Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى Z-J L و OC V من المعاهد الوطنية للصحة [R01HL149452 و VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. كما نشكر مرفق الفحص المجهري والتصوير التابع لمشروع ميامي لعلاج الشلل في كلية الطب بجامعة ميامي على توفير إمكانية الوصول إلى برامج تحليل الصور ومعالجتها.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة في البروتوكول من قبل لجنة جامعة ميامي المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC). تم استخدام فئران FVB ، من الذكور والإناث ، الذين تتراوح أعمارهم بين 8-12 أسبوعا ، للدراسة.
1. إعداد حل L-NAME
<ol><li>في ظل ظروف معقمة في غطاء ا...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+density,+remodeling,+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains.">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).</li><li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).</li><li>Parikh, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+inducing+hind+limb+ischemia+in+mice+and+the+impact+of+these+variations+on+neovascularization+assessment.">Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+Versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Boden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+imaging+of+the+mouse+hindlimb+vasculature+using+the+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).</li><li>Elfarnawany, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+methods+for+quantitative+power+doppler+microvascular+angiography.">Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography.</a> Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).</li><li>Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+arterial+disease+in+patients+with+chronic+venous+insufficiency.">Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency.</a> Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Ammermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+chronic+venous+insufficiency+in+patients+with+peripheral+artery+disease:+Insights+from+MR+angiography.">Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography.</a> European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse.">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

في حين أن نقص تروية الأطراف الخلفية للفأر هو النموذج قبل السريري الأكثر استخداما على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية الجديدة في PAD و CLTI ، هناك تباين كبير في شدة نقص التروية والانتعاش اعتمادا على سلالة الفأر المحددة المستخدمة وموقع وعدد وطريقة تعطيل الشرايين. يمكن أن يؤدي الجمع بين ربط ال?...

