Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a Z-J L e OC V dal National Institutes of Health [R01HL149452 e VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Ringraziamo anche la Microscopy and Imaging Facility del Miami Project to Cure Paralysis presso la University of Miami School of Medicine per aver fornito l'accesso al loro software di analisi ed elaborazione delle immagini.

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti nel protocollo sono stati approvati dall'Università di Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per lo studio sono stati utilizzati topi FVB, sia maschi che femmine, di età compresa tra 8 e 12 settimane.
1. Preparazione della soluzione L-NAME
<ol><li>In condizioni sterili in una cappa a flusso laminare, preparare una soluzione madre L-NAME sciogliendo 1 g di polvere L-NAME (vedere Tabella dei materiali...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+density,+remodeling,+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains.">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).</li><li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).</li><li>Parikh, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+inducing+hind+limb+ischemia+in+mice+and+the+impact+of+these+variations+on+neovascularization+assessment.">Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+Versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Boden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+imaging+of+the+mouse+hindlimb+vasculature+using+the+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).</li><li>Elfarnawany, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+methods+for+quantitative+power+doppler+microvascular+angiography.">Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography.</a> Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).</li><li>Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+arterial+disease+in+patients+with+chronic+venous+insufficiency.">Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency.</a> Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Ammermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+chronic+venous+insufficiency+in+patients+with+peripheral+artery+disease:+Insights+from+MR+angiography.">Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography.</a> European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse.">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

Mentre l'ischemia del tronco posteriore del topo è il modello preclinico più utilizzato per studiare la neovascolarizzazione in PAD e CLTI, vi è una variazione significativa nella gravità e nel recupero dell'ischemia a seconda del ceppo murino specifico utilizzato e del sito, del numero e del metodo di interruzione arteriosa. La combinazione di legatura dell'arteria femorale e somministrazione IP di L-NAME può indurre in modo affidabile la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB11. Lo ste...

