Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud til Z-J L og OC V fra National Institutes of Health [R01HL149452 og VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Vi takker også Mikroskopi og Imaging Facility i Miami Project to Cure Paralysis ved University of Miami School of Medicine for at give adgang til deres billedanalyse- og behandlingssoftware.

Alle dyreforsøg beskrevet i protokollen blev godkendt af University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-mus, både han- og hunmus, i alderen 8-12 uger, blev brugt til undersøgelsen.
1. Fremstilling af L-NAME-opløsning
<ol><li>Under sterile forhold i en laminær flowhætte fremstilles en L-NAME-stamopløsning ved at opløse 1 g L-NAME-pulver (se materialetabellen) med 20 ml sterilt vand for at fremstille en opløsning på 50 m...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+density,+remodeling,+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains.">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).</li><li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).</li><li>Parikh, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+inducing+hind+limb+ischemia+in+mice+and+the+impact+of+these+variations+on+neovascularization+assessment.">Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+Versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Boden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+imaging+of+the+mouse+hindlimb+vasculature+using+the+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).</li><li>Elfarnawany, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+methods+for+quantitative+power+doppler+microvascular+angiography.">Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography.</a> Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).</li><li>Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+arterial+disease+in+patients+with+chronic+venous+insufficiency.">Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency.</a> Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Ammermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+chronic+venous+insufficiency+in+patients+with+peripheral+artery+disease:+Insights+from+MR+angiography.">Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography.</a> European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse.">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

Mens musehælkæmi er den mest anvendte prækliniske model til at studere neovaskularisering i PAD og CLTI, er der signifikant variation i iskæmi sværhedsgrad og genopretning afhængigt af den specifikke musestamme, der anvendes, og stedet, antallet og metoden til arteriel forstyrrelse. Kombinationen af lårbensarterieligation og IP-administration af L-NAME kan pålideligt inducere bagbengangren i FVB-mus11. Den samme behandling resulterer i bagbensiskæmi uden vævstab hos C57BL/6-mus, mens aut...

