Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan Z-J L en OC V van de National Institutes of Health [R01HL149452 en VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. We bedanken ook de Microscopie en Imaging Facility van het Miami Project to Cure Paralysis aan de University of Miami School of Medicine voor het bieden van toegang tot hun beeldanalyse- en verwerkingssoftware.

Alle dierproeven beschreven in het protocol werden goedgekeurd door de University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-muizen, zowel mannelijk als vrouwelijk, in de leeftijd van 8-12 weken, werden gebruikt voor de studie.
1. Bereiding van L-NAME-oplossing
<ol><li>Bereid onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap een L-NAME-stamoplossing door 1 g L-NAME-poeder (zie Materiaaltabel) op te lossen met 20 ml steriel wa...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+density,+remodeling,+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains.">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).</li><li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).</li><li>Parikh, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+inducing+hind+limb+ischemia+in+mice+and+the+impact+of+these+variations+on+neovascularization+assessment.">Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+Versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Boden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+imaging+of+the+mouse+hindlimb+vasculature+using+the+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).</li><li>Elfarnawany, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+methods+for+quantitative+power+doppler+microvascular+angiography.">Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography.</a> Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).</li><li>Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+arterial+disease+in+patients+with+chronic+venous+insufficiency.">Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency.</a> Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Ammermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+chronic+venous+insufficiency+in+patients+with+peripheral+artery+disease:+Insights+from+MR+angiography.">Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography.</a> European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse.">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

Hoewel muis hindlimb ischemie het meest gebruikte preklinische model is om neovascularisatie in PAD en CLTI te bestuderen, is er een significante variatie in de ernst en het herstel van ischemie, afhankelijk van de specifieke muisstam die wordt gebruikt en de plaats, het aantal en de methode van arteriële verstoring. De combinatie van ligatie van de femorale slagader en IP-toediening van L-NAME kan op betrouwbare wijze hindlimb gangreen induceren bij FVB-muizen11. Dezelfde behandeling resulteert ...

Perifere arteriële ziekte (PAD), gekenmerkt door verminderde bloedtoevoer naar de ledematen als gevolg van atherosclerose, treft 6,5 miljoen mensen in de Verenigde Staten en 200 miljoen mensen wereldwijd1. Patiënten met PAD ervaren een verminderde ledemaatfunctie en kwaliteit van leven, en degenen met CLTI, de meest ernstige vorm van PAD, lopen een verhoogd risico op amputatie en overlijden met een 5-jarig sterftecijfer van bijna 50%2. In de klinische praktijk worden patiënten met enkel-brachiale indices (ABI) <0,9 geacht PAD te hebben, en patiënten met ABI <0,4 geassocieerd met rustpijn of weefselverlies als clti3. De symptomen variëren tussen patiënten met vergelijkbare ABI's, afhankelijk van de dagelijkse activiteit, spiertolerantie voor ischemie, anatomische variaties en verschillen in collaterale ontwikkeling4. Cijfer- en ledemaatgangreen is de meest ernstige manifestatie van alle vasculaire occlusieve ziekten die resulteren in CLTI. Het is een vorm van droge necrose die de zachte weefsels mummifieert. Naast atherosclerotisch PAD kan het ook worden waargenomen bij patiënten met diabetes, vasculiciden zoals de ziekte van Buerger en het fenomeen van Raynaud, of calcifylaxie in de setting van nierziekte in het eindstadium5,6.