La malattia arteriosa periferica (PAD), caratterizzata da un ridotto flusso sanguigno alle estremità a causa dell'aterosclerosi, colpisce 6,5 milioni di persone negli Stati Uniti e 200 milioni di persone in tutto il mondo1. I pazienti con PAD sperimentano una ridotta funzionalità degli arti e qualità della vita, e quelli con CLTI, la forma più grave di PAD, sono ad aumentato rischio di amputazione e morte con un tasso di mortalità a 5 anni vicino al 50%2. Nella pratica clinica, i pazienti con indici caviglia-brachiali (ABI) <0,9 sono considerati affetti da PAD e quelli con ABI < 0,4 associati a dolore a riposo o perdita di tessuto come affetti da CLTI3. I sintomi variano tra i pazienti con ABI simili a seconda dell'attività quotidiana, della tolleranza muscolare all'ischemia, delle variazioni anatomiche e delle differenze nello sviluppo collaterale4. La cancrena delle dita e degli arti è la manifestazione più grave di tutte le malattie occlusive vascolari che provocano CLTI. È una forma di necrosi secca che mummifica i tessuti molli. Oltre alla PAD aterosclerotica, può essere osservata anche in pazienti con diabete, vasculitidi come la malattia di Buerger e il fenomeno di Raynaud, o calcifilassi nel contesto della malattia renale allo stadio terminale5,6.
Sono stati sviluppati diversi modelli preclinici per studiare la patogenesi della PAD/CLTI e testare l'efficacia di potenziali trattamenti, il più comune dei quali rimane l'ischemia degli arti posteriori del topo. L'induzione dell'ischemia del tronco posteriore nei topi è tipicamente realizzata dall'ostruzione del flusso sanguigno dalle arterie iliache o femorali, sia mediante legatura di sutura, elettrocoagulazione o altri mezzi per restringere il vaso desiderato7. Queste tecniche riducono drasticamente la perfusione agli arti posteriori e stimolano la neovascolarizzazione nei muscoli della coscia e del polpaccio. Tuttavia, esistono differenze essenziali murine dipendenti dal ceppo nella sensibilità all'insulto ischemico, in parte dovute a differenze anatomiche nella distribuzione delle garanzie8,9. Ad esempio, i topi C57BL/6 sono relativamente resistenti all'ischemia degli arti posteriori, dimostrando una ridotta funzionalità degli arti ma generalmente nessuna evidenza di cancrena nella pedana. D'altra parte, i topi BALB / c hanno una capacità intrinsecamente scarsa di riprendersi dall'ischemia e in genere sviluppano l'autoamplificazione del piede o della parte inferiore della gamba dopo la sola legatura dell'arteria femorale. Questa grave risposta all'ischemia restringe la finestra terapeutica e può precludere la valutazione longitudinale della riperfusione e della funzione degli arti. È interessante notare che le differenze genetiche in un singolo locus del tratto quantitativo situato sul cromosoma murino 7 sono state implicate in queste suscettibilità differenziali dei topi C57BL/6 e BALB/c alla necrosi tissutale e alla riperfusione degli arti10.
Rispetto ai ceppi C57BL/6 e BALB/c, i topi FVB dimostrano una risposta intermedia ma incoerente alla sola legatura dell'arteria femorale. Alcuni animali sviluppano cancrena sotto forma di unghie ischemiche nere o dita mummificate, altri ancora senza segni evidenti di ischemia11. La somministrazione concomitante di Nω-Nitro-L-arginina estere metilico cloridrato (L-NAME), un inibitore dell'ossido nitrico sintasi (NOS)12, previene i meccanismi vasodilatatori compensatori e aumenta ulteriormente lo stress ossidativo nel tessuto posteriore. In combinazione con la legatura o la coagulazione dell'arteria femorale, questo approccio produce costantemente una perdita di tessuto del footpad nei topi FVB che assomiglia ai cambiamenti atrofici del CLTI, ma raramente progredisce verso l'auto-amputazione degli arti11. Lo stress ossidativo è uno dei tratti distintivi della PAD/CLTI ed è propagato dalla disfunzione endoteliale e dalla diminuita biodisponibilità dell'ossido nitrico (NO)13,14. L'NO è una molecola pluripotente che di solito esercita effetti benefici sul flusso sanguigno arterioso e capillare, sull'adesione e aggregazione piastrinica e sul reclutamento e l'attivazione dei leucociti13. Livelli ridotti di NOS hanno anche dimostrato di attivare l'enzima di conversione dell'angiotensina, che induce stress ossidativo e accelera la progressione dell'aterosclerosi15.
Una volta stabilito un modello di ischemia degli arti posteriori, è necessario monitorare la successiva riperfusione degli arti e l'effetto terapeutico di eventuali trattamenti potenziali. Nel modello di cancrena murina proposto, il grado di perdita di tessuto può essere prima quantificato utilizzando il punteggio Faber per valutare l'aspetto lordo del piede (0: normale, 1-5: perdita di unghie dove il punteggio rappresenta il numero di unghie colpite, 6-10: atrofia delle dita dove il punteggio rappresenta il numero di cifre colpite, 11-12: atrofia parziale e completa del piede, rispettivamente)9. Le misurazioni quantitative della perfusione degli arti posteriori vengono quindi in genere effettuate utilizzando LDPI, che si basa sulle interazioni Doppler tra luce laser e globuli rossi per indicare la perfusione a livello di pixel in una regione di interesse (ROI)16. Sebbene questa tecnica sia quantitativa, non invasiva e ideale per misurazioni ripetute, non fornisce dettagli anatomici granulari della vascolarizzazione degli arti posteriori16. Altre modalità di imaging, come la tomografia micro-computerizzata (micro-CT), l'angiografia a risonanza magnetica (MRA) e la microangiografia a raggi X, si rivelano costose, richiedono una strumentazione sofisticata o altrimenti tecnicamente impegnative16. Nel 2008, Li et al. hanno descritto una tecnica per etichettare i vasi sanguigni all'interno della retina con il colorante lipofilo di carbocianina DiI17. DiI incorpora nelle cellule endoteliali e, per diffusione diretta, colora le strutture della membrana vascolare come germogli angiogenici e processi pseudopodali17,18. Grazie alla sua consegna diretta nelle cellule endoteliali e alla natura altamente fluorescente del colorante, questa procedura fornisce un'etichettatura intensa e duratura dei vasi sanguigni. Nel 2012, Boden et al. hanno adattato la tecnica della perfusione DiI al modello di ischemia dell'arto posteriore murino tramite imaging a montaggio intero dei muscoli adduttori della coscia raccolti dopo la legatura dell'arteria femorale19.
Il metodo attuale fornisce un modo relativamente economico e tecnicamente fattibile per valutare la neovascolarizzazione in risposta all'ischemia degli arti posteriori e alle terapie basate su geni o cellule. In un ulteriore adattamento, questo protocollo descrive l'applicazione della perfusione DiI per visualizzare la vascolarizzazione del footpad in alta risoluzione e 3D in un modello murino di cancrena posteriore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