Perifer arteriel sygdom (PAD), der er karakteriseret ved nedsat blodgennemstrømning til ekstremiteterne på grund af aterosklerose, påvirker 6,5 millioner mennesker i USA og 200 millioner mennesker over hele verden1. Patienter med PAD oplever nedsat lemfunktion og livskvalitet, og dem med CLTI, den mest alvorlige form for PAD, har øget risiko for amputation og død med en 5-årig dødelighed, der nærmer sig 50%2. I klinisk praksis anses patienter med ankel-brachiale indekser (ABI) <0,9 for at have PAD, og dem med ABI <0,4 forbundet med enten hvilesmerter eller vævstab som havende CLTI3. Symptomerne varierer blandt patienter med lignende ABI'er afhængigt af daglig aktivitet, muskeltolerance over for iskæmi, anatomiske variationer og forskelle i sikkerhedsudvikling4. Ciffer og lemmer koldbrand er den mest alvorlige manifestation af alle vaskulære okklusive sygdomme, der resulterer i CLTI. Det er en form for tør nekrose, der mumificerer det bløde væv. Ud over aterosklerotisk PAD kan det også observeres hos patienter med diabetes, vaskulitider såsom Buerger's sygdom og Raynauds fænomen eller calciphylaxis i indstillingen af nyresygdom i slutstadiet5,6.
Flere prækliniske modeller er blevet udviklet til at studere patogenesen af PAD / CLTI og teste effekten af potentielle behandlinger, hvoraf den mest almindelige forbliver musehælkæmi. Inducerende bagbensiskæmi hos mus opnås typisk ved obstruktion af blodgennemstrømningen fra iliac- eller lårbensarterierne, enten ved suturligation, elektrokoagulation eller andre midler til at indsnævre det ønskede kar7. Disse teknikker reducerer drastisk perfusion til bagbenet og stimulerer neovaskularisering i lår- og lægmusklerne. Der er dog væsentlige murine-stammeafhængige forskelle i følsomhed over for iskæmisk fornærmelse, delvis på grund af anatomiske forskelle i sikkerhedsfordeling8,9. For eksempel er C57BL/6-mus relativt resistente over for bagbensiskæmi, hvilket viser nedsat lemfunktion, men generelt ingen tegn på koldbrand i fodpuden. På den anden side har BALB / c-mus en iboende dårlig kapacitet til at komme sig efter iskæmi og udvikler typisk auto amputation af foden eller underbenet efter lårbensarterieligation alene. Denne alvorlige reaktion på iskæmi indsnævrer det terapeutiske vindue og kan udelukke langsgående vurdering af lemmer reperfusion og funktion. Interessant nok har genetiske forskelle i et enkelt kvantitativt træk locus placeret på murinkromosom 7 været impliceret i disse differentielle modtageligheder af C57BL/6 og BALB/c mus til vævsnekrose og lemmer reperfusion10.
Sammenlignet med C57BL/6 og BALB/c stammer viser FVB-mus et mellemliggende, men inkonsekvent respons på lårbensarterieligation alene. Nogle dyr udvikler gangren i form af sorte iskæmiske negle eller mumificerede cifre, mens andre uden åbenlyse tegn på iskæmi11. Samtidig administration af Nω-Nitro-L-argininmethylesterhydrochlorid (L-NAME), en nitrogenoxidsyntase (NOS)-hæmmer12, forhindrer kompenserende vasodilatoriske mekanismer og øger yderligere oxidativt stress i bagbensvæv. I kombination med lårbensarterieligation eller koagulation producerer denne tilgang konsekvent fodpudevævstab hos FVB-mus, der ligner de atrofiske ændringer af CLTI, men sjældent udvikler sig til lemmer auto-amputation11. Oxidativ stress er et af kendetegnene ved PAD / CLTI og formeres af endoteldysfunktion og nedsat biotilgængelighed af nitrogenoxid (NO) 13,14. NO er et pluripotent molekyle, der normalt udøver gavnlige virkninger på arteriel og kapillær blodgennemstrømning, blodpladeadhæsion og aggregering og leukocytrekruttering og aktivering13. Reducerede niveauer af NOS har også vist sig at aktivere det angiotensinkonverterende enzym, som inducerer oxidativt stress og fremskynder udviklingen af åreforkalkning15.
Når en model af bagbensiskæmi er etableret, er der også behov for overvågning af efterfølgende lemmereperfusion og den terapeutiske virkning af eventuelle behandlinger. I den foreslåede murinegangrenmodel kan graden af vævstab først kvantificeres ved hjælp af Faber-scoren til vurdering af fodens bruttoudseende (0: normal, 1-5: tab af negle, hvor score repræsenterer antallet af berørte negle, 6-10: atrofi af cifre, hvor score repræsenterer antallet af berørte cifre, 11-12: delvis og fuldstændig fodatrofi, henholdsvis)9. Kvantitative målinger af bagbensperfusion foretages derefter typisk ved hjælp af LDPI, som er afhængig af Doppler-interaktioner mellem laserlys og røde blodlegemer for at indikere perfusion på pixelniveau i en region af interesse (ROI)16. Selvom denne teknik er kvantitativ, ikke-invasiv og ideel til gentagne målinger, giver den ikke granulære anatomiske detaljer i bagbensvaskulaturen16. Andre billeddannelsesmetoder, såsom mikrocomputertomografi (mikro-CT), magnetisk resonansangiografi (MRA) og røntgenmikroangiografi, viser sig enten at være dyre, kræver sofistikeret instrumentering eller på anden måde teknisk udfordrende16. I 2008 beskrev Li et al. en teknik til mærkning af blodkar i nethinden med det lipofile carbocyaninfarvestof DiI17. DiI inkorporerer i endotelceller og pletter ved direkte diffusion vaskulære membranstrukturer såsom angiogene spirer og pseudopodale processer17,18. På grund af dets direkte levering til endotelceller og farvestoffets stærkt fluorescerende karakter giver denne procedure intens og langvarig mærkning af blodkar. I 2012 tilpassede Boden et al. teknikken diI-perfusion til murine hindlimb iskæmi-modellen via helmonteret billeddannelse af høstede lår adduktormuskler efter lårbensarterieligation19.
Den nuværende metode giver en relativt billig og teknisk gennemførlig måde at vurdere neovaskularisering som reaktion på bagbensiskæmi og gen- eller cellebaseret terapi. I en yderligere tilpasning beskriver denne protokol anvendelsen af DiI-perfusion til at afbilde fodpudevaskulaturen i høj opløsning og 3D i en murinmodel af bagbengangren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

Perifer arteriel sygdom (PAD) er en væsentlig årsag til sygelighed som følge af kronisk eksponering for aterosklerotiske risikofaktorer. Patienter, der lider af sin mest alvorlige form, kronisk lemmer-truende iskæmi (CLTI), står over for betydelige svækkelser i dagligdagen, herunder kroniske smerter, begrænset gåafstand uden smerte og nonhealing sår. Prækliniske modeller er blevet udviklet i forskellige dyr for at studere PAD, men musehænglet iskæmi er fortsat den mest anvendte. Der kan være betydelig variation som reaktion på iskæmisk fornærmelse i disse modeller afhængigt af den anvendte musestamme og stedet, antallet og midlerne til arteriel forstyrrelse. Denne protokol beskriver en unik metode, der kombinerer lårbensarterie og veneelektrokoagulering med administration af en nitrogenoxidsyntase (NOS) hæmmer for pålideligt at inducere fodpudegangren i Friend Virus B (FVB) mus, der ligner vævstabet af CLTI. Mens traditionelle midler til vurdering af reperfusion såsom laser Doppler perfusionsbilleddannelse (LDPI) stadig anbefales, anvendes intrakardiel perfusion af det lipofile farvestof 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) til at mærke vaskulaturen. Efterfølgende helmonteret konfokal laserscanningsmikroskopi muliggør højopløselig, tredimensionel (3D) rekonstruktion af fodpudevaskulære netværk, der supplerer traditionelle midler til vurdering af reperfusion i bagbensiskæmimodeller.

