Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל- Z-J L ו- OC V מהמכונים הלאומיים לבריאות [R01HL149452 ו- VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. אנו מודים גם למתקן המיקרוסקופיה והדמיה של פרויקט מיאמי לריפוי שיתוק בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מיאמי על מתן גישה לתוכנת ניתוח ועיבוד התמונות שלהם.

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים בפרוטוקול אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת מיאמי (IACUC). עכברי FVB, גברים ונשים כאחד, בגילאי 8-12 שבועות, שימשו למחקר.
1. הכנת פתרון L-NAME
<ol><li>בתנאים סטריליים במכסה המנוע של זרימה למינארית, הכינו פתרון מלאי ...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+density,+remodeling,+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains.">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).</li><li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).</li><li>Parikh, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+inducing+hind+limb+ischemia+in+mice+and+the+impact+of+these+variations+on+neovascularization+assessment.">Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+Versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Boden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+imaging+of+the+mouse+hindlimb+vasculature+using+the+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).</li><li>Elfarnawany, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+methods+for+quantitative+power+doppler+microvascular+angiography.">Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography.</a> Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).</li><li>Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+arterial+disease+in+patients+with+chronic+venous+insufficiency.">Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency.</a> Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Ammermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+chronic+venous+insufficiency+in+patients+with+peripheral+artery+disease:+Insights+from+MR+angiography.">Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography.</a> European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse.">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

בעוד איסכמיה אחורית עכבר הוא המודל הפרה קליני הנפוץ ביותר ללמוד neovascularization ב PAD ו- CLTI, יש שונות משמעותית חומרת איסכמיה והתאוששות בהתאם לזן העכבר הספציפי המשמש ואת האתר, מספר, ואת השיטה של הפרעה עורקית. השילוב של קשירת עורק הירך וניהול IP של L-NAME יכול באופן אמין לגרום נמק אחורי בעכברים <sup class="xref"...

