Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

この研究は、国立衛生研究所[R01HL149452およびVITAからZ-J LおよびOC Vへの助成金(NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]によって支援されました。我々はまた、マイアミ大学医学部の麻痺を治すためのマイアミプロジェクトの顕微鏡およびイメージング施設が、画像解析および処理ソフトウェアへのアクセスを提供してくれたことに感謝する。

プロトコールに記載されているすべての動物実験は、マイアミ大学施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。生後8〜12週の雄および雌の両方のFVBマウスを研究に使用した。
1. L-NAME溶液の調製
<ol><li>層流フード内の滅菌条件下で、L-NAME粉末1g( 原料表参照)を20mLの滅菌水に溶解してL-NAME原液を調製し、50mg/mLの溶液を作る。スト...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. 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E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

マウス後肢虚血は、PADおよびCLTIにおける新生血管新生を研究するために最も広く使用されている前臨床モデルであるが、虚血の重症度および回復には、使用される特定のマウス系統および動脈破壊の部位、数、および方法に応じて有意な変動がある。L-NAMEの大腿動脈結紮とIP投与の組み合わせは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を確実に誘導することができる11。同じ治療は、C5...

末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化症による四肢への血流の減少を特徴とし、米国では650万人、世界では2億人が罹患しています1。PAD患者は四肢機能と生活の質の低下を経験し、最も重篤な形態のPADであるCLTI患者は切断および死亡のリスクが高く、5年間の死亡率は50%に近づいています2。臨床現場では、足首上腕指数(ABI)<0.9の患者はPADを有すると考えられ、ABI<0.4の患者はCLTI3を有するとして安静痛または組織喪失のいずれかに関連する。症状は、毎日の活動、虚血に対する筋肉の耐性、解剖学的変異、および側副発達の違いに応じて、同様のABIを有する患者間で変化する4。数字および四肢壊疽は、CLTIをもたらすすべての血管閉塞性疾患の中で最も重篤な症状である。それは軟部組織をミイラ化する乾燥壊死の一形態である。アテローム性動脈硬化性PADに加えて、糖尿病、バージャー病やレイノー現象などの血管炎、または末期腎疾患の設定におけるカルシフィラキシーの患者でも観察することができます5,6。
PAD/CLTIの病因を研究し、潜在的な治療法の有効性をテストするために、いくつかの前臨床モデルが開発されており、最も一般的なものはマウス後肢虚血のままである。マウスにおける後肢虚血の誘導は、典型的には、縫合結紮、電気凝固、または所望の血管を狭窄させる他の手段のいずれかによって、腸骨動脈または大腿動脈からの血流の閉塞によって達成される7。これらの技術は、後肢への灌流を劇的に減少させ、大腿部およびふくらはぎの筋肉における新生血管新生を刺激する。しかし、虚血性侮辱に対する感受性には、副次的分布の解剖学的差異に部分的に起因して、マウス系統依存的な本質的な違いがある8,9。例えば、C57BL/6マウスは後肢虚血に対して比較的耐性があり、四肢機能の低下を実証するが、一般に足蹠に壊疽の証拠はない。一方、BALB/cマウスは虚血からの回復能力が本質的に乏しく、典型的には大腿動脈結紮のみの後に足または下肢の自己切断を発症する。虚血に対するこの重篤な反応は、治療窓を狭め、四肢の再灌流および機能の縦断的評価を妨げる可能性がある。興味深いことに、マウス第7染色体に位置する単一の量的形質遺伝子座における遺伝的差異は、C57BL/6およびBALB/cマウスの組織壊死および四肢再灌流に対するこれらの異なる感受性に関与している10。