La malattia arteriosa periferica (PAD) è una causa significativa di morbilità derivante dall'esposizione cronica a fattori di rischio aterosclerotici. I pazienti affetti dalla sua forma più grave, l'ischemia cronica che minaccia gli arti (CLTI), affrontano notevoli menomazioni nella vita quotidiana, tra cui dolore cronico, distanza a piedi limitata senza dolore e ferite non cicatrizzanti. Modelli preclinici sono stati sviluppati in vari animali per studiare la PAD, ma l'ischemia degli arti posteriori del topo rimane la più utilizzata. Ci possono essere variazioni significative nella risposta all'insulto ischemico in questi modelli a seconda del ceppo di topo utilizzato e del sito, del numero e dei mezzi di interruzione arteriosa. Questo protocollo descrive un metodo unico che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e della vena con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi (NOS) per indurre in modo affidabile la cancrena del footpad nei topi Friend Virus B (FVB) che assomiglia alla perdita di tessuto di CLTI. Mentre i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione come l'imaging laser doppler perfusione (LDPI) sono ancora raccomandati, la perfusione intracardiaca del colorante lipofilo 1,1'-diottadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI) viene utilizzata per etichettare la vascolarizzazione. La successiva microscopia a scansione laser confocale a montaggio intero consente la ricostruzione tridimensionale (3D) ad alta risoluzione delle reti vascolari footpad che integra i mezzi tradizionali di valutazione della riperfusione nei modelli di ischemia degli arti posteriori.