يؤثر مرض الشرايين المحيطية (PAD)، الذي يتميز بانخفاض تدفق الدم إلى الأطراف بسبب تصلب الشرايين، على 6.5 مليون شخص في الولايات المتحدة و200 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1. المرضى الذين يعانون من PAD يعانون من انخفاض وظائف الأطراف ونوعية الحياة ، وأولئك الذين يعانون من CLTI ، وهو أشد أشكال PAD ، معرضون لخطر متزايد للبتر والوفاة بمعدل وفيات لمدة 5 سنوات يقترب من 50٪ 2. في الممارسة السريرية ، يعتبر المرضى الذين يعانون من مؤشرات الكاحل العضدي (ABI) <0.9 لديهم PAD ، وأولئك الذين يعانون من ABI <0.4 المرتبطة إما بألم الراحة أو فقدان الأنسجة على أنهم مصابون ب CLTI3. تختلف الأعراض بين المرضى الذين يعانون من ABIs مماثلة اعتمادا على النشاط اليومي ، وتحمل العضلات لنقص التروية ، والاختلافات التشريحية ، والاختلافات في التطور الجانبي4. الغرغرينا الرقمية والأطراف هي أشد مظاهر جميع أمراض انسداد الأوعية الدموية التي تؤدي إلى CLTI. وهو شكل من أشكال النخر الجاف الذي يحنط الأنسجة الرخوة. بالإضافة إلى PAD تصلب الشرايين ، يمكن ملاحظته أيضا في المرضى الذين يعانون من مرض السكري ، والأوعية الدموية مثل مرض بورغر وظاهرة رينود ، أو التأق التكلسي في وضع مرض الكلى في المرحلة النهائية5,6.
تم تطوير العديد من النماذج قبل السريرية لدراسة التسبب في PAD / CLTI واختبار فعالية العلاجات المحتملة ، وأكثرها شيوعا لا يزال نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران. عادة ما يتم تحقيق نقص تروية الأطراف الخلفية في الفئران عن طريق عرقلة تدفق الدم من الشرايين الحرقفية أو الفخذية، إما عن طريق ربط الخياطة أو التخثر الكهربائي أو غيرها من الوسائل لتضييق الوعاء المطلوب7. هذه التقنيات تقلل بشكل كبير من التروية إلى الطرف الخلفي وتحفز الأوعية الدموية الجديدة في عضلات الفخذ والساق. ومع ذلك ، هناك اختلافات أساسية تعتمد على سلالة الفئران في الحساسية للإهانة الإقفارية جزئيا بسبب الاختلافات التشريحية في التوزيع الجانبي8,9. على سبيل المثال، الفئران C57BL/6 مقاومة نسبيا لنقص تروية الأطراف الخلفية، مما يدل على انخفاض وظيفة الأطراف ولكن عموما لا يوجد دليل على وجود الغرغرينا في وسادة القدم. من ناحية أخرى ، فإن الفئران BALB / c لديها قدرة ضعيفة بطبيعتها على التعافي من نقص التروية وعادة ما تتطور إلى البتر التلقائي للقدم أو أسفل الساق بعد ربط الشريان الفخذي وحده. هذه الاستجابة الشديدة لنقص التروية تضيق النافذة العلاجية ويمكن أن تمنع التقييم الطولي لتروية الأطراف ووظيفتها. ومن المثير للاهتمام أن الاختلافات الجينية في موضع سمة كمية واحدة تقع على كروموسوم الفئران الفئران 7 قد تورطت في هذه الحساسيات التفاضلية للفئران C57BL/6 و BALB / c لنخر الأنسجة وتروية الأطراف10.
بالمقارنة مع سلالات C57BL/6 و BALB / c ، تظهر فئران FVB استجابة وسيطة ولكنها غير متسقة لربط الشريان الفخذي وحده. تصاب بعض الحيوانات بغرغرينا وسادة القدم في شكل أظافر إقفارية سوداء أو أرقام محنطة ، ولكن البعض الآخر دون أي علامات علنية على نقص التروية11. الإدارة المصاحبة لهيدروكلوريد ميثيل استر Nω-Nitro-L-arginine (L-NAME) ، وهو مثبط لأكسيد النيتريك (NOS) 12 ، يمنع آليات توسيع الأوعية التعويضية ويزيد من الإجهاد التأكسدي في أنسجة الأطراف الخلفية. بالاقتران مع ربط الشريان الفخذي أو تخثره ، ينتج عن هذا النهج باستمرار فقدان أنسجة وسادة القدم في فئران FVB التي تشبه التغيرات الضمورية في CLTI ولكنها نادرا ما تتطور إلى البتر التلقائي للأطراف11. الإجهاد التأكسدي هو أحد السمات المميزة ل PAD / CLTI وينتشر عن طريق الخلل البطاني وانخفاض التوافر البيولوجي لأكسيد النيتريك (NO) 13,14. NO هو جزيء متعدد القدرات يمارس عادة تأثيرات مفيدة على تدفق الدم الشرياني والشعري ، والتصاق الصفائح الدموية وتجميعها ، وتجنيد الكريات البيض وتنشيطها 13. كما ثبت أن المستويات المنخفضة من NOS تنشط الإنزيم المحول للأنجيوتنسين ، والذي يحفز الإجهاد التأكسدي ويسرع تطور تصلب الشرايين15.
بمجرد إنشاء نموذج لنقص تروية الأطراف الخلفية ، هناك حاجة أيضا إلى مراقبة إعادة تروية الأطراف اللاحقة والتأثير العلاجي لأي علاجات محتملة. في نموذج غرغرينا الفئران المقترح ، يمكن أولا تحديد درجة فقدان الأنسجة باستخدام درجة Faber لتقييم المظهر الإجمالي للقدم (0: طبيعي ، 1-5: فقدان الأظافر حيث تمثل النتيجة عدد الأظافر المتأثرة ، 6-10: ضمور الأرقام حيث تمثل النتيجة عدد الأرقام المتأثرة ، 11-12: ضمور القدم الجزئي والكامل ، على التوالي)9. ثم يتم إجراء القياسات الكمية لتروية الأطراف الخلفية عادة باستخدام LDPI ، والذي يعتمد على تفاعلات دوبلر بين ضوء الليزر وخلايا الدم الحمراء للإشارة إلى التروية على مستوى البكسل في منطقة ذات أهمية (ROI)16. في حين أن هذه التقنية كمية وغير غازية ومثالية للقياسات المتكررة، إلا أنها لا توفر تفاصيل تشريحية دقيقة للأوعية الدموية للأطراف الخلفية16. أما طرائق التصوير الأخرى، مثل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (micro-CT)، وتصوير الأوعية بالرنين المغناطيسي (MRA)، وتصوير الأوعية بالأشعة السينية، فتثبت أنها إما مكلفة، وتتطلب أجهزة متطورة، أو أنها تشكل تحديا تقنيا16. في عام 2008 ، وصف لي وآخرون تقنية لوضع العلامات على الأوعية الدموية داخل شبكية العين باستخدام صبغة الكربوسيانين المحبة للدهون DiI17. يدمج DiI في الخلايا البطانية ، وعن طريق الانتشار المباشر ، يصبغ هياكل الأغشية الوعائية مثل البراعم الوعائية والعمليات الزائفة17،18. نظرا لتوصيله المباشر إلى الخلايا البطانية والطبيعة الفلورية العالية للصبغة ، يوفر هذا الإجراء وضع علامات مكثفة وطويلة الأمد على الأوعية الدموية. في عام 2012 ، قام Boden et al. بتكييف تقنية تروية DiI مع نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية الفئران عبر تصوير كامل لعضلات الفخذ المقربة التي تم حصادها بعد ربط الشريان الفخذي 19.
توفر الطريقة الحالية طريقة غير مكلفة نسبيا وممكنة تقنيا لتقييم الأوعية الدموية الجديدة استجابة لنقص تروية الأطراف الخلفية والعلاجات القائمة على الجينات أو الخلايا. في مزيد من التكيف ، يصف هذا البروتوكول تطبيق تروية DiI لتصوير الأوعية الدموية وسادة القدم بدقة عالية و 3D في نموذج الفئران من الغرغرينا الخلفية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