מחלת עורקים היקפית (PAD), המאופיינת בזרימת דם מופחתת לגפיים עקב טרשת עורקים, משפיעה על 6.5 מיליון אנשים בארצות הברית ועל 200 מיליון אנשים ברחבי העולם1. חולים עם PAD חווים ירידה בתפקוד הגפיים ובאיכות החיים, ואלה עם CLTI, הצורה החמורה ביותר של PAD, נמצאים בסיכון מוגבר לכריתה ולמוות עם שיעור תמותה של 5 שנים המתקרב ל -50%2. בפרקטיקה הקלינית, חולים עם מדדי ברכיאל קרסול (ABI) <0.9 נחשבים כבעלי PAD, ואלה עם ABI <0.4 הקשורים לכאב מנוחה או לאובדן רקמות כבעלי CLTI3. הסימפטומים משתנים בין חולים עם ABIs דומים בהתאם לפעילות היומיומית, עמידות שרירים לאיסכמיה, וריאציות אנטומיות, והבדלים בהתפתחות בטחונות4. נמק ספרות וגפיים הוא הביטוי החמור ביותר של כל מחלות אוטם כלי הדם הגורמות CLTI. זהו סוג של נמק יבש שחונט את הרקמות הרכות. בנוסף PAD טרשת עורקים, זה יכול להיות נצפה גם בחולים עם סוכרת, vasculitides כגון מחלת Buerger ואת התופעה של Raynaud, או calciphylaxis בהגדרה של מחלת כליות סופנית5,6.
מספר מודלים פרה קליניים פותחו כדי לחקור את הפתוגנזה של PAD / CLTI ולבדוק את היעילות של טיפולים פוטנציאליים, הנפוץ שבהם נשאר איסכמיה אחורית עכבר. גרימת איסכמיה אחורית בעכברים מושגת בדרך כלל על ידי חסימת זרימת הדם מעורקי הכף או הירך, בין אם על ידי קשירת תפר, אלקטרו-קרישה או אמצעים אחרים של כיווץ הכלי הרצוי7. טכניקות אלה מפחיתות באופן דרסטי זלוף לחלק האחורי וממריצות את הניאווסקולריזציה בשרירי הירך והשוק. עם זאת, ישנם הבדלים חיוניים תלויי זן מורין ברגישות לעלבון איסכמי חלקית בשל הבדלים אנטומיים בהתפלגות בטחונות8,9. לדוגמה, עכברי C57BL/6 עמידים יחסית לאיסכמיה אחורית, ומדגימים תפקוד גפיים מופחת אך בדרך כלל אין ראיות לנמק בפנקס הרגליים. מצד שני, לעכברי BALB/c יש יכולת ירודה מטבעה להתאושש מאיסכמיה ובדרך כלל לפתח קטיעה אוטומטית של כף הרגל או הרגל התחתונה בעקבות קשירת עורק הירך בלבד. תגובה חמורה זו לאיסכמיה מצמצמת את החלון הטיפולי ויכולה למנוע הערכה אורכית של רפרטפוז ותפקוד הגפיים. מעניין, הבדלים גנטיים לוקוס תכונה כמותית אחת הממוקם על כרומוזום מורין 7 היו מעורבים אלה רגישות דיפרנציאלית של C57BL / 6 ו BALB / c עכברים נמק רקמות ו reperfusion גפיים10.
בהשוואה לזני C57BL/6 ו- BALB/c, עכברי FVB מדגימים תגובה בינונית אך לא עקבית לקשירת עורק הירך בלבד. בעלי חיים מסוימים מפתחים נמק משטח כף הרגל בצורה של מסמרים איסכמיים שחורים או ספרות חנוטות, אך אחרים ללא כל סימנים גלויים של איסכמיה11. ניהול בו זמנית של Nω-Nitro-L-ארגנין מתיל אסתר הידרוכלוריד (L-NAME), מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (NOS)12, מונע מנגנוני vasodilatory מפצה ומגביר עוד יותר את הלחץ החמצוני ברקמה האחורית. בשילוב עם קשירת עורק הירך או קרישה, גישה זו מייצרת בעקביות אובדן רקמת משטח כף הרגל בעכברים FVB הדומה לשינויים הנטרופיים של CLTI אך לעתים רחוקות מתקדם לכריתת איברים אוטומטית11. עקה חמצונית היא אחד מסימני ההיכר של PAD / CLTI והוא מופץ על ידי תפקוד לקוי של אנדותל וזמינות ביולוגית מופחתת של תחמוצת החנקן (NO)13,14. NO היא מולקולה פלוריפוטנטית שבדרך כלל מפעילה השפעות מועילות על זרימת דם עורקית ונימית, הידבקות טסיות דם וצבירה, וגיוס לויקוציטים והפעלה13. רמות מופחתות של NOS הוכחו גם להפעיל את האנזים ממיר אנגיוטנסין, אשר גורם סטרס חמצוני ומאיץ את ההתקדמות של טרשת עורקים15.
ברגע שנוצר מודל של איסכמיה אחורית, ניטור ריפוזיון הגפיים הבאים ואת ההשפעה הטיפולית של כל טיפולים פוטנציאליים נדרשים גם. במודל נמק מורין המוצע, ניתן לכמת תחילה את מידת אובדן הרקמות באמצעות ציון פייבר כדי להעריך את המראה הגס של כף הרגל (0: נורמלי, 1-5: אובדן מסמרים שבהם הציון מייצג את מספר הציפורניים המושפעות, 6-10: ניוון של ספרות שבהן הציון מייצג את מספר הספרות המושפעות, 11-12: ניוון חלקי ומלא כף הרגל, בהתאמה)9. מדידות כמותיות של זלוף אחורי נעשות בדרך כלל באמצעות LDPI, המסתמך על אינטראקציות דופלר בין אור לייזר לתאי דם אדומים כדי לציין זלוף ברמת הפיקסל באזור מעניין (ROI)16. בעוד שטכניקה זו היא כמותית, לא פולשנית ואידיאלית למדידות חוזרות ונשנות, היא אינה מספקת פירוט אנטומי פרטני של כלי הדם האחוריים16. שיטות הדמיה אחרות, כגון טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT), אנגיוגרפיה של תהודה מגנטית (MRA) ומיקרואנגיוגרפיה של קרני רנטגן, מוכיחות יקרות, דורשות מכשור מתוחכם, או מאתגרות מבחינה אחרת מבחינה טכנית16. בשנת 2008, Li et al. תיאר טכניקה לתיוג כלי דם בתוך הרשתית עם צבע קרבוציאנין ליפופילי DiI17. DiI משתלב בתאי אנדותל, ועל ידי דיפוזיה ישירה, כתמים מבני קרום כלי דם כגון נבטים אנגיוגניים ותהליכים פסאודופודיים17,18. בשל המסירה הישירה שלה לתאי אנדותל ואופי פלואורסצנטי מאוד של הצבע, הליך זה מספק תיוג אינטנסיבי וארוך טווח של כלי הדם. בשנת 2012, בודן ואח ' התאים את הטכניקה של זלוף DiI למודל איסכמיה אחורית מורין באמצעות הדמיה הר שלם של שרירי תוספת הירך שנקטפו בעקבות קשירת עורק הירך19.
השיטה הנוכחית מספקת דרך זולה יחסית וישימה מבחינה טכנית להערכת ניאווסקולריזציה בתגובה לאיסכמיה אחורית וטיפולים מבוססי גנים או תאים. בהסתגלות נוספת, פרוטוקול זה מתאר את היישום של זלוף DiI כדי לדמות את כלי הדם של משטח כף הרגל ברזולוציה גבוהה ותלת-ממד במודל מורין של נמק אחורי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