Denne protokol beskriver et pålideligt middel til at inducere iskæmi og vævstab i murinefodpuden ved hjælp af en kombination af lårbensarterie og venekoagulation med L-NAME-administration, en nitrogenoxidsyntasehæmmer, i modtagelige FVB-mus. Figur 1 beskriver anatomien af murine bagben vaskulatur og angiver stederne for lårbensarterien og venekoagulation (gul X), lige proksimal til den laterale circumflex lårbensarterie (LCFA) og proksimal til saphenopopliteal krydset. LCFA skal iden...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Den nuværende protokol beskriver en unik, klinisk relevant model af perifer arteriel sygdom, der kombinerer lårbensarterie og veneelektrokoagulering med administration af en nitrogenoxidsyntasehæmmer for at inducere bagbengangren i FVB-mus. Intrakardial DiI-perfusion anvendes derefter til tredimensionel billeddannelse i høj opløsning af fodpudens vaskulatur.

Tredimensionel billeddannelse i høj opløsning af fodpudevaskulaturen i en Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Denne protokol præsenterer, hvordan man opretter en musefodpude gangrenmodel ved hjælp af administration af massehæmmer og lårbensarteriekoagulation. DiI-perfusion giver derefter mulighed for visualisering i høj opløsning af fodpudevaskulaturen. Denne model er klinisk relevant og kan bruges til præklinisk lægemiddeltest og til at studere lemmeriskæmi.Visualisering af vaskulatur i høj opløsning tilbyder et teknisk let middel til vurdering af neovaskularisering. Denne fodpude koldbrandmodel har vigtige anvendelser i præklinisk forskning i perifer arteriel sygdom og kritisk lemmeriskæmi. DiI-perfusion er et nyttigt værktøj til at studere neovaskularisering i dyremodeller.Demonstrerende proceduren vil være Antoine Ribieras, af kirurgisk beboer, og Yulexi Ortiz, en forskningsassistent fra mit laboratorium. Lav først DiI-arbejdsløsning ved at tilføje 200 mikroliter DiI-stamopløsning til 10 ml af arbejdsfortyndingsopløsningen umiddelbart før brug. Ryst i hånden for at blande godt.Tilslut to eller tre trevejs stophaner og en 25 gauge sommerfuglnål i serie. Forbered 10 ml sprøjter med fire ml PBS, 10 ml DiI-opløsning og 10 ml 10% neutral bufret formalin. Tilslut sprøjten med formalin til den proksimale tilstrømningsport, og injicer opløsningen for at skylle luft fra linjen.Drej derefter stophanen for at lukke porten. Gentag den samme procedure, og tilslut sprøjterne med DiI og derefter PBS til henholdsvis de midterste og distale tilstrømningsporte. Efter eutanasi skal du placere dyret i liggende stilling på en absorberende pude og sikre axillae og underekstremiteter med nåle.Brug en saks til at lave et tværgående snit for at åbne bukhulen, og udsæt og del derefter venstre og højre membran for at få adgang til brysthulen. Skær brystvæggen på hver side af brystbenet fra de nederste ribben til det første eller andet ribben. Brug en hæmostat til at gribe fat i den nedre ende af brystbenet og reflektere det mod dyrets hoved for at udsætte brysthulen.Identificer venstre ventrikel, som ser lysere ud i farven end den højre. Tag forsigtigt fat i hjertet med stump tang og indsæt sommerfuglnålen i venstre ventrikel. Brug en saks eller en 18 gauge nål til at punktere det højre atrium, så blod og perfusionsopløsninger kan vende tilbage til hjertet for at dræne.Åbn sprøjtens port med PBS, og injicer manuelt to til fire milliliter med en hastighed på en til to milliliter i minuttet i et til to minutter for at skylle blod fra det vaskulære system. Sørg for vellykket perfusion ved at observere blødning fra højre atrium. Efter injektion skal du lukke porten på PBS-sprøjten.Åbn sprøjtens port med DiI og injicer fem til 10 ml med en hastighed på en til to milliliter i minuttet i fem minutter. Efter injektion skal du lukke porten til DiI-sprøjten og vente i to minutter for at tillade inkorporering af farvestoffet før injektion af fikseringsmiddel. Åbn sprøjtens port med formalin og injicer fem til 10 ml med en hastighed på en til to milliliter i minuttet i fem minutter.Efter injektion skal du fjerne nålen fra venstre ventrikel. Brug en tung saks til at forskyde skinnebenet ved anklen og adskille venstre og højre fod helt fra underbenene. Anbring høstede fødder i en 12 brøndplade med en til to ml 10% formalinopløsning.Pak pladen ind med folie og opbevar den ved fire grader Celsius natten over. Den næste dag udskiftes fikseringsopløsningen i en 12 brøndplade med en til to ml PBS pr. Brønd. Lav et