يعد مرض الشرايين المحيطية (PAD) سببا مهما للمراضة الناتجة عن التعرض المزمن لعوامل الخطر لتصلب الشرايين. يواجه المرضى الذين يعانون من أشد أشكاله ، نقص التروية المزمن الذي يهدد الأطراف (CLTI) ، إعاقات كبيرة في الحياة اليومية ، بما في ذلك الألم المزمن ، ومسافة المشي المحدودة دون ألم ، والجروح غير الشافية. تم تطوير نماذج ما قبل السريرية في مختلفة لدراسة PAD ، لكن نقص تروية الأطراف الخلفية للفئران لا يزال الأكثر استخداما. يمكن أن يكون هناك تباين كبير في الاستجابة للإهانة الإقفارية في هذه النماذج اعتمادا على سلالة الماوس المستخدمة وموقع ورقم ووسائل تعطيل الشرايين. يصف هذا البروتوكول طريقة فريدة تجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك (NOS) للحث بشكل موثوق على غرغرينا وسادة القدم في الفئران Friend Virus B (FVB) التي تشبه فقدان الأنسجة من CLTI. في حين أن الوسائل التقليدية لتقييم التروية مثل التصوير بالليزر دوبلر التروية (LDPI) لا تزال موصى بها ، فإن التروية داخل القلب للصبغة المحبة للدهون 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) تستخدم لتسمية الأوعية الدموية. يسمح الفحص المجهري اللاحق بالليزر متحد البؤرة كامل التركيب بإعادة بناء عالية الدقة ثلاثية الأبعاد (3D) لشبكات الأوعية الدموية في وسادة القدم التي تكمل الوسائل التقليدية لتقييم التروية في نماذج نقص تروية الأطراف الخلفية.

يفصل هذا البروتوكول وسيلة موثوقة للحث على نقص التروية وفقدان الأنسجة في وسادة القدم الفئرانية باستخدام مزيج من تخثر الشريان الفخذي والوريد مع إدارة L-NAME ، وهو مثبط سينثاز أكسيد النيتريك ، في الفئران FVB الحساسة. يفصل الشكل 1 تشريح الأوعية الدموية للطرف الخلفي الفئراني ويشير...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

يصف هذا البروتوكول نموذجا فريدا ذا صلة سريرية لأمراض الشرايين الطرفية يجمع بين التخثر الكهربائي للشريان الفخذي والوريد مع إعطاء مثبط سينثاز أكسيد النيتريك للحث على الغرغرينا الخلفية في فئران FVB. ثم يتم استخدام التروية DiI داخل القلب للتصوير عالي الدقة ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية لوسادة القدم.

تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأوعية الدموية لوسادة القدم في نموذج غرغرينا Murine Hindlimb