מחלת עורקים היקפית (PAD) היא גורם משמעותי לתחלואה הנובעת מחשיפה כרונית לגורמי סיכון טרשת עורקים. חולים הסובלים מצורתה החמורה ביותר, איסכמיה כרונית מסכנת גפיים (CLTI), מתמודדים עם ליקויים משמעותיים בחיי היומיום, כולל כאב כרוני, מרחק הליכה מוגבל ללא כאב ופצעים שאינם מחממים. מודלים פרה-קליניים פותחו בבעלי חיים שונים כדי לחקור PAD, אבל איסכמיה אחורית עכבר נשאר הנפוץ ביותר בשימוש נרחב. יכולה להיות שונות משמעותית בתגובה לעלבון איסכמי במודלים אלה בהתאם לזן העכבר המשמש ואת האתר, המספר והאמצעים להפרעה עורקית. פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית המשלבת עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול של מעכב סינתאז תחמוצת החנקן (NOS) כדי לגרום באופן אמין נמק משטח כף הרגל בעכברים וירוס חבר B (FVB) הדומה לאובדן הרקמה של CLTI. בעוד אמצעים מסורתיים להערכת reperfusion כגון הדמיית זלוף דופלר לייזר (LDPI) עדיין מומלץ, זלוף תוך לב של צבע ליפופילי 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) משמש לתיוג כלי הדם. מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית בהרכבה מלאה לאחר מכן מאפשרת שחזור ברזולוציה גבוהה ותלת-ממדית (3D) של רשתות כלי דם של משטחי רגליים המשלימים אמצעים מסורתיים להערכת רפרטפוזיה במודלים של איסכמיה אחורית.

פרוטוקול זה מפרט אמצעי אמין של גרימת איסכמיה ואובדן רקמות בפנקס הרגליים murine באמצעות שילוב של עורק הירך וקרישת ורידים עם ניהול L-NAME, מעכב סינתאז תחמוצת החנקן, בעכברים FVB רגישים. איור 1 מפרט את האנטומיה של כלי הדם האחוריים של מורין ומציין את האתרים של עורק הירך וקרישת הוורידים ...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל ייחודי ורלוונטי מבחינה קלינית של מחלת עורקים היקפית המשלב עורק הירך ואלקטרו-קרישת ורידים עם ניהול מעכב סינתאז תחמוצת החנקן כדי לגרום לנמק אחורי בעכברים FVB. זלוף תוך-לבבי DiI משמש לאחר מכן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל.

הדמיה תלת מימדית ברזולוציה גבוהה של כלי הדם של משטח כף הרגל במודל נמק הינדלימב מורין

