Name: high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами Z-J L и OC V от Национальных институтов здравоохранения [R01HL149452 и VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. Мы также благодарим Центр микроскопии и визуализации Проекта Майами по лечению паралича в Медицинской школе Университета Майами за предоставление доступа к их программному обеспечению для анализа и обработки изображений.

Все эксперименты на животных, описанные в протоколе, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Майами (IACUC). Для исследования использовались мыши FVB, как самцы, так и самки, в возрасте 8-12 недель.
1. Приготовление раствора L-NAME
<ol><li>В сте?...

<ol>
	<li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update:+A+report+from+the+American+Heart+Association.">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139 (2020).</li><li>Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+critical+limb+ischemia:+A+review+of+recent+literature.">The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature.</a> Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).</li><li>Mills, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+society+for+vascular+surgery+lower+extremity+threatened+limb+classification+system:+Risk+stratification+based+on+Wound,+Ischemia,+and+foot+Infection+(WIfI).">The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI).</a> Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).</li><li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vascular+guidelines+on+the+management+of+chronic+limb-threatening+ischemia.">Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).</li><li>Yeager, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+hemodialysis+access+to+finger+gangrene+in+patients+with+end-stage+renal+disease.">Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease.</a> Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).</li><li>Al Wahbi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoamputation+of+diabetic+toe+with+dry+gangrene:+A+myth+or+a+fact.">Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).</li><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+model+of+hindlimb+ischemia.">Murine model of hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (23), e1035 (2009).</li><li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation.">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li><li>Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+density,+remodeling,+and+VEGF-A+expression+differ+widely+between+mouse+strains.">Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains.</a> Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).</li><li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+trait+locus+(LSq-1)+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia.">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).</li><li>Parikh, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Reliable+Mouse+Model+of+Hind+limb+Gangrene.">A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene.</a> Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).</li><li>Kopincov&#225;, J., P&#250;zserov&#225;, A., Bern&#225;tov&#225;, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-NAME+in+the+cardiovascular+system+-+nitric+oxide+synthase+activator.">L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator.</a> Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).</li><li>Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+chronic+peripheral+ischemia:+new+perspectives.">Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives.</a> Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).</li><li>McDermott, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+pathology+in+peripheral+artery+disease+a+brief+review.">Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).</li><li>Usui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+role+of+oxidative+stress+in+vascular+angiotensin-converting+enzyme+activation+in+long-term+blockade+of+nitric+oxide+synthesis+in+rats.">Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats.</a> Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).</li><li>Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+surgical+procedures+for+inducing+hind+limb+ischemia+in+mice+and+the+impact+of+these+variations+on+neovascularization+assessment.">Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).</li><li>Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dil+and+DiO:+Versatile+fluorescent+dyes+for+neuronal+labelling+and+pathway+tracing.">Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing.</a> Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).</li><li>Boden, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+imaging+of+the+mouse+hindlimb+vasculature+using+the+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI.">Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).</li><li>Elfarnawany, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+processing+methods+for+quantitative+power+doppler+microvascular+angiography.">Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography.</a> Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106 (2015).</li><li>Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+peripheral+arterial+disease+in+patients+with+chronic+venous+insufficiency.">Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency.</a> Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).</li><li>Ammermann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concomitant+chronic+venous+insufficiency+in+patients+with+peripheral+artery+disease:+Insights+from+MR+angiography.">Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography.</a> European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse.">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).</li><li>Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+acute+and+subacute+murine+hindlimb+ischemia.">Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e54166 (2016).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays.">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).</li><li>Greco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability,+reproducibility+and+standardisation+of+a+laser+doppler+imaging+technique+for+the+evaluation+of+normal+mouse+hindlimb+perfusion.">Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion.</a> Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).</li><li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb:+Functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models.">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS ONE. 8 (12), 84047 (2013).</li><li>Hlushchuk, R., Haberth&#252;r, D., Djonov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+microangioCT:+Advances+in+microvascular+imaging.">Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging.</a> Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).</li><li>Robertson, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+labeled+tomato+lectin+for+imaging+vasculature+structures.">Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures.</a> Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).</li><li>Lee, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+interrogation+of+angiogenesis+in+the+ischemic+mouse+hind+limb:+Vulnerabilities+and+quality+assurance.">Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).</li></ol>

В то время как ишемия задних конечностей мышей является наиболее широко используемой доклинической моделью для изучения неоваскуляризации при PAD и CLTI, существуют значительные различия в тяжести и восстановлении ишемии в зависимости от конкретного используемого штамма мыши, а также м?...