C57BL/6およびBALB/c株と比較して、FVBマウスは、大腿動脈結紮のみに対して中間的ではあるが一貫性のない応答を示す。いくつかの動物は、黒い虚血性爪またはミイラ化した数字の形で足蹠壊疽を発症するが、虚血の明白な徴候がない動物もいる11。一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤であるNω-ニトロ-L-アルギニンメチルエステル塩酸塩(L-NAME)の同時投与12は、代償性血管拡張機構を予防し、後肢組織における酸化ストレスをさらに増加させる。大腿動脈結紮または凝固と組み合わせて、このアプローチは、CLTIの萎縮性変化に類似しているが、四肢の自己切断にはほとんど進行しないFVBマウスにおいて、一貫して足蹠組織喪失を生じる11。酸化ストレスはPAD/CLTIの特徴の1つであり、内皮機能障害および一酸化窒素(NO)の生物学的利用能の低下によって伝播される13,14。NOは多能性分子であり、通常、動脈および毛細血管血流、血小板接着および凝集、ならびに白血球の動員および活性化に有益な効果を発揮する13。NOSのレベルの低下はまた、酸化ストレスを誘発し、アテローム性動脈硬化症の進行を促進するアンジオテンシン変換酵素を活性化することが示されている15。
後肢虚血のモデルが確立されると、その後の四肢再灌流および潜在的な治療の治療効果のモニタリングも必要である。提案されたマウス壊疽モデルにおいて、組織喪失の程度は、まず、フェーバースコアを用いて定量化して、足の総外観を評価することができる(0:正常、1〜5:スコアが罹患した爪の数を表す爪の損失、6〜10:スコアが罹患した桁数を表す桁の萎縮、11〜12:部分的および完全な足の萎縮、 それぞれ)9.その後、後肢灌流の定量的測定は、典型的にはLDPIを用いて行われ、LDPIは、関心領域(ROI)におけるピクセルレベルの灌流を示すために、レーザー光と赤血球との間のドップラー相互作用に依存する16。この技術は定量的で非侵襲的であり、反復測定には理想的ですが、後肢血管系の粒状の解剖学的詳細を提供するものではありません16。マイクロコンピュータ断層撮影法(マイクロCT)、磁気共鳴血管造影法(MRA)、X線微小血管造影などの他のイメージングモダリティは、コストがかかるか、高度な機器を必要とするか、そうでなければ技術的に困難であることが証明されています16。2008年、Liらは、親油性カルボシアニン色素DiI17で網膜内の血管を標識する技術を説明した。DiIは内皮細胞に組み込まれ、直接拡散によって、血管新生スプラウトや偽蹄形プロセスなどの血管膜構造を染色する17,18。内皮細胞への直接送達および色素の蛍光性が高いため、この手順は血管の強烈で長期的な標識を提供する。2012年、BodenらはDiI灌流の手法を、大腿動脈結紮後に採取された大腿内転筋の全マウントイメージングを介してマウス後肢虚血モデルに適応させた19。
現在の方法は、後肢虚血および遺伝子または細胞ベースの治療に応答した新生血管形成を評価するための比較的安価で技術的に実現可能な方法を提供する。さらなる適応において、このプロトコルは、足蹠血管系を高解像度で画像化し、後肢壊疽のマウスモデルにおいて3Dで画像化するためのDiI灌流の適用を記載する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

末梢動脈疾患(PAD)は、アテローム性動脈硬化性危険因子への慢性曝露に起因する罹患率の重要な原因である。その最も重篤な形態、慢性四肢を脅かす虚血(CLTI)に罹患している患者は、慢性疼痛、痛みのない限られた歩行距離、および治癒しない創傷を含む日常生活に対する実質的な障害に直面する。PADを研究するために様々な動物において前臨床モデルが開発されてきたが、マウス後肢虚血は依然として最も広く使用されている。これらのモデルにおける虚血性侮辱に対する応答には、使用されるマウス系統、ならびに動脈破壊の部位、数、および手段に応じて有意な変動があり得る。このプロトコルは、CLTIの組織喪失に似たフレンドウイルスB(FVB)マウスにおいて足蹠壊疽を確実に誘導するために、大腿動脈および静脈電気凝固を一酸化窒素合成酵素(NOS)阻害剤の投与と組み合わせるユニークな方法を記載している。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)などの再灌流を評価する従来の手段が依然として推奨されているが、親油性色素1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)の心臓内灌流は、血管系を標識するために使用される。その後のホールマウント共焦点レーザー走査顕微鏡は、後肢虚血モデルにおける再灌流を評価する従来の手段を補完する足蹠血管網の高解像度、3次元(3D)再構成を可能にする。