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

פרוטוקול זה מציג כיצד ליצור מודל נמק כרית רגל עכבר באמצעות ניהול של מעכב מסה וקרישת עורק הירך. זלוף DiI מאפשר לאחר מכן הדמיה ברזולוציה גבוהה של כלי הדם כרית כף הרגל. מודל זה רלוונטי מבחינה קלינית וניתן להשתמש בו לבדיקות סמים פרה-קליניות ולחקר איסכמיה של איברים.הדמיה ברזולוציה גבוהה של כלי דם מציעה אמצעי קל מבחינה טכנית להערכת ניאווסקולריזציה. זה מודל נמק כרית כף הרגל יש יישומים חשובים במחקר פרה קליני של מחלת עורקים היקפית ואיסכמיה גפיים קריטית. זלוף DiI הוא כלי שימושי לחקר ניאווסקולריזציה במודלים של בעלי חיים.מדגימים את ההליך יהיו אנטואן Ribieras, של תושב כירורגי, ו Yulexi אורטיז, עמית מחקר מהמעבדה שלי. ראשית, הפוך פתרון עבודה DiI על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של פתרון מלאי DiI ל 10 מיליליטר של פתרון דילול עובד מיד לפני השימוש. לחץ ביד כדי לערבב היטב.חבר שניים או שלושה עצירות משולשות ומחט פרפר 25 מד בסדרה. הכן מזרקים 10 מיליליטר עם ארבעה מיליליטר של PBS, 10 מיליליטר של פתרון DiI, ו 10 מיליליטר של 10% פורמלין חוצץ ניטרלי. חבר את המזרק עם פורמלין ליציאת הזרימה הפרוקסימלית והזריק את הפתרון כדי לשטוף את האוויר מהקו.ואז להפוך את stopcock כדי לסגור את הנמל. חזור על אותו הליך, חיבור המזרקים באמצעות DiI ולאחר מכן PBS ליציאות הזרימה האמצעית והדיסטלית בהתאמה. לאחר המתת חסד, מניחים את החיה בתנוחה סופית על כרית סופגת ומאובטחים צירים וגפיים תחתונות עם מחטים.באמצעות מספריים, לבצע חתך רוחבי כדי לפתוח את חלל הבטן, ולאחר מכן לחשוף ולחלק את הסרעפת השמאלית והימנית כדי לגשת לחלל בית החזה. חותכים את דופן החזה משני צדי עצם החזה מהצלעות התחתונות לצלע הראשונה או השנייה. השתמש hemostat כדי לתפוס את הקצה התחתון של עצם החזה ולשקף אותו לכיוון ראשו של החיה כדי לחשוף את חלל בית החזה.זהה את החדר השמאלי, שנראה בהיר יותר בצבעו מאשר בצד ימין. לאחוז בעדינות את הלב עם מלקחיים קהים ולהכניס את מחט הפרפר לחדר השמאלי. השתמש במספריים או מחט 18 מד כדי לנקב את האטריום הנכון, ומאפשר פתרונות דם וזלוף לחזור ללב לנקז.פתח את היציאה של המזרק עם PBS ולהזריק באופן ידני שניים עד ארבעה מיליליטר בקצב של 1 עד 2 מיליליטר לדקה במשך דקה עד שתי דקות כדי לשטוף את הדם ממערכת כלי הדם. להבטיח זלוף מוצלח על ידי התבוננות דימום מן האטריום הימני. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק PBS.פתח את נמל המזרק עם DiI והזריק 5 עד 10 מיליליטר בקצב של 1 עד 2 מיליליטר לדקה למשך חמש דקות. לאחר ההזרקה, סגור את היציאה של מזרק DiI ולחכות שתי דקות כדי לאפשר שילוב של הצבע לפני הזרקה של קבוע. פתח את נמל המזרק עם פורמלין והזריק 5 עד 10 מיליליטר בקצב של 1 עד 2 מיליליטר לדקה במשך חמש דקות.לאחר ההזרקה, להסיר את המחט מהחדר השמאלי. באמצעות מספריים כבדים, לפרוק את השוקה בקרסול, הפרדה מוחלטת את הרגליים השמאלית והימנית מן הרגליים התחתונות. מניחים רגליים שנקטפו בצלחת 12 היטב עם 1 עד 2 מיליליטר של תמיסת 10% פורמלין.עוטפים את הצלחת בנייר כסף ומאחסנים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, להחליף את הפתרון הקבע בצלחת 12 היטב עם אחד עד שני מיליליטר של PBS לכל באר. בצע חתך אורך עם אזמל על חלק plantar וגב של כף הרגל.לאחר מכן באמצעות מלקחיים שיניים ומוסטטי קטן, להסיר בזהירות את כל העור מכף הרגל והספרות, לא לפגוע ברקמות הרכות הבסיסיות. כדי להרכיב רקמות, מניחים בנפרד את הרגליים בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם כרית ביופסיה קצף מקופלת על עצמה בכל קצה. השתמש בשני מהדקי קלסר קטנים כדי לדחוס את שקופיות הזכוכית יחד בכל קצה.