Заболевание периферических артерий (PAD), характеризующееся снижением притока крови к конечностям из-за атеросклероза, поражает 6,5 миллиона человек в Соединенных Штатах и 200 миллионов человек во всем мире1. Пациенты с PAD испытывают снижение функции конечностей и качества жизни, а пациенты с CLTI, наиболее тяжелой формой PAD, подвергаются повышенному риску ампутации и смерти с 5-летней смертностью, приближающейся к 50%2. В клинической практике пациенты с голеностопно-плечевыми индексами (ABI) <0,9 считаются имеющими PAD, а пациенты с ABI <0,4, связанными либо с болью в покое, либо с потерей тканей, как имеющие CLTI3. Симптомы варьируются среди пациентов с аналогичными ИБИ в зависимости от повседневной активности, мышечной толерантности к ишемии, анатомических вариаций и различий в коллатеральном развитии4. Гангрена пальцев и конечностей является наиболее тяжелым проявлением всех сосудистых окклюзионных заболеваний, которые приводят к ХЛМ. Это форма сухого некроза, которая мумифицирует мягкие ткани. Помимо атеросклеротической PAD, она также может наблюдаться у больных сахарным диабетом, васкулитами, такими как болезнь Бюргера и феномен Рейно, или кальцифилаксией в условиях терминальной стадии почечной недостаточности5,6.
Было разработано несколько доклинических моделей для изучения патогенеза PAD/ CLTI и проверки эффективности потенциальных методов лечения, наиболее распространенным из которых остается ишемия задних конечностей мышей. Индуцирование ишемии задних конечностей у мышей обычно осуществляется путем обструкции кровотока из подвздошных или бедренных артерий, либо путем перевязки швов, электрокоагуляции или других средств сужения желаемого сосуда7. Эти методы резко уменьшают перфузию до задней конечности и стимулируют неоваскуляризацию в мышцах бедра и икр. Однако существуют существенные зависящие от штамма мышей различия в чувствительности к ишемическому инсульту, частично обусловленные анатомическими различиями в коллатеральном распределении8,9. Например, мыши C57BL/6 относительно устойчивы к ишемии задних конечностей, демонстрируя снижение функции конечностей, но, как правило, отсутствие признаков гангрены в подушечке ноги. С другой стороны, мыши BALB/c по своей природе имеют плохую способность восстанавливаться после ишемии и обычно развивают аутоампутацию стопы или голени только после перевязки бедренной артерии. Эта тяжелая реакция на ишемию сужает терапевтическое окно и может препятствовать продольной оценке реперфузии и функции конечностей. Интересно, что генетические различия в одном количественном локусе признака, расположенном на мышиной хромосоме 7, были вовлечены в эти дифференциальные восприимчивости мышей C57BL/6 и BALB/c к некрозу тканей и реперфузии конечностей10.
По сравнению со штаммами C57BL/6 и BALB/c, мыши FVB демонстрируют промежуточный, но непоследовательный ответ только на перевязку бедренной артерии. У некоторых животных развивается гангрена ног в виде черных ишемических ногтей или мумифицированных пальцев, а у других без каких-либо явных признаков ишемии11. Одновременное введение Nω-nitro-L-аргинина метилового эфира гидрохлорида (L-NAME), ингибитора синтазы оксида азота (NOS)12, предотвращает компенсаторные сосудорасширяющие механизмы и еще больше увеличивает окислительный стресс в ткани задних конечностей. В сочетании с перевязкой или коагуляцией бедренной артерии этот подход последовательно вызывает потерю ткани подножки у мышей FVB, которая напоминает атрофические изменения CLTI, но редко прогрессирует до аутоампутации конечностей11. Окислительный стресс является одной из отличительных черт PAD/CLTI и распространяется эндотелиальной дисфункцией и снижением биодоступности оксида азота (NO)13,14. NO представляет собой плюрипотентную молекулу, которая обычно оказывает благотворное влияние на артериальный и капиллярный кровоток, адгезию и агрегацию тромбоцитов, а также рекрутирование и активацию лейкоцитов13. Было также показано, что пониженные уровни NOS активируют ангиотензинпревращающий фермент, который индуцирует окислительный стресс и ускоряет прогрессирование атеросклероза15.
После того, как модель ишемии задних конечностей установлена, необходим мониторинг последующей реперфузии конечностей и терапевтического эффекта любых потенциальных методов лечения. В предложенной модели гангрены мышей степень потери тканей может быть сначала количественно определена с использованием оценки Фабера для оценки грубого внешнего вида стопы (0: нормальная, 1-5: потеря ногтей, где оценка представляет собой количество пораженных ногтей, 6-10: атрофия пальцев, где оценка представляет количество пораженных цифр, 11-12: частичная и полная атрофия стопы, соответственно)9. Количественные измерения перфузии задних конечностей затем обычно производятся с использованием LDPI, который опирается на доплеровские взаимодействия между лазерным светом и эритроцитами для указания перфузии на уровне пикселей в интересующей области (ROI)16. Хотя этот метод является количественным, неинвазивным и идеально подходит для повторных измерений, он не обеспечивает зернистую анатомическую детализацию сосудистой системы задних конечностей16. Другие методы визуализации, такие как микрокомпьютерная томография (микро-КТ), магнитно-резонансная ангиография (МРА) и рентгеновская микроангиография, оказываются либо дорогостоящими, требующими сложных инструментов, либо иным образом технически сложными16. В 2008 году Li et al. описали технику маркировки кровеносных сосудов в сетчатке липофильным карбоцианиновым красителем DiI17. DiI включается в эндотелиальные клетки и путем прямой диффузии окрашивает сосудистые мембранные структуры, такие как ангиогенные ростки и псевдоподальные процессы17,18. Благодаря его прямой доставке в эндотелиальные клетки и высокофлуоресцентной природе красителя, эта процедура обеспечивает интенсивную и длительную маркировку кровеносных сосудов. В 2012 году Boden et al. адаптировали технику перфузии DiI к модели ишемии задних конечностей мышей с помощью полной визуализации собранных мышц-аддукторов бедра после перевязки бедренной артерии19.
Текущий метод обеспечивает относительно недорогой и технически осуществимый способ оценки неоваскуляризации в ответ на ишемию заднего края и генную или клеточную терапию. В дальнейшей адаптации этот протокол описывает применение перфузии DiI для изображения сосудистой системы подножки в высоком разрешении и 3D в мышиной модели гангрены задних конечностей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binder clips (small)</td>
			<td>Office supply store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine (sustained-release)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10148-584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI (1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrocautery device</td>
			<td>Gemini Cautery System</td>
			<td>5917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (100%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji (ImageJ) software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Used version 2.1.0. Free download, no license required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam biopsy pads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-038-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin (neutral buffered, 10%)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FVB mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>001800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Used version 2.1.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (1 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>13-1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Used version 9.6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Pivetal</td>
			<td>NDC 46066-755-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-NAME (N&#969;-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N5751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler perfusion imager</td>
			<td>MoorLDI</td>
			<td>moorLDI2-HIR</td>
			<td>Used moorLDI V5 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-iodine swabstick (10%)</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093901ZZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical instruments</td>
			<td>Roboz Surgical</td>
			<td></td>
			<td>Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture (5-0 absorbable)</td>
			<td>DemeTECH</td>
			<td>G275017B0P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (10 mL)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-way stopcocks</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>19406-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vascular Analysis Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution three-dimensional imaging of the footpad vasculature in a murine hindlimb gangrene model