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

يقدم هذا البروتوكول كيفية إنشاء نموذج غرغرينا وسادة قدم الفأر باستخدام إدارة مثبط الكتلة وتخثر الشريان الفخذي. ثم يسمح التروية DiI بتصور عالي الدقة للأوعية الدموية لوسادة القدم. هذا النموذج مناسب سريريا ويمكن استخدامه لاختبار الأدوية قبل السريرية ولدراسة نقص تروية الأطراف.يوفر التصور عالي الدقة للأوعية الدموية وسيلة سهلة تقنيا لتقييم الأوعية الدموية الجديدة. يحتوي نموذج الغرغرينا وسادة القدم هذا على تطبيقات مهمة في الأبحاث قبل السريرية لأمراض الشرايين الطرفية ونقص تروية الأطراف الحرجة. DiI perfusion هي أداة مفيدة لدراسة الأوعية الدموية الجديدة في النماذج الحيوانية.سيوضح الإجراء أنطوان ريبيراس ، من المقيم الجراحي ، ويوليكسي أورتيز ، وهو باحث مشارك من مختبري. أولا ، اجعل حل DiI يعمل عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من محلول مخزون DiI إلى 10 ملليلتر من محلول مخفف يعمل مباشرة قبل الاستخدام. رجه باليد حتى يمتزج جيدا.قم بتوصيل اثنين أو ثلاثة من أجهزة التوقف ثلاثية الاتجاهات وإبرة فراشة قياس 25 في سلسلة. تحضير محاقن 10 ملليلتر مع أربعة ملليلترات من PBS ، و 10 ملليلتر من محلول DiI ، و 10 ملليلتر من الفورمالين المخزن مؤقتا بنسبة 10٪. قم بتوصيل المحقنة بالفورمالين بمنفذ التدفق القريب وحقن المحلول لطرد الهواء من الخط.ثم أدر مفتاح التوقف لإغلاق المنفذ. كرر نفس الإجراء ، وقم بتوصيل المحاقن ب DiI ثم PBS بمنافذ التدفق المتوسطة والبعيدة على التوالي. بعد القتل الرحيم ، ضع الحيوان في وضع ضعيف على وسادة ماصة وقم بتأمين الإبطين والأطراف السفلية بالإبر.باستخدام المقص ، قم بعمل شق عرضي لفتح تجويف البطن ، ثم قم بكشف وتقسيم الحجاب الحاجز الأيسر والأيمن للوصول إلى التجويف الصدري. قطع جدار الصدر على جانبي القص من الأضلاع السفلية إلى الأضلاع الأولى أو الثانية. استخدم مرقئ للاستيلاء على الطرف السفلي من القص وعكسه نحو رأس الحيوان لفضح التجويف الصدري.حدد البطين الأيسر، الذي يبدو أفتح لونا من الأيمن. أمسك القلب بلطف باستخدام ملقط حاد وأدخل إبرة الفراشة في البطين الأيسر. استخدم مقص أو إبرة قياس 18 لثقب الأذين الأيمن ، مما يسمح لمحاليل الدم والتروية بالعودة إلى القلب لتصريفها.افتح منفذ المحقنة باستخدام PBS وحقن اثنين إلى أربعة ملليلتر يدويا بمعدل ملليلتر إلى ملليلتر في الدقيقة لمدة دقيقة إلى دقيقتين لطرد الدم من نظام الأوعية الدموية. ضمان التروية الناجحة من خلال مراقبة النزيف من الأذين الأيمن. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة PBS.افتح منفذ المحقنة باستخدام DiI وحقن خمسة إلى 10 ملليلتر بمعدل ملليلتر إلى ملليلتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد الحقن ، أغلق منفذ حقنة DiI وانتظر لمدة دقيقتين للسماح بدمج الصبغة قبل حقن المثبت. افتح منفذ المحقنة بالفورمالين وحقن خمسة إلى 10 ملليلتر بمعدل ملليلتر إلى ملليلتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق.بعد الحقن ، قم بإزالة الإبرة من البطين الأيسر. باستخدام مقص ثقيل ، قم بخلع الساق عند الكاحل ، وفصل القدمين اليسرى واليمنى تماما عن أسفل الساقين. ضع القدمين المحصودين في طبق بئر 12 مع واحد إلى ملليلتر من محلول الفورمالين بنسبة 10٪.لف الطبق بورق القصدير وخزنه عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، استبدل المحلول المثبت في صفيحة بئر 12 بملليلتر إلى ملليلتر من PBS لكل بئر. قم بعمل شق طولي باستخدام مشرط على الجزء الأخمصي والظهري من القدم.ثم باستخدام ملقط مسنن ومرقئ صغير ، قم بإزالة جميع الجلد بعناية من القدم والأرقام ، دون إتلاف الأنسجة الرخوة الكامنة. لتركيب الأنسجة ، ضع القدمين بشكل فردي بين شريحتين مجهريتين زجاجيتين مع وسادة خزعة رغوية مطوية فوق نفسها في كل طرف. استخدم مشبكين صغيرين لضغط الشرائح الزجاجية معا في كل نهاية.