Questo protocollo descrive un mezzo affidabile per indurre ischemia e perdita di tessuto nella pedana murina utilizzando una combinazione di arteria femorale e coagulazione venosa con la somministrazione di L-NAME, un inibitore dell'ossido nitrico sintasi, in topi FVB sensibili. La Figura 1 descrive in dettaglio l'anatomia della vascolarizzazione murina degli arti posteriori e indica i siti dell'arteria femorale e della coagulazione venosa (X gialla), appena prossimali all'arteria femorale c...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Questo protocollo presenta come creare un modello di cancrena del piede del topo utilizzando la somministrazione di inibitori di massa e coagulazione dell'arteria femorale. La perfusione DiI consente quindi la visualizzazione ad alta risoluzione della vascolarizzazione del cuscinetto del piede. Questo modello è clinicamente rilevante e può essere utilizzato per test preclinici sui farmaci e per studiare l'ischemia degli arti.La visualizzazione ad alta risoluzione della vascolarizzazione offre un mezzo tecnicamente facile per valutare la neovascolarizzazione. Questo modello di cancrena plantare ha importanti applicazioni nella ricerca preclinica della malattia arteriosa periferica e dell'ischemia critica degli arti. La perfusione DiI è uno strumento utile per studiare la neovascolarizzazione in modelli animali.A dimostrare la procedura saranno Antoine Ribieras, di residente chirurgico, e Yulexi Ortiz, un ricercatore associato del mio laboratorio. Innanzitutto, creare una soluzione di lavoro DiI aggiungendo 200 microlitri di soluzione madre DiI a 10 millilitri della soluzione diluente di lavoro immediatamente prima dell'uso. Agitare la mano per mescolare bene.Collegare due o tre rubinetti a tre vie e un ago a farfalla calibro 25 in serie. Preparare siringhe da 10 millilitri con quattro millilitri di PBS, 10 millilitri di soluzione DiI e 10 millilitri di formalina tamponata neutra al 10%. Collegare la siringa con formalina alla porta di afflusso prossimale e iniettare la soluzione per lavare l'aria dalla linea.Quindi ruotare il rubinetto per chiudere la porta. Ripetere la stessa procedura, collegando le siringhe con DiI e quindi PBS rispettivamente alle porte di afflusso centrale e distale. Dopo l'eutanasia, posizionare l'animale in posizione supina su un cuscinetto assorbente e fissare le ascelle e gli arti inferiori con aghi.Usando le forbici, fai un'incisione trasversale per aprire la cavità addominale, quindi esponi e dividi il diaframma sinistro e destro per accedere alla cavità toracica. Tagliare la parete toracica su entrambi i lati dello sterno dalle costole inferiori alla prima o alla seconda costola. Usa un emostato per afferrare l'estremità inferiore dello sterno e rifletterlo verso la testa dell'animale per esporre la cavità toracica.Identifica il ventricolo sinistro, che appare di colore più chiaro rispetto al destro. Afferrare delicatamente il cuore con una pinza smussata e inserire l'ago a farfalla nel ventricolo sinistro. Utilizzare forbici o un ago calibro 18 per perforare l'atrio destro, consentendo al sangue e alle soluzioni di perfusione di tornare al cuore per drenare.Aprire la porta della siringa con PBS e iniettare manualmente da due a quattro millilitri ad una velocità di uno o due millilitri al minuto per uno o due minuti per lavare il sangue dal sistema vascolare. Garantire una perfusione di successo osservando il sanguinamento dall'atrio destro. Dopo l'iniezione, chiudere la porta della siringa PBS.Aprire la porta della siringa con DiI e iniettare da cinque a 10 millilitri ad una velocità di uno o due millilitri al minuto per cinque minuti. Dopo l'iniezione, chiudere la porta della siringa DiI e attendere due minuti per consentire l'incorporazione del colorante prima dell'iniezione del fissativo. Aprire la porta della siringa con formalina e iniettare da cinque a 10 millilitri ad una velocità di uno o due millilitri al minuto per cinque minuti.Dopo l'iniezione, rimuovere l'ago dal ventricolo sinistro. Usando forbici pesanti, dislocare la tibia alla caviglia, separando completamente i piedi sinistro e destro dalla parte inferiore delle gambe. Posizionare i piedi raccolti in una piastra da 12 pozzetti con uno o due millilitri di soluzione di formalina al 10%.Avvolgere il piatto con un foglio e conservare a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, sostituire la soluzione fissativa in una piastra a 12 pozzetti con uno o due millilitri di PBS per pozzetto. Fai un'incisione longitudinale con un bisturi sulla parte plantare e dorsale del piede.Quindi utilizzando una pinza dentata e un