Заболевание периферических артерий (PAD) является значительной причиной заболеваемости, возникающей в результате хронического воздействия атеросклеротических факторов риска. Пациенты, страдающие от его наиболее тяжелой формы, хронической угрожающей конечностям ишемии (ХМТ), сталкиваются с существенными нарушениями повседневной жизни, включая хроническую боль, ограниченное расстояние ходьбы без боли и незаживающие раны. Доклинические модели были разработаны на различных животных для изучения PAD, но ишемия задних конечностей мыши остается наиболее широко используемой. В этих моделях могут быть значительные различия в реакции на ишемическое оскорбление в зависимости от используемого штамма мыши, а также от места, количества и средств нарушения артериальной артерии. Этот протокол описывает уникальный метод, сочетающий электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота (NOS) для надежного индуцирования гангрены подножки у мышей Friend Virus B (FVB), что напоминает потерю тканей CLTI. В то время как традиционные средства оценки реперфузии, такие как лазерная допплеровская перфузионная визуализация (LDPI), по-прежнему рекомендуются, внутрисердечная перфузия липофильного красителя 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианинперхлорат (DiI) используется для маркировки сосудистой системы. Последующая конфокальная лазерная сканирующая микроскопия с высоким разрешением позволяет проводить трехмерную (3D) реконструкцию сосудистых сетей подножки, что дополняет традиционные средства оценки реперфузии в моделях ишемии задних конечностей.