بدلا من ذلك ، أعد وسادة القدم إلى صفيحة بئر 12 مع واحد إلى ملليلتر من PBS. بعد تغطيته بورق القصدير ، قم بتخزينه عند أربع درجات مئوية للحفاظ على التألق لمدة تصل إلى شهر واحد. قم بتشغيل نظام التصوير وبدء تشغيل برنامج الاكتساب واستخدام هدف تكبير منخفض أو فتحة رقمية منخفضة لالتقاط الصور.انقر فوق نعم إلى مربع حوار تنشيط المرحلة. قم بتنشيط ليزر 561 نانومتر في علامة تبويب التكوين. على الشاشة الرئيسية ، قم بتنشيط مسار شعاع مرئي بالنقر فوق الزر المرئي.اضبط كاشفا على نطاق 570 إلى 600 نانومتر بالنقر فوق خانة الاختيار النشطة المقابلة. حدد أيقونة مسح البلاط ضوئيا في علامة تبويب الاكتساب وقم بتعيين الدقة المطلوبة. ضع عينة الأنسجة المثبتة الجافة المضغوطة بين الشرائح الزجاجية على مرحلة المجهر وجلب الأنسجة إلى التركيز.انتقل إلى زاوية واحدة من العينة. ضمن قائمة مسح البلاط ، انقر فوق الزر وضع علامة. انتقل إلى الزاوية المقابلة وانقر على زر موضع العلامة مرة أخرى بتعيين حدود المسح.لتعيين عمق مكدس Z ، انقر فوق الزر المباشر. انتقل إلى وسط العينة واستخدم مقبض المحور z للتمرير إلى أسفل العينة. في علامة التبويب الاستحواذ ضمن قائمة Z-stack ، انقر فوق الزر "ابدأ".مرر إلى أعلى العينة وانقر على زر الإنهاء. انقر فوق حجم z-step واضبطه على القيمة المطلوبة. ثم انقر فوق ابدأ لبدء الحصول على الصور.يوضح الشكل التباين في فقدان الأنسجة الذي يمكن توقعه من هذا النموذج بعد أسبوع واحد من الجراحة مع تسجيل درجات FABER في الزاوية اليمنى السفلى من كل صورة. تكشف صور الفحص المجهري لإعادة البناء عن تشريح الأوعية الدموية الطبيعي في وسادة القدم الضابطة غير المربوطة مقارنة بالتروية المتناقصة بشدة إلى وسادة القدم في الطرف الخلفي المربوط بعد خمسة أيام من الجراحة. بعد 20 يوما من الجراحة ، تحسنت التروية إلى وسادة القدم بشكل كبير ، وإن لم يكن إلى حد التحكم غير المربوط.يوضح الفيديو أنه تم إنشاء عرض السطح بعد ذلك باستخدام وظيفة الرسوم المتحركة. اغسل جميع فقاعات الهواء من مجموعة التروية. إذا توسعت الرئتين وتحولت إلى اللون الوردي أثناء التروية ، فقد اخترقت الإبرة البطين الأيمن ويجب سحبها قليلا.يمكن استخدام أنسجة الأطراف للتلطيخ المناعي لتقييم نخر العضلات ، وتجديد الأنسجة ، وكثافة الأوعية الدموية ، وتجنيد الخلايا السلفية ، وخلايا إصلاح الأنسجة الأخرى. تم استخدام تقنية التروية DiI في نموذج الغرغرينا الفئرانية هذا في دراسات العلاجات الجينية والخلوية. يهدف البحث إلى تحسين التروية في أطراف المرضى الذين يعانون من نقص تروية الأطراف الحرجة.

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

نموذج الفئران من زرع دعامات في الشريان السباتي لدراسة عودة التضيق

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

التصوير ثلاثي الأبعاد من مسبب الألياف العصبية داخل البشرة في خزعات الجلد البشري

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

ناضح تسليم المخدرات إلى Hindlimbs الدماغية ونضح من الأوعية الدموية مع Microfil للمشاريع المتناهية الصغر التصوير المقطعي التصوير

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

الكمي لسرطان الثدي الغزو خلية باستخدام ثلاثي الأبعاد (3D) نموذج

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

ثلاثي الأبعاد نموذج المشارك الثقافة ل-ورم انسجة التفاعل

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

تقييم الكهربية من مورين الاذينين مع رسم الخرائط الضوئية عالية الدقة

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

تقييم تكوين الأوعية العلاجية في نموذج مورين من نقص التروية الخلفية

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...