このプロトコールは、感受性FVBマウスにおいて、一酸化窒素合成酵素阻害剤であるL−NAME投与による大腿動脈および静脈凝固の組み合わせを用いて、マウス足蹠における虚血および組織喪失を誘導する信頼できる手段を詳述する。 図1 は、マウス後肢血管系の解剖学的構造を詳述し、大腿動脈および静脈凝固の部位(黄色X)、側回旋大腿動脈(LCFA)のちょうど近位およびサ?...

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High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

本プロトコールは、FVBマウスにおいて後肢壊疽を誘導するための一酸化窒素合成酵素阻害剤の投与と大腿動脈動脈および静脈電気凝固を組み合わせた末梢動脈疾患のユニークで臨床的に関連するモデルを記載する。心臓内DiI灌流は、その後、足蹠血管系の高解像度、3次元イメージングに使用されます。

マウス後肢壊疽モデルにおける足蹠血管系の高解像度3次元イメージング

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

このプロトコールは、大量インヒビターおよび大腿動脈凝固の投与を用いてマウス足パッド壊疽モデルを作成する方法を提示する。DiI灌流は、フットパッド血管系の高解像度可視化を可能にする。このモデルは臨床的に関連性があり、前臨床薬物検査および四肢虚血の研究に使用することができる。血管系の高解像度可視化は、新生血管形成を評価するための技術的に容易な手段を提供する。この足パッド壊疽モデルは、末梢動脈疾患および重篤な四肢虚血の前臨床研究において重要な用途を有する。DiI灌流は、動物モデルにおける新生血管形成を研究するための有用なツールである。この手順を実演するのは、外科研修医のアントワーヌ・リビエラスと、私の研究室の助手であるユレクシ・オルティスです。まず、使用直前に10ミリリットルの作業希釈液に200マイクロリットルのDiIストック溶液を加えてDiI作業溶液を作る。よく混ぜるために手で振る。2つまたは3つの3方向活栓と25ゲージのバタフライニードルを直列に接続します。4ミリリットルのPBS、10ミリリットルのDiI溶液、および10ミリリットルの10%中性緩衝ホルマリンを含む10ミリリットルのシリンジを準備する。ホルマリンを含むシリンジを近位流入口に接続し、溶液を注入してラインから空気を流す。次に、活栓を回してポートを閉じます。同じ手順を繰り返し、DiIとPBSでシリンジをそれぞれ中央および遠位の流入ポートに接続します。安楽死後、動物を吸収パッドの上で仰臥位に置き、腋窩と下肢を針で固定します。はさみを使用して横切開を行い、腹腔を開き、左右の横隔膜を露出させて分割して胸腔にアクセスします。胸骨の両側の胸壁を下肋骨から第1または第2の肋骨に切断する。胸骨の下端をつかみ、それを動物の頭に向かって反射させて胸腔を露出させるために止血剤を使用してください。右心室よりも色が明るく見える左心室を特定します。鈍い鉗子で心臓を優しくつかみ、蝶の針を左心室に挿入します。はさみまたは18ゲージの針を使用して右心房を穿刺し、血液と灌流溶液を心臓に戻して排出できるようにします。PBSでシリンジのポートを開き、血管系から血液を洗い流すために、毎分1〜2ミリリットルの割合で2〜4ミリリットルを手動で1〜2分間注入する。右心房からの出血を観察することによって、正常な灌流を確実にする。注射後、PBSシリンジのポートを閉じます。DiIでシリンジのポートを開き、毎分1〜2ミリリットルの割合で5〜10ミリリットルを5分間注入する。注射後、DiIシリンジのポートを閉じ、固定液の注入前に色素の混入を可能にするために2分間待つ。ホルマリンでシリンジのポートを開き、5〜10ミリリットルを毎分1〜2ミリリットルの割合で5分間注入する。注射後、左心室から針を取り外します。重いはさみを使用して、足首の脛骨を脱臼させ、左右の足を下肢から完全に分離します。