לחלופין, להחזיר את כרית כף הרגל לצלחת 12 היטב עם אחד עד שני מיליליטר של PBS. לאחר כיסויו בנייר כסף, לאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס כדי לשמור על פלואורסצנטיות עד חודש אחד. הפעל את מערכת ההדמיה, הפעל את תוכנת הרכישה והשתמש במטרה הגדלה נמוכה או צמצם מספרי נמוך כדי ללכוד תמונות.לחץ על כן לתיבת הדו-שיח של שלב ההפעלה. הפעל את לייזר 561 ננומטר בכרטיסיית התצורה. במסך הראשי, הפעל נתיב קרן נראה לעין על-ידי לחיצה על הכפתור הנראה לעין.הגדר גלאי לטווח של 570 עד 600 ננומטר על-ידי לחיצה על תיבת הסימון הפעילה המתאימה. בחר את סמל סריקת האריחים בכרטיסיית הרכישה והגדר את הרזולוציה הרצויה. מקם דגימת רקמה רכובה יבשה דחוסה בין שקופיות זכוכית על במת המיקרוסקופ ולהביא רקמות לפוקוס.נווט לפינה אחת של המדגם. תחת תפריט סריקת אריחים, לחץ על לחצן מיקום הסימון. נווט לפינה הנגדית ולחץ על לחצן מיקום הסימון שוב והגדר את גבולות הסריקה.כדי להגדיר את עומק מחסנית Z, לחץ על לחצן חי. נווט למרכז המדגם והשתמש בידית ציר z כדי לגלול לתחתית המדגם. בכרטיסיית הרכישה תחת תפריט Z-stack, לחץ על לחצן התחל.גלול לראש המדגם ולחץ על כפתור הקצה. לחץ על גודל שלב z והגדר לערך הרצוי. לאחר מכן לחץ על התחל להתחיל לרכוש תמונה.הנתון מציג את השונות באובדן רקמות שניתן לצפות ממודל זה שבוע לאחר הניתוח עם ציוני FABER שנרשמו בפינה הימנית התחתונה של כל תמונה. תמונות מיקרוסקופיה של שחזור חושפות אנטומיה תקינה של כלי הדם במשטח כף הרגל הלא קשור בהשוואה לזלוף מופחת קשות לרפידת כף הרגל של אחוריים קשורים חמישה ימים לאחר הניתוח. 20 ימים לאחר הניתוח, זלוף לרפידת כף הרגל השתפר באופן משמעותי, אם כי לא במידה של שליטה לא קשורה.הווידאו מראה כי עיבוד פני השטח נוצר לאחר מכן באמצעות פונקציונליות ההנפשה. יש לשטוף את כל בועות האוויר ממכלול הזלוף. אם הריאות מתרחבות והופכות ורודות במהלך הזלוף, המחט חדרה לחדר הימני ויש לסגת ממנה מעט.רקמות גפיים יכולות לשמש לחיסון להערכת נמק שרירים, התחדשות רקמות, צפיפות כלי שיט וגיוס של תאי אב ותאי תיקון רקמות אחרים. הטכניקה של זלוף DiI במודל נמק מורין זה שימש במחקרים של טיפולים גנטיים ותאיים. מטרת המחקר היא לשפר את הזלוף בגפיים של חולים עם איסכמיה גפיים קריטית.

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

דגם Murine של השתלת תומכן בעורק הראשי לחקר restenosis

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

הדמיה תלת ממדית של סיבי עצב Intraepidermal nociceptive בביופסיות עור אדם

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

משלוח סמים האוסמוטי לhindlimbs איסכמי וטפטוף של כלי דם עם Microfil למייקרו-טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

כימות של הפולשנות תאי סרטן השד תוך שימוש במודל תלת ממדים (3D)

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

מודל שיתוף תרבות תלת-ממדי לגידול אינטראקציה-סטרומה

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

ויזואליזציה כמותית של ליקוציטים לחדור במודל Murine של שריר הלב הדוקרני על ידי מיקרוסקופית גיליון אור

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

הערכת אנגיוגנזה תרפויטי במודל של מורטין של איסכמיה החוצה

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...