piccolo emostato, rimuovere con cura tutta la pelle dal piede e dalle dita, non danneggiando i tessuti molli sottostanti. Per montare i tessuti, posizionare individualmente i piedi tra due vetrini per microscopio di vetro con un tampone per biopsia in schiuma ripiegato su se stesso a ciascuna estremità. Utilizzare due piccole clip leganti per comprimere le diapositive di vetro insieme a ciascuna estremità.In alternativa, riportare il cuscinetto del piede su una piastra a 12 pozzetti con uno o due millilitri di PBS. Dopo averlo coperto con un foglio, conservalo a quattro gradi Celsius per mantenere la fluorescenza per un massimo di un mese. Accendere il sistema di imaging, avviare il software di acquisizione e utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento o a bassa apertura numerica per acquisire le immagini.Fare clic su Sì nella finestra di dialogo Attiva fase. Attivare il laser a 561 nanometri nella scheda di configurazione. Nella schermata principale, attiva un percorso del fascio visibile facendo clic sul pulsante visibile.Impostare un rilevatore sull'intervallo da 570 a 600 nanometri facendo clic sulla casella di controllo attiva corrispondente. Selezionare l'icona di scansione dei riquadri nella scheda di acquisizione e impostare la risoluzione desiderata. Posizionare il campione di tessuto montato a secco compresso tra i vetrini sul palco del microscopio e mettere a fuoco il tessuto.Passare a un angolo dell'esempio. Nel menu di scansione delle tessere, fare clic sul pulsante Segna posizione. Passare all'angolo opposto e fare nuovamente clic sul pulsante di posizione del segno impostando i limiti di scansione.Per impostare la profondità dello Z-stack, fare clic sul pulsante live. Passare al centro dell'esempio e utilizzare la manopola dell'asse z per scorrere fino alla parte inferiore del campione. Nella scheda di acquisizione sotto il menu Z-stack, fare clic sul pulsante Diinizio.Scorri fino alla parte superiore dell'esempio e fai clic sul pulsante fine. Fare clic sulla dimensione z-step e impostare sul valore desiderato. Quindi fare clic su Start per iniziare l'acquisizione delle immagini.La figura mostra la variazione della perdita di tessuto che ci si può aspettare da questo modello una settimana dopo l'intervento chirurgico con punteggi FABER registrati nell'angolo in basso a destra di ogni immagine. Le immagini al microscopio di ricostruzione rivelano una normale anatomia vascolare nel cuscinetto del piede di controllo non legato rispetto alla perfusione gravemente ridotta al cuscinetto del piede dell'arto posteriore legato cinque giorni dopo l'intervento chirurgico. 20 giorni dopo l'intervento chirurgico, la perfusione al cuscinetto del piede è migliorata in modo significativo, anche se non nella misura del controllo non legato.Il video mostra che il rendering della superficie è stato creato utilizzando la funzionalità di animazione. Lavare tutte le bolle d'aria dal gruppo di perfusione. Se i polmoni si espandono e diventano rosa durante la perfusione, l'ago è penetrato nel ventricolo destro e deve essere leggermente retratto.I tessuti degli arti possono essere utilizzati per l'immunocolorazione per valutare la necrosi muscolare, la rigenerazione dei tessuti, la densità dei vasi e il reclutamento di cellule progenitrici e altre cellule di riparazione dei tessuti. La tecnica della perfusione DiI in questo modello di cancrena murina è stata utilizzata in studi di terapie geniche e cellulari. La ricerca mira a migliorare la perfusione negli arti di pazienti con ischemia critica degli arti.

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Ricerca

Medicina

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Un modello murino di impianto di stent a livello dell&#39;arteria carotidea per lo Studio della restenosi

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Imaging tridimensionale di fibre nervose nocicettive intraepidermiche in biopsie cutanee umane

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotica Drug Delivery per arti posteriori ischemico e la perfusione dei vasi con Microfil per Micro-Tomografia Computerizzata Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Tridimensionale Co-cultura Modello di tumore stromale-Interaction

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Visualizzazione quantitativa di leucociti infiltrati in un modello di murina della miocardite fulminante mediante microscopia a foglio chiaro

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Valutazione elettrofisiologica di Atria murino con Mapping ottico ad alta risoluzione

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...