하는 실험에 직접적으로 적용되고 유익합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GCP Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14155063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamMAXTM-I ,100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain,suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11914-1</td>
			<td>Smoothened agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IF staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP-goat ab</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-101-215</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Arl13b mouse monoclonal ab</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>75-287</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CU 500 cuvette chamber</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CU500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced-serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-mSmo</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>25395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>NEPA21</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor

1차 실륨은 고슴도치(Hh)가 세포 표면으로부터 자극을 신호하는 거의 모든 세포에서 발견되는 중요한 신호 세포입니다. 과립 세포 전구체(GCP)에서, 1차 실슘은 Hh 신호 경로를 조절하여 전구체 세포 증식을 오케스트레이션하는 중추적인 신호 센터역할을 한다. 1차 실슘 의존Hh 시그널링 기계류의 조사는 경로 구성 요소의 체외 유전자 조작에 의해 촉진되어 동적 국소화를 1차 실륨으로 시각화합니다. 그러나, 현재 알려진 전기기화 방법을 사용하는 GCP의 1차 배양에서 의 전염은 일반적으로 비용이 많이 들며 종종 낮은 세포 생존력과 바람직하지 않은 트랜스포션 효율을 초래한다. 이 백서는 ~80-90%의 높은 배분 효율과 최적의 세포 생존가능성을 보여주는 효율적이고 비용 효율적이며 간단한 전기 기립 프로토콜을 소개합니다. 이것은 1 차적인 GCP 문화에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 연구 결과에 적용되는 간단하고 재현 가능하고 능률적인 유전 수정 방법입니다.

Opti-MEM( 재료의 표 참조)을 보편적 시약으로 사용하여, 이 제안된 전기기화 방법론은 ~80-90%(그림 1)에서 일관되게 높은 전기기화 효율을 달성할 수 있었다. Smo-EGFP 벡터의 전기기화 효율은 모든 페어링된 상자 단백질-6(Pax6)-발현 GCP 세포에서 녹색 형광 양성 세포의 백분율을 정량화함으로써 DIV 2 후 전기기화에서 결정되었다. DMSO 및 SAG 처리 군의 전기기 효율은 비?...

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Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

여기서, 우리는 비용 효율적이고 효율적이며 실행 가능한 1 차성 과립 세포 전구체 (GCP)의 유전 조작을 위한 시험관 내 전기화 프로토콜을 제시합니다. 더욱이, 이 프로토콜은 또한 1 차적인 GCP 세포에 있는 1 차적인 고슴도치 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 방법을 보여줍니다.

과립 세포 전구체에서 1 차적인 실륨 의존적 신호 경로를 연구하는 효율적이고 비용 효율적인 전기 포기법

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

이 프로토콜은 1 차과립 세포 전구체 배양에서 1 차적인 cilium 의존적인 신호 통로의 분자 연구를 위한 간단한 체외 유전 수정 방법을 보여줍니다. 현재 의 경질 전환 방법의 비용, 낮은 생존력 및 효율성 저하로 인해, 우리는 1 차 적인 GCP 배양에서 cilium 의존적인 신호 경로를 조사하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 효율적인 전기 기법을 소개합니다. 우선, 코팅된 커버 슬립이 들어있는 24웰 배양판의 각 웰에 0.5 밀리리터의 배양 배지를 추가하고 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 따뜻하게 유지하십시오.필요한 수의 세포를 멸균 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 파이프하고 실온에서 5분 동안 200x G에서 회전합니다. 상체를 버리고 Opti-MEM의 200 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하십시오. 이 절차를 두 번 반복하여 잔류 배양 배지가 튜브에 존재하지 않도록 합니다.전자기화 매개 변수를 나열된 대로 설정합니다. 파이펫 은 전자 기화 반응을 부드럽게 잘 혼합하고 긴 P200 파이펫 팁을 사용하여 혼합물의 100 마이크로 리터의 정확한 부피를 2 밀리미터 갭 큐벳으로 전송합니다. 큐벳이 큐벳 챔버 내부에 들어가면 전기포레이터의 오메가 버튼을 누르고 100 마이크로리터의 정확한 볼륨을 고수하여 임피던스 값을 기록하십시오.임피던스 값의 범위는 약 30 및 35여야 합니다. 시작 버튼을 눌러 펄스를 시작합니다. 판독 프레임에 표시된 줄에 측정된 전류 값을 기록합니다.챔버에서 큐벳을 제거합니다. 즉시 100 마이크로리터의 미리 따뜻해지는 배양 배지를 큐벳에 넣고 2~3회 위아래로 피펫팅하여 재장매합니다. 셀 서스펜션을 이전에 준비한 24웰 플레이트로 즉시 전송합니다.이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음 날 형광 현미경의 밑에 세포를 관찰하십시오. 본 연구에서는, DMSO 및 SAG 처리군의 전기기화 효율이 비교되는 것으로 나타났다.1차 실슘 마커 Arl13b의 면역염색은 차량과 SAG 처리된 그룹 모두에서 배양의 div-2에서 GCP의 모양 속도를 입증한다. 섬광 속도는 div-2 후 전기포화에서 세포 표면에 1차 실슘을 베어링하는 GCP를 발현하는 Pax6의 백분율을 보여줍니다. 이 수치는 Pax6 발현 GCP 세포의 1차 실륨 액소네메에 대한 부드러운 EGFP 국소화가 SAG 후 24시간 동안 유의하게 증가하여 1차 고슴도치 신호 경로의 심오한 활성화를 나타낸다.더 높은 전기포기 효율을 달성하기 위해서는 사용되는 플라스미드의 고순도를 보장해야 하며, 잔류물 배양 매체는 플라스미드 전기포기 혼합물에 존재하지 않는다. 이 프로토콜은 뉴런과 인간이 유발한 만능 줄기 세포를 포함하여 트랜스펙트하기 어려운 1 차 배양 및 세포 유형에 대한 체외 유전자 변형 실험에 직접적으로 적용되고 유익해야 합니다.

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Alternative Signaling Routes in Gene Expression

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