Verschillende preklinische modellen zijn ontwikkeld om de pathogenese van PAD /CLTI te bestuderen en de werkzaamheid van potentiële behandelingen te testen, waarvan de meest voorkomende muisachterlimb ischemie blijft. Het induceren van hindlimb ischemie bij muizen wordt meestal bereikt door de obstructie van de bloedstroom uit de iliacale of femorale slagaders, hetzij door hechtingsligatie, elektrocoagulatie of andere middelen om het gewenste vat te vernauwen7. Deze technieken verminderen de perfusie naar de achterpoot drastisch en stimuleren neovascularisatie in de dij- en kuitspieren. Er zijn echter essentiële muriene stamafhankelijke verschillen in gevoeligheid voor ischemische belediging, deels als gevolg van anatomische verschillen in collaterale verdeling8,9. C57BL/6-muizen zijn bijvoorbeeld relatief resistent tegen ischemie van de hindlimb, wat een verminderde ledemaatfunctie aantoont, maar over het algemeen geen bewijs van gangreen in het voetkussen. Aan de andere kant hebben BALB / c-muizen een inherent slecht vermogen om te herstellen van ischemie en ontwikkelen ze meestal auto-amputatie van de voet of het onderbeen na alleen ligatie van de dijbeenslagader. Deze ernstige reactie op ischemie vernauwt het therapeutische venster en kan longitudinale beoordeling van ledemaatreperfusie en -functie uitsluiten. Interessant is dat genetische verschillen in een enkele kwantitatieve eigenschap locus op murinechromosoom 7 betrokken zijn bij deze differentiële gevoeligheid van C57BL / 6 en BALB / c muizen voor weefselnecrose en ledemaatreperfusie10.
Vergeleken met C57BL/6- en BALB/c-stammen vertonen FVB-muizen een intermediaire maar inconsistente respons op alleen ligatie van de dijbeenslagader. Sommige dieren ontwikkelen voetpad gangreen in de vorm van zwarte ischemische nagels of gemummificeerde cijfers, weer anderen zonder openlijke tekenen van ischemie11. Gelijktijdige toediening van Nω-Nitro-L-arginine methylesterhydrochloride (L-NAME), een stikstofmonoxidesynthase (NOS)-remmer12, voorkomt compenserende vaatverwijdende mechanismen en verhoogt verder oxidatieve stress in achterhandweefsel. In combinatie met ligatie of stolling van de femorale slagader produceert deze aanpak consequent verlies van voetzoolweefsel bij FVB-muizen dat lijkt op de atrofische veranderingen van CLTI, maar zelden evolueert naar auto-amputatie van ledematen11. Oxidatieve stress is een van de kenmerken van PAD/CLTI en wordt vermeerderd door endotheeldisfunctie en verminderde biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide (NO)13,14. NO is een pluripotent molecuul dat gewoonlijk gunstige effecten uitoefent op de arteriële en capillaire bloedstroom, de hechting en aggregatie van bloedplaatjes en de rekrutering en activering van leukocyten13. Van verlaagde NOS is ook aangetoond dat het het angiotensine-converterende enzym activeert, dat oxidatieve stress induceert en de progressie van atherosclerose versnelt15.
Zodra een model van hindlimb ischemie is vastgesteld, zijn monitoring van de daaropvolgende ledemaatreperfusie en het therapeutische effect van mogelijke behandelingen ook nodig. In het voorgestelde muriene gangreenmodel kan de mate van weefselverlies eerst worden gekwantificeerd met behulp van de Faber-score om het bruto uiterlijk van de voet te beoordelen (0: normaal, 1-5: verlies van nagels waarbij de score het aantal aangetaste nagels vertegenwoordigt, 6-10: atrofie van cijfers waarbij de score het aantal aangetaste cijfers vertegenwoordigt, 11-12: gedeeltelijke en volledige voetatrofie, respectievelijk)9. Kwantitatieve metingen van hindlimbperfusie worden vervolgens meestal uitgevoerd met behulp van LDPI, dat afhankelijk is van Doppler-interacties tussen laserlicht en rode bloedcellen om perfusie op pixelniveau aan te geven in een interessegebied (ROI)16. Hoewel deze techniek kwantitatief, niet-invasief en ideaal is voor herhaalde metingen, biedt het geen korrelige anatomische details van de achterste vasculatuur16. Andere beeldvormingsmodaliteiten, zoals micro-computertomografie (micro-CT), magnetische resonantieangiografie (MRA) en röntgenmicroangiografie, blijken ofwel kostbaar, vereisen geavanceerde instrumentatie of anderszins technisch uitdagend16. In 2008 beschreven Li et al. een techniek voor het labelen van bloedvaten in het netvlies met de lipofiele carbocyaninekleurstof DiI17. DiI integreert in endotheelcellen en kleurt door directe diffusie vasculaire membraanstructuren zoals angiogene spruiten en pseudopodale processen17,18. Vanwege de directe afgifte in endotheelcellen en de zeer fluorescerende aard van de kleurstof, biedt deze procedure intense en langdurige etikettering van bloedvaten. In 2012 pasten Boden et al. de techniek van DiI-perfusie aan het murine hindlimb ischemia-model aan via whole-mount imaging van geoogste dij-adductorspieren na ligatie van de femorale slagader19.