langsgående snit med en skalpel på plantar og dorsal del af foden.Brug derefter tandpincet og en lille hæmostat, fjern forsigtigt al hud fra foden og cifrene og beskadiger ikke det underliggende bløde væv. For at montere væv skal du placere fødderne individuelt mellem to glasmikroskopdias med en skumbiopsipude foldet over sig selv i hver ende. Brug to små bindemiddelclips til at komprimere glasglider sammen i hver ende.Alternativt kan du returnere fodpuden til en 12 brøndplade med en til to milliliter PBS. Efter at have dækket det med folie, skal du opbevare det ved fire grader Celsius for at opretholde fluorescens i op til en måned. Tænd for billedbehandlingssystemet, start anskaffelsessoftwaren, og brug målsætningen lav forstørrelse eller lav numerisk blænde til at tage billeder.Klik på ja til dialogboksen Aktivér fase. Aktivér 561 nanometer-laseren på konfigurationsfanen. På hovedskærmen skal du aktivere en synlig strålesti ved at klikke på den synlige knap.Indstil en detektor til området 570 til 600 nanometer ved at klikke på det tilsvarende aktive afkrydsningsfelt. Vælg ikonet for flisescanning under fanen Anskaffelse, og indstil den ønskede opløsning. Placer tørmonteret vævsprøve komprimeret mellem glasdias på mikroskopstadiet og bring vævet i fokus.Naviger til et hjørne af prøven. Klik på knappen Markér position under flisescanningsmenuen. Naviger til det modsatte hjørne, og klik på knappen Markér position igen og sæt scanningsgrænserne.For at indstille dybden af Z-stakken skal du klikke på live-knappen. Naviger til midten af prøven, og brug z-akseknappen til at rulle igennem til bunden af prøven. På fanen Erhvervelse under Z-stack-menuen skal du klikke på startknappen.Rul gennem til toppen af eksemplet, og klik på slutknappen. Klik på z-trinstørrelsen og indstil til den ønskede værdi. Klik derefter på start for at begynde billedoptagelse.Figuren viser den variation i vævstab, der kan forventes af denne model en uge efter operationen med FABER-score registreret i nederste højre hjørne af hvert billede. Rekonstruktion mikroskopi billeder afslører normal vaskulær anatomi i ikke-ligeret kontrol fodpude sammenlignet med alvorligt nedsat perfusion til fodpuden af ligeret bagben fem dage efter operationen. 20 dage efter operationen er perfusion til fodpuden signifikant forbedret, men ikke i det omfang, det er ikke i det omfang, det ikke er ligeret kontrol.Videoen viser, at overfladegengivelse derefter blev oprettet ved hjælp af animationsfunktionaliteten. Skyl alle luftbobler fra perfusionsenheden. Hvis lungerne udvides og bliver lyserøde under perfusion, har nålen trængt ind i højre ventrikel og skal trækkes lidt tilbage.Limbvæv kan bruges til immunstaining til vurdering af muskelnekrose, vævsregenerering, kardensitet og rekruttering af stamceller og andre vævsreparationsceller. Teknikken til DiI-perfusion i denne murine koldbrandmodel er blevet anvendt i undersøgelser af gen- og celleterapier. Forskningen har til formål at forbedre perfusion i lemmer hos patienter med kritisk lemmeriskæmi.

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Humane Neuroendokrine tumorcellelinier som en tredimensional model for studiet af den menneskelige Neuroendokrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

En musemodel af Stent Implantation i halspulsåren for Studiet af Restenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Tre-dimensionel Imaging af Nociceptive Intraepidermal nervefibre i Human hudbiopsier

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotisk Drug Delivery til Iskæmisk bagbensknogler og perfusion af kar med Microfil for Micro-computertomografi Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Kvantificering af Breast Cancer Cell invasiv Ved hjælp af en tre-dimensionel (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tre-dimensionel Co-kultur Model for Tumor-stromale Interaktion

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tre-Dimensional (3D) Tumor Sfæroide Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kvantitativ visualisering af leukocytinfiltrat i en murin model af Fulminant Myocarditis ved lysarkmikroskopi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Elektrofysiologiske vurdering af Murine forkamre med højopløselig optisk kortlægning

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Vurdering af terapeutisk angiogenese i en murine model af baglemmer iskæmi

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...