В этом протоколе подробно описывается надежное средство индуцирования ишемии и потери тканей в подножке мышей с использованием комбинации коагуляции бедренной артерии и вены с введением L-NAME, ингибитором синтазы оксида азота, у восприимчивых мышей FVB. На рисунке 1 подро...

Watch this Scientific Journal Video about High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model at JoVE.com

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Настоящий протокол описывает уникальную, клинически значимую модель заболевания периферических артерий, которая сочетает электрокоагуляцию бедренной артерии и вен с введением ингибитора синтазы оксида азота для индуцирования гангрены задних конечностей у мышей FVB. Внутрисердечная перфузия DiI затем используется для трехмерной визуализации сосудов подножки с высоким разрешением.

Трехмерная визуализация высокого разрешения сосудистой оболочки подножки в модели гангрены заднего скольжения

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

В этом протоколе представлено, как создать модель гангрены подушечки стопы мыши с использованием введения ингибитора массы и коагуляции бедренной артерии. Затем перфузия DiI позволяет визуализировать сосудистую подушечку стопы с высоким разрешением. Эта модель клинически значима и может быть использована для доклинического тестирования лекарств и для изучения ишемии конечностей.Визуализация сосудов с высоким разрешением предлагает технически легкое средство оценки неоваскуляризации. Эта модель гангрены подушечек стопы имеет важное применение в доклинических исследованиях заболеваний периферических артерий и критической ишемии конечностей. Перфузия DiI является полезным инструментом для изучения неоваскуляризации на животных моделях.Демонстрировать процедуру будут Антуан Рибьерас, хирург-резидент, и Юлекси Ортис, научный сотрудник из моей лаборатории. Во-первых, сделайте рабочий раствор DiI, добавив 200 микролитров раствора DiI на 10 миллилитров рабочего раствора разбавителя непосредственно перед использованием. Встряхните вручную, чтобы хорошо перемешать.Соедините два или три трехсторонних запорных крана и иглу бабочки 25 калибра последовательно. Приготовьте 10-миллилитровые шприцы с четырьмя миллилитрами PBS, 10 миллилитрами раствора DiI и 10 миллилитрами 10% нейтрального буферизованного формалина. Подключите шприц с формалином к проксимальному входному отверстию и введите раствор для промывки воздуха из линии.Затем поверните запорный кран, чтобы закрыть порт. Повторите ту же процедуру, соединив шприцы с DiI, а затем PBS со средним и дистальным портами притока соответственно. После эвтаназии поместите животное в положение лежа на спине на абсорбирующей подушечке и закрепите подмышечные и нижние конечности иглами.С помощью ножниц сделайте поперечный разрез, чтобы открыть брюшную полость, затем обнажите и разделите левую и правую диафрагму для доступа к грудной полости. Отрежьте стенку грудной клетки по обе стороны грудины от нижних ребер до первого или второго ребер. Используйте гемостат, чтобы захватить нижний конец грудины и отразить его к голове животного, чтобы обнажить грудную полость.Определите левый желудочек, который выглядит светлее по цвету, чем правый. Осторожно обхватите сердце тупыми щипцами и вставьте иглу бабочки в левый желудочек. Используйте ножницы или иглу 18 калибра, чтобы проколоть правое предсердие, позволяя крови и перфузионным растворам возвращаться в сердце для дренажа.Откройте порт шприца с помощью PBS и вручную вводите от двух до четырех миллилитров со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту в течение одной-двух минут, чтобы вымыть кровь из сосудистой системы. Обеспечьте успешную перфузию, наблюдая кровотечение из правого предсердия. После инъекции закройте порт шприца PBS.Откройте порт шприца с помощью DiI и введите от пяти до 10 миллилитров со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту в течение пяти минут. После инъекции закройте порт шприца DiI и подождите две минуты, чтобы можно было внести краситель перед инъекцией фиксатора. Откройте отверстие шприца формалином и введите от пяти до 10 миллилитров со скоростью от одного до двух миллилитров в минуту в течение пяти минут.После инъекции извлеките иглу из левого желудочка. С помощью тяжелых ножниц вывихните большеберцовую кость на лодыжке, полностью отделив левую и правую ступни от голени. Поместите собранные ножки в 12-луночную пластину с одним-двумя миллилитрами 10%-ного раствора формалина.Оберните тарелку фольгой и храните при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день замените фиксирующий раствор в 12-луночной пластине на один-два миллилитра PBS на лунку. Сделайте продольный разрез скальпелем на подошвенной и спинной части стопы.