Name: efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor
Uploaded: 2021-11-30T14:45:00
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Este estudio fue apoyado por HKBU Seed Fund y Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) a C.H.H. Hor.

Todos los procedimientos relacionados con los animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices de manejo de animales y el protocolo aprobado por el Departamento de Salud de Hong Kong. Las licencias de experimentación con animales siguiendo la Ordenanza de Animales (Control de Experimentos) (Cap. 340) se obtuvieron del Departamento de Salud del Gobierno de Hong Kong. El trabajo con animales se llevó a cabo de conformidad con la ética de seguridad animal aprobada por la Oficina de Investigación de HKBU y ...

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	<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atoh1+controls+primary+cilia+formation+to+allow+for+SHH-triggered+granule+neuron+progenitor+proliferation.">Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation.</a> Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).</li><li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum.">Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).</li><li>Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+signaling+is+required+for+expansion+of+granule+neuron+precursors+and+patterning+of+the+mouse+cerebellum.">Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum.</a> Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).</li><li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog.">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).</li><li>Bangs, F., Anderson, K. 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La transfección de transgenes en cultivo primario de GCP por electroporación se asocia típicamente con baja viabilidad celular y baja eficiencia de transfección9,10. Este documento presenta un protocolo de electroporación rentable y reproducible que ha demostrado una alta eficiencia y viabilidad. Además, también demostramos un método sencillo para estudiar la vía de señalización Hh dependiente del cilio primario en células GCP primarias.
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Los GCP cerebelosos son ampliamente utilizados para estudiar la maquinaria de la vía de señalización de Hh en tipos de células progenitoras neuronales debido a su alta abundancia y alta sensibilidad a la vía de señalización de Hh in vivo1,2,3,4. En los GCP, el cilio primario actúa como un centro de transducción de señal Hh fundamental5 que orquesta la proliferación de las células precursoras6,7,8. La visualización in vitro de los componentes de señalización de Hh en el cilio primario a menudo es un desafío debido a sus bajos niveles basales endógenos. Por lo tanto, la modificación transgénica de los niveles de expresión de proteínas y el marcado de fluoróforos del gen de interés son enfoques útiles para estudiar la vía a resolución molecular. Sin embargo, la manipulación genética de cultivos primarios de GCP utilizando enfoques de transfección basados en liposomas a menudo resulta en una baja eficiencia de transfección, lo que dificulta futuras investigaciones moleculares9. La electroporación aumenta la eficiencia, pero comúnmente requiere reactivos de electroporación exorbitantes específicos del proveedor y restringidos por el tipo de celda10.
Este artículo presenta un método de electroporación de alta eficiencia y rentable para manipular los componentes de la vía de señalización de Hh en cultivos primarios de GCP. Utilizando este protocolo de electroporación modificado, un transgén suavizado marcado con proteína fluorescente verde (GFP) (pEGFP-Smo) se administró de manera eficiente a los GCP y logró altas tasas de supervivencia y transfección celular (80-90%). Además, como lo demuestra la tinción inmunocitoquímica, los GCP transfectados mostraron una alta sensibilidad a la activación inducida por agonistas suavizados de la vía de señalización de Hh mediante el tráfico de EGFP-Smo a los cilios primarios. Este protocolo será directamente aplicable y beneficioso para los experimentos que impliquen la modificación genética in vitro de tipos de células que sean difíciles de transfectar, como los cultivos de células primarias humanas y de roedores, así como las células madre pluripotentes inducidas por humanos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>GCP Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer, 70 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I from bovine pancreas</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Earle&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>14155063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, qualified</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutamMAXTM-I ,100x</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>L-glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>354277</td>
			<td>Basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain,suspension</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11914-1</td>
			<td>Smoothened agonist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IF staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP-goat ab</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-101-215</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Arl13b mouse monoclonal ab</td>
			<td>NeuroMab</td>
			<td>75-287</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31573</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62247</td>
			<td>Dilution Factor: 1 : 1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CU 500 cuvette chamber</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CU500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EPA Electroporation cuvette (2 mm gap)</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>EC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Life Technologies LTD</td>
			<td>31985070</td>
			<td>reduced-serum medium for transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-mSmo</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>25395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>NEPA21</td>
			<td>electroporator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

efficient and cost effective electroporation method to study primary cilium-dependent signaling pathways in the granule cell precursor