De huidige methode biedt een relatief goedkope en technisch haalbare manier om neovascularisatie te beoordelen als reactie op hindlimb ischemie en gen- of celgebaseerde therapieën. In een verdere aanpassing beschrijft dit protocol de toepassing van DiI-perfusie om de voetzoolvasculatuur in hoge resolutie en 3D in een murinemodel van hindlimb gangreen in beeld te brengen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

Perifere arteriële ziekte (PAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit als gevolg van chronische blootstelling aan atherosclerotische risicofactoren. Patiënten die lijden aan de meest ernstige vorm, chronische ledemaatbedreigende ischemie (CLTI), worden geconfronteerd met aanzienlijke beperkingen in het dagelijks leven, waaronder chronische pijn, beperkte loopafstand zonder pijn en niet-genezende wonden. Preklinische modellen zijn ontwikkeld bij verschillende dieren om PAD te bestuderen, maar muis hindlimb ischemie blijft de meest gebruikte. Er kan een aanzienlijke variatie zijn in reactie op ischemische belediging in deze modellen, afhankelijk van de gebruikte muizenstam en de plaats, het aantal en de middelen van arteriële verstoring. Dit protocol beschrijft een unieke methode die femorale slagader en ader elektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthase (NOS) -remmer om op betrouwbare wijze voetzoolgangreen te induceren in Friend Virus B (FVB) muizen die lijken op het weefselverlies van CLTI. Terwijl traditionele middelen voor het beoordelen van reperfusie zoals laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI) nog steeds worden aanbevolen, wordt intracardiale perfusie van de lipofiele kleurstof 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat (DiI) gebruikt om de vasculatuur te labelen. Daaropvolgende confocale laserscanmicroscopie met volledige mount maakt een hoge resolutie, driedimensionale (3D) reconstructie van voetkussen vasculaire netwerken mogelijk die een aanvulling vormt op traditionele middelen om reperfusie in hindlimb ischemiemodellen te beoordelen.

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar middel om ischemie en weefselverlies in het muriene voetpad te induceren met behulp van een combinatie van femorale slagader en veneuze coagulatie met L-NAME-toediening, een stikstofmonoxidesynthaseremmer, bij gevoelige FVB-muizen. Figuur 1 beschrijft de anatomie van de muriene achterpootvasculatuur en geeft de plaatsen van de femorale slagader en veneuze stolling aan (geel X), net proximaal aan de laterale circumflex femorale slagader (LCFA) en proxim...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Het huidige protocol beschrijft een uniek, klinisch relevant model van perifere arteriële ziekte dat femorale slagader en aderelektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthaseremmer om hindlimb gangreen te induceren in FVB-muizen. Intracardiale DiI-perfusie wordt vervolgens gebruikt voor hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van de voetzool vasculatuur.

Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Dit protocol presenteert hoe een muisvoetmat gangreenmodel te maken met behulp van toediening van massaremmer en femorale arteriecoagulatie. DiI-perfusie maakt vervolgens visualisatie van de voetzool vasculatuur met hoge resolutie mogelijk. Dit model is klinisch relevant en kan worden gebruikt voor preklinische geneesmiddelentests en voor het bestuderen van ledemaatischemie.Hoge resolutie visualisatie van vasculatuur biedt een technisch gemakkelijke manier om neovascularisatie te beoordelen. Dit voetkussen gangreenmodel heeft belangrijke toepassingen in preklinisch onderzoek naar perifere arteriële ziekte en kritieke ischemie van ledematen. DiI-perfusie is een nuttig hulpmiddel om neovascularisatie in diermodellen te bestuderen.De procedure wordt gedemonstreerd door Antoine Ribieras, van chirurgisch resident, en Yulexi Ortiz, een onderzoeksmedewerker van mijn laboratorium. Maak eerst dii-werkoplossing door 200 microliter dii-voorraadoplossing toe te voegen aan 10 milliliter van de werkende verdunningsoplossing onmiddellijk voor gebruik. Schud met de hand om goed te mengen.Sluit twee of drie drieweg stopkranen en een 25 gauge vlindernaald in serie aan. Bereid 10 milliliter spuiten met vier milliliter PBS, 10 milliliter DiI-oplossing en 10 milliliter 10% neutraal gebufferde formaline. Sluit de spuit met formaline aan op de proximale instroompoort en injecteer de oplossing om lucht uit de lijn te spoelen.Draai vervolgens aan de stopkraan om de poort te sluiten. Herhaal dezelfde procedure en verbind de spuiten met DiI en vervolgens PBS met respectievelijk de middelste en distale instroompoorten. Plaats het dier na de euthanasie in rugligging op een absorberend kussen en zet de oksels en onderste ledematen vast met naalden.Maak met behulp van een schaar een transversale incisie om de buikholte te openen en leg vervolgens het linker- en rechtermembraan bloot en verdeel het om toegang te krijgen tot de thoracale holte. Snijd de borstwand aan weerszijden van het borstbeen van de onderste ribben tot de eerste of tweede ribben. Gebruik een hemostaat om het onderste uiteinde van het borstbeen te grijpen en reflecteer het naar het hoofd van het dier om de thoracale holte bloot te leggen.Identificeer de linker ventrikel, die lichter van kleur lijkt dan de rechter. Pak het hart voorzichtig vast met een stompe tang en steek de vlindernaald in de linker ventrikel. Gebruik een schaar of een naald van 18 gauge om het rechteratrium te doorboren, waardoor bloed en perfusieoplossingen terugkeren naar het hart om te draineren.Open de poort van de spuit met PBS en injecteer handmatig twee tot vier milliliter met een snelheid van één tot twee milliliter per minuut gedurende één tot twee minuten om bloed uit het vaatstelsel te spoelen. Zorg voor een succesvolle perfusie door bloedingen uit het rechteratrium te observeren. Sluit na injectie de poort van de PBS-spuit.Open de poort van de spuit met DiI en injecteer vijf tot 10 milliliter met een snelheid van één tot twee milliliter per minuut gedurende vijf minuten. Sluit na de injectie de poort van de DiI-spuit en wacht twee minuten om de kleurstof te kunnen inbouwen voordat het fixatief wordt geïnjecteerd. Open de poort van de spuit met formaline en injecteer vijf tot 10 milliliter met een snelheid van één tot twee milliliter per minuut gedurende vijf minuten.Verwijder na de injectie de naald uit de linker ventrikel. Gebruik een zware schaar om het scheenbeen bij de enkel te ontwrichten, waardoor de linker- en rechtervoet volledig van de onderbenen worden gescheiden. Plaats de geoogste voeten in een plaat met 12 putten met één tot twee milliliter 10% formaline-oplossing.Wikkel het bord in met folie en bewaar een nacht op vier graden Celsius. Vervang de volgende dag de fixerende oplossing in een plaat van 12 putten door één tot twee milliliter PBS per