Затем с помощью зубчатых щипцов и небольшого гемостата аккуратно удалить всю кожу с стопы и пальцев, не повреждая подлежащие мягкие ткани. Чтобы смонтировать ткани, индивидуально поместите ножки между двумя стеклянными предметными стеклами микроскопа с пенопластовой биопсийной прокладкой, сложенной над собой на каждом конце. Используйте два небольших зажима для связующего, чтобы сжать стеклянные слайды вместе на каждом конце.В качестве альтернативы можно вернуть ножную подушечку на пластину из 12 лунок с одним-двумя миллилитрами PBS. После покрытия фольгой храните его при четырех градусах Цельсия, чтобы поддерживать флуоресценцию до одного месяца. Включите систему обработки изображений, запустите программное обеспечение для сбора и используйте объектив с низким увеличением или низкой числовой диафрагмой для захвата изображений.Нажмите кнопку Да в диалоговом окне активации этапа. Активируйте 561-нанометровый лазер на вкладке конфигурации. На главном экране активируйте видимый путь луча, нажав на видимую кнопку.Установите детектор в диапазоне от 570 до 600 нанометров, нажав на соответствующий активный флажок. Выберите значок сканирования плитки на вкладке получения и установите требуемое разрешение. Поместите сухой установленный образец ткани, сжатый между стеклянными предметными стеклами, на ступень микроскопа и поместите ткань в фокус.Перейдите в один из углов образца. В меню сканирования плитки нажмите на кнопку положения метки. Перейдите в противоположный угол и нажмите на кнопку положения отметки еще раз, установив границы сканирования.Чтобы установить глубину Z-стека, нажмите на кнопку live. Перейдите к центру образца и с помощью ручки оси Z прокрутите до нижней части образца. На вкладке приобретения в меню Z-stack нажмите кнопку «Начало».Прокрутите до верхней части образца и нажмите кнопку конца. Нажмите на размер z-шага и установите нужное значение. Затем нажмите «Пуск», чтобы начать получение изображения.На рисунке показаны вариации потери тканей, которые можно ожидать от этой модели через неделю после операции, с оценками FABER, записанными в правом нижнем углу каждого изображения. Изображения реконструктивной микроскопии показывают нормальную анатомию сосудов в нелигированной контрольной подушечке стопы по сравнению с сильно уменьшенной перфузией в подушечке стопы перевязанного заднего скольжения через пять дней после операции. Через 20 дней после операции перфузия в подушечку стопы значительно улучшилась, хотя и не до степени нелигированного контроля.На видео показано, что рендеринг поверхности был создан с использованием функции анимации. Смывайте все пузырьки воздуха из перфузионного узла. Если легкие расширяются и становятся розовыми во время перфузии, игла проникла в правый желудочек и должна быть слегка втянута.Ткани конечностей могут быть использованы для иммуноокрашивания для оценки мышечного некроза, регенерации тканей, плотности сосудов и набора клеток-предшественников и других клеток восстановления тканей. Метод перфузии DiI в этой модели гангрены мышей использовался в исследованиях генной и клеточной терапии. Исследование направлено на улучшение перфузии в конечностях пациентов с критической ишемией конечностей.

Research

JoVE Journal

Medicine

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Человека нейроэндокринной опухоли клеточных линий в качестве трехмерных моделей по изучению прав нейроэндокринные опухоли терапия

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Мышиной модели имплантации стента в сонной артерии по изучению рестеноза

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Трехмерных изображений внутриэпидермальных ноцицептивных нервных волокон в человека биопсию кожи

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Осмотическое доставки лекарств к ишемическим задних конечностей и перфузии сосудистого с Microfil для микро-компьютерной томографии

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

Количественное определение клеток рака молочной железы инвазивности Использование трехмерной (3D) модель

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Three-dimensional Co-culture Model for Tumor-stromal Interaction

Трехмерная Co-культура Модель опухолью стромы взаимодействия

Cancer progression (initiation, growth, invasion and metastasis) occurs through interactions between malignant cells and the surrounding tumor stromal ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Количественная визуализация инфильтрата лейкоцитов в мышиной модели фульминантного миокардита методом микроскопии легких листов

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Электрофизиологические оценки мышиных предсердий с высоким разрешением оптических карт

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Оценка терапевтического ангиогенеза в модели Murine Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...