採取した足を1〜2ミリリットルの10%ホルマリン溶液で12ウェルプレートに入れます。プレートをホイルで包み、一晩摂氏4度で保管してください。翌日、12ウェルプレート内の固定液を1ウェルあたり1〜2ミリリットルのPBSと交換する。足の足底と背部にメスで縦切開を行います。次に、歯付きの鉗子と小さな止血剤を使用して、足と数字からすべての皮膚を慎重に取り除き、基礎となる軟部組織を傷つけないようにします。組織を取り付けるには、2つのガラス顕微鏡スライドの間に足を個別に置き、発泡生検パッドを両端に折り畳みます。2つの小さなバインダークリップを使用して、スライドガラスを両端で一緒に圧縮します。あるいは、フットパッドを1~2ミリリットルのPBSを含む12ウェルプレートに戻します。ホイルで覆った後、4°Cで保管し、最大1ヶ月間蛍光を維持します。イメージングシステムの電源を入れ、集録ソフトウェアを起動し、低倍率または低開口率の対物レンズを使用して画像をキャプチャします。「はい」をクリックして、ステージのアクティブ化ダイアログ・ボックスを表示します。[構成]タブで561ナノメートルレーザーをアクティブにします。メイン画面で、可視ボタンをクリックして可視ビームパスをアクティブにします。検出器を570~600ナノメートルの範囲に設定するには、対応するアクティブなチェックボックスをクリックします。[取得]タブでタイルスキャンアイコンを選択し、目的の解像度を設定します。スライドガラス間で圧縮されたドライマウントされた組織サンプルを顕微鏡ステージ上の位置に配置し、組織に焦点を合わせます。サンプルの片隅に移動します。タイルスキャンメニューの下で、マーク位置ボタンをクリックします。反対側のコーナーに移動し、マーク位置ボタンをもう一度クリックしてスキャン境界を設定します。Zスタックの深さを設定するには、ライブボタンをクリックします。サンプルの中央に移動し、Z 軸ノブを使用してサンプルの一番下までスクロールします。Zスタックメニューの下にある取得タブで、開始ボタンをクリックします。サンプルの上部までスクロールし、終了ボタンをクリックします。Z ステップ サイズをクリックし、目的の値に設定します。次に、[開始]をクリックして画像取得を開始します。図は、手術後1週間でこのモデルから予想される組織喪失の変動を示しており、各画像の右下隅にFABERスコアが記録されています。再構成顕微鏡画像は、手術後5日後に結紮後肢のフットパッドへの灌流がひどく減少したのと比較して、非結紮対照フットパッドにおける正常な血管解剖学を明らかにする。手術後20日目に、足パッドへの灌流は有意に改善したが、非結紮対照の程度ではない。このビデオは、サーフェス レンダリングがアニメーション機能を使用して作成されたことを示しています。灌流アセンブリからすべての気泡を洗い流します。灌流中に肺が膨張してピンク色に変わった場合、針は右心室を貫通しており、わずかに引っ込められるべきです。四肢組織は、筋肉壊死、組織再生、血管密度、および前駆細胞、および他の組織修復細胞の動員を評価するための免疫染色に使用することができる。このマウス壊疽モデルにおけるDiI灌流の技術は、遺伝子および細胞療法の研究に使用されている。この研究は、重篤な四肢虚血患者の四肢における灌流を改善することを目的としている。

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

再狭窄の研究のための頸動脈内ステント留置のマウスモデル

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

マイクロコンピュータ断層撮影イメージング用Microfilで虚血後肢と血管系の灌流に浸透ドラッグデリバリー

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

ヒンドリム虚血のマウスモデルにおける治療血管新生の評価

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...