put. Maak een longitudinale incisie met een scalpel op de plantaire en dorsale deel van de voet.Gebruik vervolgens een getande tang en een kleine hemostat, verwijder voorzichtig alle huid van de voet en cijfers en beschadig de onderliggende zachte weefsels niet. Om weefsels te monteren, plaatst u de voeten individueel tussen twee glazen microscoopglaasjes met een schuimbiopsiepad dat aan elk uiteinde over zichzelf is gevouwen. Gebruik twee kleine bindclips om de glasdia's aan elk uiteinde samen te persen.U kunt het voetkussen ook terugbrengen naar een plaat met 12 putten met één tot twee milliliter PBS. Nadat je het met folie hebt bedekt, bewaar je het bij vier graden Celsius om de fluorescentie tot een maand te behouden. Schakel het beeldvormingssysteem in, start de acquisitiesoftware en gebruik een lage vergroting of een laag numeriek diafragma om beelden vast te leggen.Klik op ja in het dialoogvenster fase activeren. Activeer de 561 nanometer laser op het tabblad Configuratie. Activeer op het hoofdscherm een zichtbaar straalpad door op de zichtbare knop te klikken.Stel een detector in op het bereik van 570 tot 600 nanometer door op het bijbehorende actieve selectievakje te klikken. Selecteer het pictogram voor het scannen van tegels op het acquisitietabblad en stel de gewenste resolutie in. Plaats droog gemonteerd weefselmonster gecomprimeerd tussen glasglaasjes op het microscooppodium en breng weefsel in beeld.Navigeer naar een hoek van het voorbeeld. Klik onder het menu tegelscan op de knop Positie markeren. Navigeer naar de tegenoverliggende hoek en klik nogmaals op de knop Markeerpositie om de scangrenzen in te stellen.Om de diepte van de Z-stack in te stellen, klikt u op de live knop. Navigeer naar het midden van het monster en gebruik de z-asknop om door te bladeren naar de onderkant van het monster. Klik op het tabblad Acquisitie onder het menu Z-stack op de startknop.Blader door naar de bovenkant van het voorbeeld en klik op de eindknop. Klik op de z-stap grootte en stel in op de gewenste waarde. Klik vervolgens op start om te beginnen met het verkrijgen van afbeeldingen.De figuur toont de variatie in weefselverlies die van dit model een week na de operatie kan worden verwacht met FABER-scores in de rechterbenedenhoek van elke afbeelding. Reconstructiemicroscopiebeelden onthullen normale vasculaire anatomie in niet-geligeerde controlevoetkussen in vergelijking met ernstig verminderde perfusie aan het voetkussen van geligeerde achterpoot vijf dagen na de operatie. 20 dagen na de operatie is de perfusie aan het voetkussen aanzienlijk verbeterd, hoewel niet in de mate van niet-geligeerde controle.De video laat zien dat oppervlakterendering vervolgens is gemaakt met behulp van de animatiefunctionaliteit. Spoel alle luchtbellen uit de perfusieassemblage. Als de longen tijdens de perfusie uitzetten en roze worden, is de naald de rechterkamer binnengedrongen en moet deze enigszins worden ingetrokken.Ledemaatweefsels kunnen worden gebruikt voor immunostaining om spiernecrose, weefselregeneratie, vaatdichtheid en rekrutering van voorlopercellen en andere weefselherstelcellen te beoordelen. De techniek van DiI-perfusie in dit muriene gangreenmodel is gebruikt in studies van gen- en celtherapieën. Het onderzoek heeft tot doel de perfusie in ledematen van patiënten met kritieke ischemie van ledematen te verbeteren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Human Neuro-endocriene tumor cellijnen als een drie-dimensionaal model voor de studie van de mens Neuro-endocriene Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Een Muizenmodel van Stent Implantatie in de halsslagader voor de Studie van Restenose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotische Drug Delivery voor ischemische achterpoten en perfusie van vaatstelsel met Microfil voor Micro-Computed Tomography Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...