El cilio primario es un orgánulo de señalización crítico que se encuentra en casi todas las células que transduce los estímulos de señalización de Hedgehog (Hh) desde la superficie celular. En el precursor de células granulares (GCP), el cilio primario actúa como un centro de señalización fundamental que orquesta la proliferación de células precursoras mediante la modulación de la vía de señalización de Hh. La investigación de la maquinaria de señalización de Hh dependiente del cilio primario se ve facilitada por la manipulación genética in vitro de los componentes de la vía para visualizar su localización dinámica en el cilio primario. Sin embargo, la transfección de transgenes en los cultivos primarios de GCP utilizando los métodos de electroporación actualmente conocidos es generalmente costosa y a menudo resulta en una baja viabilidad celular y una eficiencia de transfección indeseable. Este documento presenta un protocolo de electroporación eficiente, rentable y simple que demuestra una alta eficiencia de transfección de ~ 80-90% y una viabilidad óptima de la celda. Este es un método de modificación genética simple, reproducible y eficiente que es aplicable al estudio de la vía de señalización primaria de Hedgehog dependiente del cilio en cultivos primarios de GCP.

Utilizando el Opti-MEM (ver la Tabla de Materiales) como reactivo universal, esta metodología de electroporación propuesta podría lograr una eficiencia de electroporación consistentemente alta a ~ 80-90% (Figura 1). La eficiencia de electroporación del vector Smo-EGFP se determinó en DIV 2 después de la electroporación mediante la cuantificación del porcentaje de células verdes positivas para fluorescencia en todas las células GCP pareadas que expresan la proteín...

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Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

Aquí, presentamos un protocolo de electroporación in vitro reproducible para la manipulación genética de precursores primarios de células granulares cerebelosas (GCP) que es rentable, eficiente y viable. Además, este protocolo también demuestra un método sencillo para el estudio molecular de las vías de señalización de Hedgehog dependientes del cilio primario en células GCP primarias.

Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

Este protocolo demuestra un método sencillo de modificación genética in vitro para el estudio molecular de la vía de señalización primaria dependiente del cilio en los cultivos precursores de células gránulos primarias. Debido al costo, la baja viabilidad y la baja eficiencia del método de transfección actual, introducimos una técnica de electroporación simple, rentable y eficiente para investigar la vía de señalización dependiente del cilio en cultivos primarios de GCP. Para comenzar, agregue 0.5 mililitros de medio de cultivo en cada pozo de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene recubiertos de hojas de cubierta, y manténgala caliente a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono.Pipetear el número requerido de células en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y girar a 200x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 200 microlitros de Opti-MEM. Repita este procedimiento dos veces para asegurarse de que no haya medio de cultivo residual presente en el tubo.Establezca los parámetros de electroporación como se enumeran. Pipetee la reacción de electroporación suavemente para mezclar bien, y use una punta de pipeta P200 larga para transferir un volumen exacto de 100 microlitros de la mezcla a la cubeta de espacio de dos milímetros. Una vez que la cubeta esté dentro de la cámara de la cubeta, presione el botón omega del electroporador y anote el valor de impedancia adhiriéndose a un volumen preciso de 100 microlitros.El rango de valor de impedancia debe ser de aproximadamente 30 y 35. Pulse el botón de inicio para iniciar el pulso. Registre los valores de corriente medidos en julios que se muestran en el marco de lectura.Retire la cubeta de la cámara. Agregue inmediatamente 100 microlitros de medio de cultivo precalentado en la cubeta y vuelva a suspenderlo pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Transfiera inmediatamente la suspensión celular a la placa de 24 pocillos previamente preparada.Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Observe las células bajo el microscopio de fluorescencia al día siguiente. En el presente estudio, la eficiencia de electroporación de los grupos tratados con DMSO y SAG parecía comparable.La inmunotinción del marcador de cilio primario Arl13b demuestra que la tasa de ciliación de GCP en div-2 de cultivo tanto en el vehículo como en los grupos tratados con SAG. La tasa de ciliación ilustra el porcentaje de Pax6 que expresaN GCP con un cilio primario en la superficie de la celda en div-2 después de la electroporación. La figura muestra un aumento significativo en la localización de EGFP suavizada en el axonema primario de cilio de las células GCP de expresión pax6 a las 24 horas posteriores al tratamiento sag, lo que indica una activación profunda de la vía de señalización primaria del erizo dependiente del cilio.Para lograr una mayor eficiencia de electroporación, se debe garantizar una alta pureza del plásmido utilizado, y no hay medios de cultivo de residuos presentes en la mezcla de electroporación de plásmidos. Este protocolo debe ser directamente aplicable y beneficioso para los experimentos de modificación genética in vitro en cultivos primarios y tipos de células que son difíciles de transfectar, incluidas las neuronas y las células madre pluripotentes inducidas por humanos.

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